Nåværende†Nåværende adresse: OX11 0DE, Storbritannia, Diamond Building, Harwell Science and Innovation Park, Dietcote, Oxfordshire, Storbritannia, Diamond Light Source Co., Ltd., Electronic Biological Imaging Center.
Reaksjonssenterets lyshøstingskompleks 1 (RC-LH1) er den sentrale fotosyntetiske komponenten i lilla fototrofiske bakterier. Vi introduserte to kryoelektronmikroskopistrukturer av RC-LH1-komplekset fra Rhodopseudomonas palustris. 2,65 Å-oppløsningsstrukturen til RC-LH114-W-komplekset består av 14 underenhets-LH1-løkker som omgir RC, som er avbrutt av protein W, mens komplekset uten protein-W er fullstendig RC-sammensetning omgitt av RC. Lukket 16 underenhets-LH1-løkke. Sammenligningen av disse strukturene gir innsikt i dynamikken til kinon i RC-LH1-komplekset, inkludert tidligere ubestemte konformasjonsendringer når kinon bindes på RC QB-stedet, samt plasseringen av hjelpekinonbindingssteder, som bidrar til å overføre dem til RC. Den unike strukturen til W-proteinet forhindrer lukking av LH1-løkken, og skaper dermed en kanal for å akselerere kinon/kinolon-utvekslingen.
Energien som gis gjennom fotosyntese kan opprettholde nesten alt liv på jorden, og den har et stort potensial for solbioteknologi. Samtidig som de fremmer global fotosyntese, viser lilla fototrofiske bakterier også ulike energimoduser og metabolske evner. De kan unngå fotosyntese og vokse som heterotrofiske bakterier i mørket, kan fiksere nitrogen og karbondioksid, produsere hydrogen og bryte ned aromatiske forbindelser (1-3). For å gi energi til disse prosessene må lys raskt og effektivt omdannes til kjemisk energi. Denne prosessen starter når det lysfangende antennekomplekset absorberer lys og overfører den fangede energien til reaksjonssenteret (RC), og dermed starter ladningsseparasjon (4–7). Den grunnleggende enheten for fotosyntese i lilla fototrofiske bakterier er sammensatt av type 2 RC, omgitt av lyshøstingskompleks 1 (LH1), som danner RC-LH1-kjernekomplekset. LH1 dannes av en rekke buede αβ-heterodimerer, som hver binder to bakterielle klorofyll (BChl) a-molekyler og ett eller to karotenoider (8-12). Den enkleste LH1-antennen består av 16 eller 17 αβ-heterodimerer som omgir RC (9-13) i en lukket sløyfe, men i andre kjernekomplekser avbryter transmembrane peptider kontinuiteten til den omkringliggende LH1, og fremmer dermed kinol/kinon-diffusjonen mellom RC og cytokrom bc1-komplekset (11, 13-15). Den lilla fototrofiske planten Rhodopseudomonas (Rps.) er en modellorganisme som kan forstå energi- og elektronoverføringen som støtter fotosyntese. Den første krystallstrukturen til Rps. Modellen av palustris RC-LH1-komplekset er RC, omgitt av 15 heterodimeriske LH1-løkker, som er avbrutt av et ukjent protein kalt «Protein W» (14). Protein-W ble senere identifisert som RPA4402, som er et ukarakterisert 10,5 kDa-protein med tre predikerte transmembrane helikser (TMH) (16). Vi foreslår å gi rpa4402-genet som koder for protein W nytt navn til pufW for å være konsistent med nomenklaturen som brukes for gener som koder for RC-L-, M- (pufL, pufM) og LH1α, β (pufA, pufB)-subenheter. Interessant nok er protein-W bare tilstede i omtrent 10 % av RC-LH1, noe som avslører at Rps. palustris produserer to forskjellige RC-LH1-komplekser. Her rapporterer vi høyoppløselige kryo-EM (kryo-EM)-strukturer av to kjernekomplekser, ett med protein W og 14 αβ-heterodimerer, det andre uten protein W og en lukket 16-heterodimer LH1-løkke. Strukturen vår representerer et stort skifte i forståelsen av RC-LH1-komplekset til Rps. palustris, fordi vi har analysert den homogene populasjonen av hver variant og har tilstrekkelig oppløsning til å tydelig tilordne hvert peptid og bundne pigmenter og relaterte lipider og kinoner. Sammenligningen av disse strukturene viser at de tre TMH-proteinene-W som ikke er funnet i noe annet RC-LH1-kompleks så langt, genererer en kinonkanal for å akselerere kinon/kinolon-utvekslingen. En rekke konserverte lipid- og kinonbindingssteder er identifisert, og vi har avdekket en ny konformasjonsendring etter kombinasjonen av kinon og RC, som kan være egnet for fotosystem II (PSII) RC hos oksygenerte fototrofiske organismer. Våre funn gir ny innsikt i kinetikken til kinon/kinolon-binding og -utveksling i RC-LH1-kjernekomplekset hos lilla fototrofiske bakterier.
For å legge til rette for en detaljert studie av de to kompleksene som finnes i Rps. palustris, isolerer vi hver RC-LH1 ved hjelp av biokjemiske metoder. Det protein W-defekte komplekset (heretter referert til som ΔpufW) ble renset fra stammen som mangler pufW-genet (16), og bare ett RC-LH1-kompleks kan produseres. Det protein W-holdige komplekset produseres av en stamme. Protein W i denne stammen er modifisert med en 10x His-tagg ved C-terminalen, slik at det protein W-holdige komplekset effektivt kan kombineres med det meste av det manglende protein W ved å immobilisere metall. Komplekset separeres effektivt (16) med affinitetskromatografi (IMAC).
Som vist i figur 1 inneholder begge kompleksene en RC med tre underenheter (RC-L, RC-M og RC-H) omgitt av en LH1-antenne. 2,80-A-strukturen til komplekset som mangler protein-W viser 16 αβ-heterodimerer, som danner en lukket LH1-løkke som fullstendig omgir RC, heretter referert til som RC-LH116-komplekset. 2,65 Å-strukturen til det protein-W-holdige komplekset har en 14-heterodimer LH1 avbrutt av protein-W, heretter referert til som RC-LH114-W.
(A og B) Overflaterepresentasjon av forbindelsen. (C og D) Bundne pigmenter uttrykt i staver. (E og F) Kompleksene observert fra den cytoplasmatiske overflaten har peptidene og LH1-underenhetene representert i tegneseriene, og er nummerert med klokken fra protein-W-gapet [i samsvar med Rba-nummerering. sphaeroides-kompleks (13)]. For LH1-α er fargen på proteinunderenheten gul; for LH1-β er fargen på proteinunderenheten blå; for protein-W er proteinet rødt; for RC-H er det cyan; for RC-L er det oransje; for RC-M er det magenta. Kofaktorer er representert av staver, grønt representerer BChl- og BPha-molekyler, lilla representerer karotenoider, og gult representerer UQ10-molekyler. (G og H) Forstørret visning av protein-W-gapet i den ekvivalente regionen av RC-LH114-W-komplekset (G) og RC-LH116-komplekset (H). Kofaktorer vises i form av romfylling, chelatert kinon vises i blått. Protein-W-gapet er uthevet med en blå stiplet linje i (G), og de små hullene der kinon/kinolol diffunderer på LH116-ringen er uthevet med en svart stiplet linje i (H).
Figur 1 (A og B) viser RC omgitt av åpne eller lukkede grupper av LH1αβ heterodimerer, som hver binder to BChl og ett karotenoid (figur 1, C og D). Tidligere studier har vist at Rps er LH1-komplekset. I den biosyntetiske veien til spirulina xanthin inneholder disse artene blandede populasjoner av karotenoider (17). Imidlertid er spiropyrroxanthin det dominerende karotenoidet, og tettheten er tilfredsstillende. Derfor valgte vi å modellere spiroxanthin på alle LH1-bindingssteder. Alfa- og beta-polypeptidene er enkle TMH-er med korte ytre membranregioner (figur 1, A, B, E og F). Selv om tettheten på 17 rester ved C-terminalen ikke ble observert, ble alfa-polypeptidet spaltet fra Met1 til Ala46 i begge kompleksene. β-polypeptidet ble redusert fra Gly4 til Tyr52 i RC-LH116, og fra Ser5 til Tyr52 i RC-LH114-W. Ingen tetthet av 3 eller 4 N-terminale eller 13 C-terminale rester ble observert (figur S1). Massespektrometrianalyse av det blandede RC-LH1-komplekset fremstilt fra villtypestammen viste at den manglende regionen var et resultat av heterolog spalting av disse peptidene (figur S1 og S2). N-terminal formylering av α-Met1 ble også observert (f). Analysen viste at α-peptidet består av rester fMet1 til Asp42/Ala46/Ala47/Ala50, og β-peptidet består av rester Ser2 til Ala53, noe som stemmer godt overens med lavtemperatur-EM-tetthetskartet.
Koordinering av α-His29 og β-His36 gjør at BChl-ene står ansikt til ansikt; hver αβ-heterodimer setter seg sammen med naboene sine for å danne en åpen sløyfe (RC-LH114-W) eller en lukket sløyfe (RC-LH116) rundt RC-en. Den eksitonkoblede pigmentmatrisen (Figur 1, C og D). Sammenlignet med 877 nm-båndet til RC-LH114-W, er 880 nm-absorpsjonsrødforskyvningen til RC-LH116 3 nm (Figur 2A). Imidlertid er det sirkulære dikroismespekteret nesten det samme (Figur 2B), noe som indikerer at selv om det er en klar forskjell mellom åpne og lukkede sløyfer, er det lokale miljøet til BChl-ene svært likt. Absorpsjonsrødforskyvningen kan være et resultat av redusert termisk bevegelse og økt stabilitet på den lukkede sløyfen (18, 19), endringen i pigmentkobling forårsaket av den lukkede sløyfen (20, 21), eller en kombinasjon av disse to effektene (11).
(A) Ultrafiolett/synlig/nær-infrarødt absorpsjonsspektrum, hvis topper er merket med sine tilsvarende pigmenter og normalisert til BPh-toppen ved 775 nm. (B) Sirkulært dikroismespektrum normalisert til BChl-absorbans ved 805 nm. (C og D) Utvalgte ΔA-spektre fra de tidsoppløste absorpsjonsspektrene til RC-LH114-W-komplekset (C) og RC-LH116-komplekset (D). For bedre sammenligning er alle spektre normalisert til ∆A av −A ved 0,2 ps. (E) Hastigheten for cytokrom c2-oksidasjon etter bestråling i nærvær av forskjellige konsentrasjoner av UQ2 (se figur S8 for rådata). (F) I celler dyrket under lys med lav, middels eller høy intensitet (henholdsvis 10, 30 eller 300 μMm-2 s-1), protein W- og RC-L-subenhetene i det rensede komplekset og forholdet mellom separerte membraner. Bestem proteinnivået ved SDS-polyakrylamidgelelektroforese og immunoassay (se figur S9 for rådata). Bestem forholdet i forhold til det rensede RC-LH114-W-komplekset. Det støkiometriske forholdet mellom RC-L og protein-W i komplekset er 1:1.
BChl-ene i posisjon 1 i den deformerte αβ14-løkken til RC-LH114-W (figur 1, A, C og E) er nærmere RC-primærdonoren (P) med 6,8 ​​Å enn de tilsvarende BChl-ene i RC-LH116 (figur 1, B, D og F, og figur S3); den transiente absorpsjonskinetikken til de to kompleksene viser imidlertid at for RC-LH114-W og RC-LH116 er eksitasjonsenergioverføringstidskonstantene fra LH1 til RC 40 ± 4 og 44 ± 3 ps (figur 2, C og D, figur S4 og tabell S2). Det er heller ingen signifikant forskjell i elektronisk overføring innenfor RC (figur S5 og relatert tilleggstekst). Vi mistenker at den nære samsvaren mellom energioverføringstiden mellom LH1 og RC-P skyldes den lignende avstanden, vinkelen og potensielle energien til de fleste BChl i de to LH1-løkkene. Det ser ut til at det å utforske LH1-energimønsteret for å nå minimumsavstanden ikke er raskere enn direkte energioverføring fra suboptimale steder til RC. Den åpne LH1-sløyfen i RC-LH114-W kan også gjennomgå ubetydelig termisk bevegelse under lave temperaturforhold for strukturell analyse, og det er en lengre αβ14-ringkonformasjon ved romtemperatur fra pigmenteringsavstanden til βBChls ved posisjonen til RC 1.
RC-LH116-komplekset inneholder 32 BChl-er og 16 karotenoider, og dets generelle arrangement er det samme som det som oppnås fra Thermochromatium (Tch.) pidpidum [Protein Data Bank (PDB) ID 5Y5S] (9), Thiorhodovibrio (Trv.) 970-stamme (PDB ID 7C9R) (12) og grønnalger (Blc.viridis) (PDB ID 6ET5) (10). Etter justering ble det bare observert små avvik i posisjonene til αβ-heterodimerer, spesielt 1-5, 15 og 16 (figur S6). Tilstedeværelsen av protein-W har en betydelig innvirkning på strukturen til LH1. De tre TMH-ene er forbundet med korte løkker, med N-terminalen på lumensiden av komplekset og C-terminalen på den cytoplasmatiske siden (figur 1A og 3, A til D). Protein-W er i stor grad hydrofobt (figur 3B), og TMH2 og TMH3 samhandler med LH1αβ-14 for å danne en transmembranoverflate (figur 3, B og E til G). Grensesnittet består hovedsakelig av Phe-, Leu- og Val-rester i transmembranregionen. Disse restene er stablet med hydrofobe aminosyrer og αβ-14-pigmenter. Noen polare rester bidrar også til interaksjonen, inkludert hydrogenbindingen mellom W-Thr68 og β-Trp42 på overflaten av det komplekse hulrommet (figur 3, F og G). På overflaten av cytoplasmaet ligger Gln34 ved siden av ketogruppen til αβ-14-karotenoider. I tillegg ble n-dodecyl β-d-maltosid (β-DDM)-molekylet oppløst, og den hydrofobe halen strakte seg til grenseflaten mellom protein-W og αβ-14, og lipidhalen kan være lokalisert i kroppen. Vi la også merke til at de C-terminale oppløsningsregionene til protein W og RCH er svært nær hverandre, men ikke innenfor rammen av å danne spesifikke interaksjoner (figur 1, A og E). Det kan imidlertid være interaksjoner i de uløste C-terminale aminosyrene til disse to proteinene, noe som kan gi en mekanisme for rekruttering av protein-W under sammensetningen av RC-LH114-W-komplekset.
(A) Protein-W, som vender mot grenseflaten med LH1αβ14 i tegneserieform, har en stavformet sidekjede (rød), vist i en del av det elektrostatiske potensialdiagrammet (gjennomsiktig grå overflate med et konturnivå på 0,13). (B) Protein-W representert av en hydrofob farget overflate. Polare og ladede områder vises i cyan, hydrofobe områder vises i hvitt, og sterkt hydrofobe områder vises i oransje. (C og D) Protein-W representert i tegneserien, orienteringen er den samme som i (A) (C), og rotert med 180° (D). I henhold til posisjonen i sekvensen, antar de skillebare restene et regnbuefargeskjema, hvor N-terminalen er blå og C-terminalen er rød. (E) Protein-W i samme visning som i (A), og restene ved grenseflaten mellom protein-W:LH1 er representert av stenger med påsatte merker. (F) Protein-W er rotert 90° i forhold til (E) og LH1αβ14 i tegneserierepresentasjonen, og i forhold til grenseflaterestene i søylerepresentasjonen. De overhengende restene fra beta-polypeptidet er merket. Kofaktoren er vist som en søyle som samsvarer med fargen i figur 1, den dekomponerte β-DDM er vist i grått, og oksygenet er vist i rødt. (G) Visningen i (F) er rotert 180°, med de fremtredende restene av det merkede alfa-polypeptidet.
Protein-W erstatter en αβ-heterodimer (den 15. i figur 1F), og forhindrer dermed løkkelukking og vipper de tre første αβ-heterodimerene. Det ble observert at den maksimale helningsvinkelen til den første αβ-1-heterodimeren i forhold til filmnormalen var 25° til 29° (figur 1, A og E), som ble dannet av 2° til 8°-helningen til αβ-1 i RC A sharp contrast-LH116 (figur 1, B og F). Den andre og tredje heterodimeren er helet henholdsvis 12° til 22° og 5° til 10°. På grunn av den steriske hindringen til RC inkluderer ikke helningen til αβ-1 det andre paret av αβ (som tilsvarer den 16. αβ i figur 1F), og danner dermed et tydelig gap i LH1-ringen (figur 1, A og E). På grunn av mangelen på to αβ-heterodimerer, ledsaget av tap av fire BChl og to karotenoider, binder ingen av karotenoidene seg til den vridde αβ-1-subenheten, noe som resulterer i en LH114-W-ring som inneholder 13 vegetariske karotenoider og 28 BChl. De lokale oppløsningsestimatene for de to kompleksene i αβ1- til 7-regionene er lavere enn for resten av LH1-løkken, noe som kan gjenspeile den iboende plastisiteten til LH1-subenheten ved siden av RC QB-stedet (figur 4).
Bildene av RC-LH114-W (A og B) og RC-LH116 (C og D) er vist fra samme toppvisning/sidevisning (A og B) (A og C) og hulromsflate som i figur 1 (B og D). De fargede tastene vises til høyre.
Det eneste andre karakteristiske kjernekomplekset med et støkiometrisk forhold på 1:14 er Rhodococcus sphaeroides (Rba.) RC-LH1-PufX-dimeren (13). Protein W og PufX har imidlertid ingen åpenbar homologi, og har en betydelig innvirkning på deres respektive LH1-strukturer. PufX er en enkelt TMH med et N-terminalt cytoplasmatisk domene som interagerer med den cytoplasmatiske siden av RC-H-underenheten (13) i en posisjon som tilsvarer Rps. palustris LH116αβ-16. PufX skaper en kanal for kinon/kinolon-utvekslingen mellom RC-LH1 og cytokrom bcl-komplekset og er tilstede i alle Rba. sphaeroides-kjernekomplekser (13). Selv om monomer-monomer-grensesnittet er i Rba. Sphaeroides RC-LH1-PufX-dimeren er lokalisert ved bindingsposisjonen til protein W i RC-LH114-W, og gapet indusert av PufX og protein-W er i en ekvivalent posisjon (figur S7A). Gapet i RC-LH114-W er også på linje med den hypotetiske kinonkanalen (8) til Pseudomonas rosea LH1, som dannes av peptider som ikke er relatert til protein W eller PufX (figur S7B). I tillegg er kinonkanalen i Blc. Den smaragdgrønne LH1 dannet ved å ekskludere én γ-underenhet (7) lokalisert i en lignende posisjon (figur S7C). Selv om det er mediert av forskjellige proteiner, ser det ut til at tilstedeværelsen av disse kinon/kinolol-kanalene i en felles posisjon i RC-LH1-komplekset er et eksempel på konvergent evolusjon, noe som indikerer at gapet skapt av protein W kan fungere som en kinonkanal.
Gapet i LH114-W-løkken tillater dannelsen av et kontinuerlig membranområde mellom det indre rommet til RC-LH114-W-komplekset og hovedmembranen (figur 1G), i stedet for å forbinde de to domenene gjennom en proteinpore som i proteiner. RC-LH116-komplekset ligner på et lukket Tch.-nålelignende kompleks (22) (figur 1H). Siden diffusjonen av kinon gjennom membranen er raskere enn diffusjonen gjennom den smale proteinkanalen, kan den åpne LH114-W-løkken tillate raskere RC-omsetning enn den lukkede LH116-løkken, og diffusjonen av kinon inn i RC kan være mer begrenset. For å teste om protein W påvirker omdannelsen av kinoner gjennom RC, utførte vi en cytokromoksidasjonsanalyse på en viss konsentrasjon av ubikinon 2 (UQ2) (en analog av naturlig UQ10 med en kortere isoprenhale) (figur 2E). Selv om tilstedeværelsen av chelatert kinon hindrer nøyaktig bestemmelse av den tilsynelatende Michaelis-konstanten (RC-LH114-W og RC-LH116 er egnet for henholdsvis 0,2 ± 0,1 μM og 0,5 ± 0,2 μM), er den maksimale raten for RC-LH114-W (4,6 ± 0,2 e-RC-1 s-1) 28 ± 5 % større enn RC-LH116 (3,6 ± 0,1 e-RC-1 s-1).
Vi estimerte opprinnelig at protein-W er tilstede i omtrent 10 % av kjernekomplekset (16); her er beleggsratene for vekstceller med lite lys, middels lys og mye lys henholdsvis 15 ± 0,6 %, 11 ± 1 % og 0,9 ± 0,5 % (figur 2F). Kvantitativ sammenligning av massespektrometri viste at tilsetning av histidinmerke ikke reduserte den relative mengden protein-W sammenlignet med villtypestammer (P = 0,59), så disse nivåene er ikke en artefakt av modifisert protein-W (figur S10). Imidlertid kan denne lave beleggsraten av protein-W i RC-LH1-komplekset tillate at noen RC-er vender med en akselerert hastighet, og dermed reduserer den langsommere kinon/kinolon-utvekslingen i RC-LH116-komplekset. Vi la merke til at beleggsraten med høyt lys er inkonsistent med de nylige transkriptomikkdataene, noe som indikerer at pufW-genuttrykk øker under sterkt lys (figur S11) (23). Forskjellen mellom pufW-transkripsjon og protein-W-inkorporering i RC-LH1-komplekset er forvirrende og kan gjenspeile den komplekse reguleringen av proteinet.
I RC-LH114-W er 6 kardiolipin (CDL), 7 fosfatidylkolin (POPC), 1 fosfatidylglyserol (POPG) og 29 β-DDM-molekyler allokert og modellert i den: 6 CDL-er, 24 POPC-er, 2 POPG-er og 12 βDDM-er. RC-LH116 (figur 5, A og B). I disse to strukturene er CDL nesten lokalisert på den cytoplasmatiske siden av komplekset, mens POPC, POPG og β-DDM hovedsakelig er lokalisert på den luminale siden. To lipid- og detergentmolekyler ble isolert i αβ-1 til αβ-6-regionen av RC-LH114-W-komplekset (figur 5A), og fem ble isolert i den ekvivalente regionen av RC-LH116 (figur 5B). Flere lipider ble funnet på den andre siden av komplekset, hovedsakelig CDL, akkumulert mellom RC og αβ-7 til αβ-13 (figur 5, A og B). Andre strukturelt oppløste lipider og detergenter er plassert utenfor LH1-ringen, og godt oppløste acylkjeder strekker seg mellom LH1-subenheter, foreløpig betegnet som β-DDM i RC-LH114-W, og definert som β-DDM i RC En blanding av β-DDM og POPC-LH116. De lignende posisjonene til chelaterende lipider og detergenter i vår struktur indikerer at de er fysiologisk relevante bindingssteder (figur S12A). Posisjonene til ekvivalente molekyler i Tch har også god konsistens. Gentle og Trv. Stamme 970 RC-LH1s (figur S12, B til E) (9, 12) og hydrogenbindingsrestene i lipidhodegruppen viste ganske god konservering i sekvensjusteringen (figur S13), noe som indikerer at konserverte CDL som binder seg til RC (24), disse stedene kan være konservert i RC-LH1-komplekset.
(A og B) RC-LH114-W (A) og RC-LH116 (B) peptider er representert med tegneserier, og pigmentene er representert med staver, ved bruk av fargeskjemaet i figur 1. Lipider er vist i rødt, og detergenter er vist i grått. UQ bundet til RC QA- og QB-steder er gult, mens isolert UQ er blått. (C og D) Samme visninger som (A) og (B), med lipider utelatt. (E til G) Forstørret visning av Q1(E), Q2(F) og Q3(G) fra RC-LH116, med sidekjeder som påvirker hverandre. Hydrogenbindingene er vist som svarte stiplede linjer.
I RC-LH116 dekomponeres både RC QA og QB UQ, som deltar i elektronoverføring i ladningsseparasjonsprosessen, i sine bindingssteder. I RC-LH114-W er imidlertid ikke QB-kinon oppløst, og det vil bli diskutert i detalj nedenfor. I tillegg til QA- og QB-kinoner er to chelaterte UQ-molekyler (plassert mellom RC- og LH1-ringene) allokert i RC-LH114-W-strukturen i henhold til deres godt oppløste hodegrupper (plassert i henholdsvis Q1 og Q2). Figur 5C). To isoprenenheter er tilordnet Q1, og tetthetskartet løser opp de komplette 10 isoprenhalene til Q2. I strukturen til RC-LH116 ble tre chelaterte UQ10-molekyler (Q1 til Q3, figur 5D) oppløst, og alle molekylene har en tydelig tetthet gjennom hele halen (figur 5, D til G). I de to strukturene har posisjonene til kinonhodegruppene i Q1 og Q2 utmerket konsistens (figur S12F), og de interagerer bare med RC. Q1 er lokalisert ved inngangen til W-gapet i RC-LH114-W (figur 1G og 5, C, D og E), og Q2 er lokalisert nær QB-bindingsstedet (figur 5, C, D) og F). De konserverte L-Trp143- og L-Trp269-restene er svært nær Q1 og Q2 og gir potensielle π-stablingsinteraksjoner (figur 5, E og F, og figur S12). L-Gln88, 3,0 Å fra det distale oksygenet i Q1, gir en sterk hydrogenbinding (figur 5E); denne resten er konservert i alle RC-er unntatt det fjerneste forholdet (figur S13). L-Ser91 er konservativt substituert for Thr i de fleste andre RC-er (figur S13), er 3,8 Ångstrøm fra metyloksygenet i Q1, og kan gi svake hydrogenbindinger (figur 5E). Q3 ser ikke ut til å ha en spesifikk interaksjon, men er lokalisert i den hydrofobe regionen mellom RC-M-underenheten og LH1-α-underenheten 5 til 6 (figur 5, D og G). Q1, Q2 og Q3 eller nærliggende chelaterte kinoner har også blitt separert i Tch. Gentle, Trv. Stamme 970 og Blc. Irisstrukturen (9, 10, 12) peker på et konservert hjelpekinonbindingssted i RC-LH1-komplekset (figur S12G). De fem dekomponerte UQ-ene i RC-LH116 stemmer godt overens med 5,8 ± 0,7 for hvert kompleks bestemt ved høytrykksvæskekromatografi (HPLC), mens de tre dekomponerte UQ-ene i RC-LH114-W er lavere enn. Den målte verdien på 6,2 ± 0,3 (fig. S14) indikerer at det finnes uløste UQ-molekyler i strukturen.
De pseudosymmetriske L- og M-polypeptidene inneholder hver fem TMH-er og danner en heterodimer som kombinerer én BChl-dimer, to BChl-monomerer, to bakteriofag (BPh)-monomerer og én ikke-hemjern- og én eller to UQ10-molekyler. Gjennom tilstedeværelsen av hydrogenbindinger på den terminale ketongruppen og dens kjente akkumulering i Rps, blir karotenoider inkorporert i M-underenheten, som kalles cis-3,4-dehydroorhodopin. Arter (25). Det ytre membrandomenet til RC-H er forankret til membranen av en enkelt TMH. Den overordnede RC-strukturen ligner på de tre underenhetene RC hos beslektede arter (som Rba). sphaeroides (PDB ID: 3I4D). Makrosyklusene til BChl og BPh, karotenoidryggraden og ikke-hemjern overlapper innenfor oppløsningsområdet til disse strukturene, i likhet med UQ10-hodegruppen ved QA-stedet og QB-kinonet ved RC-LH116 (figur S15).
Tilgjengeligheten av to RC-strukturer med forskjellige QB-beleggsrater gir en ny mulighet til å undersøke de konsistente konformasjonsendringene som følger med QB-kinonbinding. I RC-LH116-komplekset er QB-kinon lokalisert i den fullstendig bundne "proksimale" posisjonen (26), men separasjonen av RC-LH114-W har ikke QB-kinon. Det finnes ikke noe QB-kinon i RC-LH114-W, noe som er overraskende fordi komplekset er aktivt, mer enn RC-LH116-komplekset med strukturelt oppløst QB-kinon. Selv om de to LH1-ringene chelaterer omtrent seks kinoner, er fem strukturelt oppløst i den lukkede RC-LH116-ringen, mens bare tre er strukturelt begrenset i den åpne RC-LH114-W-ringen. Denne økte strukturelle forstyrrelsen kan gjenspeile den raskere utskiftingen av RC-LH114-W QB-steder, raskere kinonkinetikk i komplekset og økt sannsynlighet for å krysse LH1-løkken. Vi antyder at mangelen på UQ i RC QB-stedet til RC-LH114-W kan være et resultat av et mer komplekst og mer aktivt kompleks, og QB-stedet til RC-LH114-W har blitt umiddelbart frosset i UQ-omsetningen. Det spesifikke stadiet (inngangen til QB-stedet har blitt stengt) gjenspeiler konformasjonen av denne aktiviteten.
Uten QB vil den medfølgende rotasjonen av L-Phe217 til en posisjon som er inkompatibel med UQ10-binding, fordi det vil forårsake en romlig kollisjon med den første isoprenenheten i halen (figur 6A). I ​​tillegg er de åpenbare hovedkonformasjonsendringene tydelige, spesielt helix de (kort helix i løkken mellom TMH D og E) der L-Phe217 er forskjøvet til QB-bindingslommen og rotasjonen av L-Tyr223 (figur 6A) for å bryte hydrogenbindingen med M-Asp45-rammeverket og lukke inngangen til QB-bindingsstedet (figur 6B). Helix de dreier ved basen, Cα i L-Ser209 er forskjøvet med 0,33 Å, mens L-Val221Cα er forskjøvet med 3,52 Å. Det er ingen observerbare endringer i TMH D og E, som er overliggende i begge strukturene (figur 6A). Så vidt vi vet er dette den første strukturen i den naturlige RC som lukker QB-stedet. En sammenligning med den komplette (QB-bundne) strukturen viser at før kinonet reduseres, kreves det en konformasjonsendring for at det skal gå inn i kinonet. L-Phe217 roterer for å danne en π-stablingsinteraksjon med kinonhodegruppen, og heliksen forskyves utover, slik at skjelettet til L-Gly222 og sidekjeden til L-Tyr223 danner et hydrogenbindingsnettverk med en stabil hydrogenbindingsstruktur (figur 6, A og C).
(A) Overlappende tegneserie av hologram (L-kjede, oransje/M-kjede, magenta) og apo (grå) struktur, der nøkkelrestene vises i form av en stavlignende representasjon. UQ10 er representert med en gul søyle. Den stiplede linjen indikerer hydrogenbindingene som dannes i hele strukturen. (B og C) Overflaterepresentasjonen av apolipoproteinet og hele ringstrukturen, som fremhever sidekjede-oksygenet til L-Phe217 i blått og L-Tyr223 i rødt, henholdsvis. L-underenheten er oransje; M- og H-underenhetene er ikke farget. (D og E) Apolipoprotein (D) og hele (E) RC QB-steder [fargelegg med henholdsvis (A)] og Thermophilus thermophilus PSII (grønn, blå med plastkinon; PDB ID: 3WU2) Juster (58).
Uventet nok, selv om flere strukturer av QB-defekte RC-er uten LH1 er tilgjengelige, har de konformasjonsendringene som ble observert i denne studien ikke blitt rapportert tidligere. Disse inkluderer QB-uttømmingsstrukturen fra Blc. viridis (PDB ID: 3PRC) (27), Tch. tepidum (PDB ID: 1EYS) (28) og Rba. sphaeroides (PDB ID: 1OGV) (29), som alle er nesten de samme som deres overordnede QB-struktur. Nøye undersøkelse av 3PRC viste at LDAO (Lauryl Dimethyl Amine Oxide) detergentmolekyler binder seg ved inngangen til QB-posisjonen, noe som kan forhindre omorganisering til en lukket konformasjon. Selv om LDAO ikke dekomponerer i samme posisjon i 1EYS eller 1OGV, fremstilles disse RC-ene med samme detergent og kan derfor produsere samme effekt. Krystallstrukturen til Rba. Sphaeroides RC samkrystallisert med cytokrom c2 (PDB ID: 1L9B) ser også ut til å ha et lukket QB-sted. I dette tilfellet antar imidlertid den N-terminale regionen til RC-M-polypeptidet (som samhandler med QB-bindingsstedet gjennom H-bindingen til Tyr-resten på Q-heliksen) en unaturlig konformasjon, og QB-konformasjonsendringen er ikke videre utforsket (30). Det som er betryggende er at vi ikke har sett denne typen deformasjon av M-polypeptidet i RC-LH114-W-strukturen, som er nesten den samme som den N-terminale regionen til RC-LH116 RC. Det bør også bemerkes at etter utryddelse av den detergentbaserte LH1-antennen ble apolipoprotein-RC-ene i PDB oppløst, noe som eliminerte de interne kinonbassengene og lipidene i gapet mellom RC og den indre overflaten av den omkringliggende LH1-ringen (31, 32). RC forblir funksjonell fordi den beholder alle kofaktorer, bortsett fra det nedbrytbare QB-kinonet, som er mindre stabilt og ofte går tapt under fremstillingsprosessen (33). I tillegg er det kjent at fjerning av LH1 og naturlige sykliske lipider fra RC kan ha en innvirkning på funksjoner, slik som den forkortede levetiden til den ladningsseparerte P+QB-tilstanden (31, 34, 35). Derfor spekulerer vi i at eksistensen av den lokale LH1-ringen som omgir RC kan opprettholde det "lukkede" QB-stedet, og dermed bevare det lokale miljøet nær QB.
Selv om apolipoprotein (uten QB-kinon) og den komplette strukturen bare representerer to øyeblikksbilder av omsetningen av QB-stedet, snarere enn en serie hendelser, finnes det indikasjoner på at bindingen kan styres for å forhindre rebinding av hydrokinon for å hemme substrathemming. Interaksjonen mellom kinolol og kinon nær QB-stedet til apolipoprotein kan være forskjellig, noe som fører til at det avvises av RC. Det har lenge vært foreslått at konformasjonsendringer spiller en rolle i binding og reduksjon av kinoner. Evnen til frosne RC-er til å redusere kinoner etter mørketilpasning er svekket (36); Røntgenkrystallografi viser at denne skaden skyldes at QB-kinoner er fanget i en "distal" konformasjon omtrent 4,5 Å fra den aktive proksimale posisjonen (26, 37). Vi foreslår at denne distale bindingskonformasjonen er et øyeblikksbilde av mellomtilstanden mellom apolipoprotein og den komplette ringstrukturen, som følger den første interaksjonen med kinon og åpningen av QB-stedet.
Type II RC som finnes i PSII-komplekset til visse fototrofiske bakterier og cyanobakterier, alger og planter har strukturell og funksjonell konservering (38). Den strukturelle justeringen vist i figur 6 (D og E) understreker likheten mellom PSII RC-er og QB-stedet til det bakterielle RC-komplekset. Denne sammenligningen har lenge vært en modell for å studere de nært beslektede systemene for kinonbinding og -reduksjon. Tidligere publikasjoner antydet at konformasjonsendringer er ledsaget av PSII-reduksjon av kinoner (39, 40). Med tanke på den evolusjonære konserveringen av RC, kan denne tidligere uobserverte bindingsmekanismen derfor også være anvendelig på QB-stedet til PSII RC i oksygenerte fototrofiske planter.
Rps ΔpufW (umerket pufW-delesjon) og PufW-His (C-terminal 10x His-merket protein-W uttrykt fra det naturlige pufW-locuset) stammer. palustris CGA009 ble beskrevet i vårt tidligere arbeid (16). Disse stammene og den isogene villtype-forelderen ble gjenvunnet fra fryseren ved å stryke et lite antall celler på PYE (hver 5 g liter-1) (lagret i LB ved -80 °C, inneholdende 50 % (w/v) glyserol) protein, gjærekstrakt og succinat) agar [1,5 % (w/v)] plate. Platen ble inkubert over natten i mørket ved romtemperatur under anaerobe forhold, og deretter belyst med hvitt lys (~50 μmolm-2 s-1) levert av OSRAM 116-W halogenpærer (RS Components, Storbritannia) i 3 til 5 dager inntil en enkelt koloni dukket opp. En enkelt koloni ble brukt til å inokulere 10 ml M22+ medium (41) tilsatt 0,1 % (w/v) kasaminosyrer (heretter referert til som M22). Kulturen ble dyrket under lave oksygenforhold i mørket ved 34 °C med risting ved 180 rpm i 48 timer, og deretter ble 70 ml av kulturen inokulert under de samme forholdene i 24 timer. En semi-aerob kultur med et volum på 1 ml brukes til å inokulere 30 ml M22-medium i en 30 ml universal skrukork gjennomsiktig glassflaske og bestrålt med omrøring (~50 μmolm-2 s-1) i 48 timer med en steril magnetisk rørepinne. Deretter ble 30 ml av kulturen inokulert med omtrent 1 liter kultur under de samme forholdene, som deretter ble brukt til å inokulere omtrent 9 liter kultur belyst ved ~200 μmolm-2 s-1 i 72 timer. Cellene ble høstet ved sentrifugering ved 7132 RCF i 30 minutter, resuspendert i ~10 ml 20 mM tris-HCl (pH 8,0) og lagret ved -20 °C inntil de var nødvendige.
Etter tining, tilsett noen krystaller av deoksyribonuklease I (Merck, Storbritannia), lysozym (Merck, Storbritannia) og to Roche holoenzymproteasehemmertabletter (Merck, Storbritannia) til de resuspenderte cellene. I en 20 000 psi fransk trykkcelle (Aminco, USA) ble cellene ødelagt 8 til 12 ganger. Etter å ha fjernet ubrutte celler og uoppløselig avfall ved sentrifugering ved 18 500 RCF i 15 minutter ved 4 °C, ble membranen utfelt fra det pigmenterte lysatet ved sentrifugering ved 113 000 RCF i 2 timer ved 43 000 °C. Kast den løselige fraksjonen og resuspender den fargede membranen i 100 til 200 ml 20 mM tris-HCl (pH 8,0) og homogeniser til det ikke er noen synlige aggregater. Den suspenderte membranen ble inkubert i 20 mM tris-HCl (pH 8,0) (Anatrace, USA) som inneholdt 2 % (w/v) β-DDM i 1 time i mørket ved 4 °C under forsiktig omrøring. Sentrifuger deretter ved 70 °C for å løse opp 150 000 RCF ved 4 °C i 1 time for å fjerne gjenværende uløselige stoffer.
Den oppløselige membranen fra ΔpufW-stammen ble påført en 50 ml DEAE Sepharose ionebytterkolonne med tre kolonnevolumer (CV) bindingsbuffer [20 mM tris-HCl (pH 8,0) som inneholdt 0,03 % (w/v) β-DDM]. Vask kolonnen med to CV-bindingsbuffere, og vask deretter kolonnen med to bindingsbuffere som inneholdt 50 mM NaCl. RC-LH116-komplekset ble eluert med en lineær gradient på 150 til 300 mM NaCl (i bindingsbuffer) på 1,75 CV, og det gjenværende bindingskomplekset ble eluert med en bindingsbuffer som inneholdt 300 mM NaCl på 0,5 CV. Samle absorpsjonsspekteret mellom 250 og 1000 nm, behold fraksjonen med absorbansforhold (A880/A280) større enn 1 ved 880 til 280 nm, fortynn den to ganger i bindingsbufferen, og bruk samme prosedyre igjen på DEAE-kolonnen ved rensing. Fortynn fraksjonene med A880/A280-forhold høyere enn 1,7 og A880/A805-forhold høyere enn 3,0, utfør den tredje runden med ionebytte, og behold fraksjoner med A880/A280-forhold høyere enn 2,2 og A880/A805-forhold høyere enn 5,0. Det delvis rensede komplekset ble konsentrert til ~2 ml i et Amicon 100 000 molekylvektsgrensepunkt (MWCO) sentrifugalfilter (Merck, Storbritannia), og lastet på en Superdex 200 16/600 størrelseseksklusjonskolonne (GE Healthcare, USA) som inneholdt 200 mM NaCl-buffer, og deretter eluert i samme buffer ved 1,5 CV. Samle inn absorpsjonsspektrene til størrelseseksklusjonsfraksjonen, og konsentrer absorpsjonsspektrene med A880/A280-forhold over 2,4 og A880/A805-forhold over 5,8 til 100 A880, og bruk dem umiddelbart til klargjøring eller lagring av kryo-TEM-gitter. Oppbevares ved -80 °C inntil behov.
Den oppløselige membranen fra PufW-His-stammen ble påført en 20 ml HisPrep FF Ni-NTA Sepharose-kolonne (20 mM tris-HCl (pH 8,0) inneholdende 200 mM NaCl og 0,03 % (w/w)) i IMAC-buffer (GE Healthcare). (v) β-DDM]. Kolonnen ble vasket med fem CV-er IMAC-buffer, og deretter med fem CV-er IMAC-buffer inneholdende 10 mM histidin. Kjernekomplekset ble eluert fra kolonnen med fem IMAC-buffere inneholdende 100 mM histidin. Fraksjonen som inneholder RC-LH114-W-komplekset konsentreres til ~10 ml i en omrørt tank utstyrt med et Amicon 100 000 MWCO-filter (Merck, Storbritannia), fortynnes 20 ganger med bindingsbuffer, og tilsettes deretter til 25 ml. I DEAE Sepharose-kolonnen brukes fire CV-er bundet til bufferen på forhånd. Vask kolonnen med fire CV-bindingsbuffere, og eluer deretter komplekset på åtte CV-er på en lineær gradient på 0 til 100 mM NaCl (i bindingsbuffer), og de resterende fire CV-ene inneholdt 100 mM bindingsbuffer. De gjenværende kompleksene som ble eluert på natriumklorid kombinert med A880/A280-forholdet høyere enn 2,4 og A880/A805-forholdet høyere enn 4,6, ble konsentrert til ~2 ml i et Amicon 100 000 MWCO sentrifugalfilter og fylt med 1,5 CV IMAC på forhånd. Bufferekvilibrert Superdex 200 16/600 størrelseseksklusjonskolonne, og deretter eluert i samme buffer over 1,5 CV. Samle inn absorpsjonsspektrene til størrelseseksklusjonsfraksjonene og konsentrer absorpsjonsspektrene med A880/A280-forhold over 2,1 og A880/A805-forhold over 4,6 til 100 A880, som umiddelbart brukes til forberedelse av frossent TEM-gitter eller lagres ved -80 °C inntil behov.
En Leica EM GP nedsenkingsfryser ble brukt til å lage lavtemperatur TEM-gitter. Komplekset ble fortynnet i IMAC-buffer til A880 på 50, og deretter ble 5 μl lastet på et nylig glødeutladet QUANTIFOIL 1.2/1.3 karbonbelagt kobbernett (Agar Scientific, Storbritannia). Inkuber gitteret ved 20 °C og 60 % relativ fuktighet i 30 sekunder, tørk det deretter i 3 sekunder, og bråkjøl det deretter i flytende etan ved -176 °C.
Dataene fra RC-LH114-W-komplekset ble registrert på eBIC (Electronic Bioimaging Center) (British Diamond Light Source) med et Titan Krios-mikroskop, som opererer med en akselerasjonsspenning på 300 kV, med en nominell forstørrelse på 130 000× og en energi på 20 eV. En Gatan 968 GIF Quantum med K2-toppdetektor ble brukt til å ta opp bilder i tellemodus for å samle inn data. Den kalibrerte pikselstørrelsen er 1,048 Å, og dosehastigheten er 3,83 e-Å-2s-1. Filmen ble samlet inn på 11 sekunder og delt inn i 40 deler. Bruk det karbonbelagte området til å refokusere mikroskopet, og samle deretter inn tre filmer per hull. Totalt ble 3130 filmer samlet inn, med defokuseringsverdier mellom -1 og -3 μm.
Dataene for RC-LH116-komplekset ble samlet inn med samme mikroskop ved Asterbury Biostructure Laboratory (University of Leeds, Storbritannia). Dataene ble samlet inn i tellemodus med en forstørrelse på 130 k, og pikselstørrelsen ble kalibrert til 1,065 Å med en dose på 4,6 e-Å-2s-1. Filmen ble tatt opp på 12 sekunder og delt inn i 48 deler. Totalt ble 3359 filmer samlet inn, med defokuseringsverdier mellom -1 og -3 μm.
All databehandling utføres i Relion 3.0-pipelinen (42). Bruk Motioncorr 2 (43) for å korrigere strålebevegelsen ved hjelp av dosevekting, og bruk deretter CTFFIND 4.1 (44) for å bestemme CTF-parameteren (kontrastoverføringsfunksjon). Typiske fotomikrografer etter disse innledende behandlingstrinnene er vist i figur 2. S16. Den automatiske valgmalen genereres ved å manuelt velge omtrent 250 piksler av 1000 partikler i en 250-pikslers ramme og ingen referanse todimensjonal (2D) klassifisering, og dermed avvise de klassifiseringene som oppfyller prøvekontaminering eller ikke har noen merkbare egenskaper. Deretter ble automatisk valg utført på alle mikrofotografiene, og RC-LH114-W var 849 359 partikler, og RC-LH116-komplekset var 476 547 partikler. Alle utvalgte partikler har gjennomgått to runder med ikke-referanse 2D-klassifisering, og etter hver kjøring blir partiklene som oppfyller karbonområdet, prøveforurensning, ingen åpenbare trekk eller sterkt overlappende partikler avvist, noe som resulterer i henholdsvis 772 033 (90,9 %) og 359 678 (75,5 %). Partikler brukes til 3D-klassifisering av RC-LH114-W og RC-LH116. Den første 3D-referansemodellen ble generert ved hjelp av den stokastiske gradientnedstigningsmetoden. Ved å bruke den første modellen som referanse, klassifiseres de utvalgte partiklene i fire kategorier i 3D. Ved å bruke modellen i denne kategorien som referanse, utfør 3D-raffinering på partiklene i den største kategorien, bruk deretter det første 15 Å lavpassfilteret til å dekke løsemiddelområdet, legg til 6 piksler med myke kanter, og etterbehandle pikslene for å korrigere Gatan K2-toppmodulasjonsoverføringsfunksjonen til toppdetektoren. For RC-LH114-W-datasettet ble denne innledende modellen modifisert ved å fjerne den sterke tettheten i kantene av masken (frakoblet fra kjernekomplekstettheten i UCSF Chimera). De resulterende modellene (oppløsningene til RC-LH114-W og RC-LH116 er henholdsvis 3,91 og 4,16 Å) brukes som referanse for den andre runden med 3D-klassifisering. Partiklene som brukes er gruppert i den innledende 3D-klassen og inneholder ikke sterk korrelasjon med nabolaget. Overlapping eller mangel på åpenbare strukturelle trekk. Etter den andre runden med 3D-klassifisering ble kategorien med høyest oppløsning valgt [For RC-LH114-W er én kategori 377 703 partikler (44,5 %), for RC-LH116 er det to kategorier, totalt 260 752 partikler (54,7 %), hvor de bare er like når de er justert etter den innledende rotasjonen med en liten forskjell]. De utvalgte partiklene blir ekstrahert på nytt i en 400-pikslers boks og raffinert ved 3D-raffinering. Løsemiddelmasken genereres ved hjelp av det første 15 Å lavpassfilteret, 3-pikslers kartutvidelse og 3-pikslers mykmaske. Ved hjelp av CTF-raffinering per partikkel, bevegelseskorreksjon per partikkel og den andre runden med CTF-raffinering per partikkel, utføres 3D-raffinering, løsemiddelmaskering og etterbehandling etter hvert trinn for å ytterligere raffinere den resulterende teksturen. Ved å bruke FSC (Fourier Shell Correlation Coefficient) grenseverdien på 0,143, er oppløsningene til de endelige modellene av RC-LH114-W og RC-LH116 henholdsvis 2,65 og 2,80 Å. FSC-kurven for den endelige modellen er vist i figur 2. S17.
Alle proteinsekvenser er lastet ned fra UniProtKB: LH1-β (PufB; UniProt ID: Q6N9L5); LH1-α (PufA; UniProtID: Q6N9L4); RC-L (PufL; UniProt ID: O83005); RC-M (PufM; UniProt ID: A0A4Z7); RC-H (PuhA; UniProt ID: A0A4Z9); Protein-W (PufW; UniProt ID: Q6N1K3). SWISS-MODEL (45) ble brukt til å konstruere en homologimodell av RC, som inneholder proteinsekvensene til RC-L, RC-M og RC-H og krystallstrukturen til Rba. sphaeroides RC ble brukt som mal (PDB ID: 5LSE) (46). Bruk «fit map»-verktøyet i UCSF Chimera for å tilpasse den genererte modellen til kartet (47), forbedre proteinstrukturen, og kofaktor [4×BChl a (monomerbibliotekets restnavn = BCL), 2×BPh a (BPH), en eller to typer UQ10 (U10), ett ikke-hemjern (Fe) og ett 3,4-dihydroheksakarbonylkolin (QAK)] bruk Coot (48) for å legge til. Siden QAK ikke er tilgjengelig i monomerbiblioteket, ble det parameterisert ved hjelp av eLBOW-verktøyet i PHENIX (49).
Deretter ble LH1-underenheten konstruert. I utgangspunktet ble det automatiske konstruksjonsverktøyet i PHENIX (49) brukt til å automatisk konstruere deler av LH1-sekvensen ved hjelp av kartet og LH1-α- og LH1-β-proteinsekvensene som input. Velg den mest komplette LH1-underenheten, ekstraher den og last den inn i Coot, legg til den manglende sekvensen manuelt, og finjuster hele strukturen manuelt før du legger til to BCl-er a (BCL) og en spirilloxantin (CRT) [i henhold til relevant Rps Tettheten til LH1-komplekset og det kjente karotenoidinnholdet. Art (17)]. Kopier den komplette LH1-underenheten, og bruk UCSF Chimera "Docking Map Tool" til å dokke inn det tilstøtende ikke-modellerte området med LH1-tetthet, og finjuster den deretter i Coot; gjenta prosessen til alle LH1-underenhetene er modellert. For RC-LH114-W-strukturen, ved å ekstrahere den ikke-allokerte tettheten i Coot, segmenteres proteinet fra de gjenværende ikke-proteinkomponentene i USCF Chimera-kartet, og Autobuild-verktøyet brukes til å etablere den opprinnelige modellen og de gjenværende underenhetene (protein-W). Modellering i PHENIX (49). Legg til eventuelle manglende sekvenser i den resulterende modellen i Coot (48), og raffiner deretter hele underenheten manuelt. Den gjenværende ikke-allokerte tettheten passer til kombinasjonen av lipider (PDB monomerbibliotek-ID for CDL = CDL, POPC = 6PL og POPG = PGT), β-DDM-detergent (LMT) og UQ10-molekyler (U10). Bruk PHENIX-optimalisering (49) og manuell optimalisering i Coot (48) for å perfeksjonere den komplette initiale modellen inntil modellstatistikken og den visuelle kvaliteten på tilpasningen ikke kan forbedres ytterligere. Til slutt, bruk LocScale (50) for å skjerpe det lokale kartet, og utfør deretter flere andre sykluser med modellering av den ikke-allokerte tettheten og automatisk og manuell optimalisering.
De respektive peptidene, kofaktorene og andre lipider og kinoner som er koblet innenfor sine respektive tettheter, er vist i figur 1 og 2, S18 til S23. Den statistiske informasjonen for den endelige modellen er vist i tabell S1.
Med mindre annet er spesifisert, ble UV/Vis/NIR-absorpsjonsspektrene samlet inn på et Cary60-spektrofotometer (Agilent, USA) med 1 nm-intervaller fra 250 nm til 1000 nm og en integrasjonstid på 0,1 sekunder.
Fortynn prøven i en kvartskyvette med en 2 mm bane til A880 på 1, og innsamle absorpsjonsspekteret mellom 400 og 1000 nm. De sirkulære dikroiske spektrene ble samlet på et Jasco 810 spektropolarimeter (Jasco, Japan) med 1 nm intervaller mellom 400 nm og 950 nm med en skannehastighet på 20 nm min-1.
Den molare ekstinksjonskoeffisienten bestemmes ved å fortynne kjernekomplekset til en A880 på omtrent 50. Fortynn 10 μl-volumet i 990 μl bindingsbuffer eller metanol, og samle inn absorpsjonsspekteret umiddelbart for å minimere BChl-nedbrytning. BChl-innholdet i hver metanolprøve ble beregnet ved ekstinksjonskoeffisienten ved 771 nm på 54,8 mM-1 cm-1, og ekstinksjonskoeffisienten ble bestemt (51). Del den målte BChl-konsentrasjonen med 32 (RC-LH114-W) eller 36 (RC-LH116) for å bestemme kjernekomplekskonsentrasjonen, som deretter brukes til å bestemme absorpsjonsspekteret til den samme prøven samlet i bufferen parallelt. Ekstinksjonskoeffisient. Tre gjentatte målinger ble tatt for hver prøve, og den gjennomsnittlige absorbansen til BChl Qy-maksimum ble brukt til beregning. Ekstinksjonskoeffisienten til RC-LH114-W målt ved 878 nm er 3280 ± 140 mM-1 cm-1, mens ekstinksjonskoeffisienten til RC-LH116 målt ved 880 nm er 3800 ± 30 mM-1 cm-1.
UQ10 ble kvantifisert i henhold til metoden i (52). Kort fortalt ble reversfase-HPLC (RP-HPLC) utført ved bruk av Agilent 1200 HPLC-systemet. Løs opp omtrent 0,02 nmol RC-LH116 eller RC-LH114-W i 50 μl 50:50 metanol:kloroform som inneholder 0,02 % (w/v) jernklorid, og injiser den forhåndsekvilibrerte Beckman Coulter Ultrasphere ODS 4,6 mm Dissolve i 1 ml-1 min-1 ved 40 °C i HPLC-løsningsmiddel (80:20 metanol:2-propanol) på en ×25 cm kolonne. Utfør isokratisk eluering i et HPLC-løsningsmiddel for å overvåke absorbansen ved 275 nm (UQ10), 450 nm (karotenoider) og 780 nm (BChl) i 1 time. Toppen i 275 nm kromatogrammet etter 25,5 minutter ble integrert, og inneholdt ingen andre detekterbare forbindelser. Det integrerte arealet brukes til å beregne den molare mengden UQ10 ekstrahert med referanse til kalibreringskurven beregnet fra injeksjon av rene standarder fra 0 til 5,8 nmol (figur S14). Hver prøve ble analysert i tre replikater, og den rapporterte feilen tilsvarer standardavviket (SD) for gjennomsnittet.
En løsning som inneholdt RC-LH1-komplekset med en maksimal Qy-absorpsjon på 0,1 ble fremstilt med 30 μM redusert hestehjerte-cytokrom c2 (Merck, Storbritannia) og 0 til 50 μMUQ2 (Merck, Storbritannia). Tre 1 ml prøver ble fremstilt ved hver UQ2-konsentrasjon og inkubert over natten i mørket ved 4 °C for å sikre fullstendig tilpasning til mørket før måling. Løsningen ble lastet inn i et OLIS RSM1000 modulært spektrofotometer utstyrt med et 300 nm flamme/500 linjegitter, 1,24 mm innløp, 0,12 mm midtre og 0,6 mm utløpsspalter. Et 600 nm langt passfilter plasseres ved inngangen til prøvefotorøret og referansefotomultiplikatorrøret for å ekskludere eksitasjonslys. Absorbansen ble overvåket ved 550 nm med en integrasjonstid på 0,15 s. Eksitasjonslyset sendes ut fra en 880 nm M880F2 LED (Light Emitting Diode) (Thorlabs Ltd., Storbritannia) gjennom en fiberoptisk kabel med 90 % intensitet via en DC2200-kontroller (Thorlabs Ltd., Storbritannia) og sendes til lyskilden i en vinkel på 90°. Målestrålen er rettet mot speilet for å returnere lys som ikke ble absorbert av prøven i utgangspunktet. Overvåk absorbansen i 10 sekunder før belysningsstyrken på 50 sekunder. Deretter ble absorbansen overvåket ytterligere i 60 sekunder i mørket for å vurdere i hvilken grad kinolol spontant reduserer cytokrom c23+ (se figur S8 for rådata).
Dataene ble behandlet ved å tilpasse en lineær starthastighet innen 0,5 til 10 s (avhengig av UQ2-konsentrasjonen) og beregne gjennomsnittet av hastighetene for alle tre prøvene ved hver UQ2-konsentrasjon. RC-LH1-konsentrasjonen beregnet ved den respektive ekstinksjonskoeffisienten ble brukt til å konvertere hastigheten til katalytisk effektivitet, plottet i Origin Pro 2019 (OriginLab, USA), og tilpasset Michaelis-Menten-modellen for å bestemme de tilsynelatende Km- og Kcat-verdiene.
For målinger av transient absorpsjon ble RC-LH1-prøven fortynnet til ~2 μM i IMAC-buffer som inneholdt 50 mM natriumaskorbat (Merck, USA) og 0,4 mM terbutin (Merck, USA). Askorbinsyre brukes som offerelektrondonor, og tert-butaklofen brukes som QB-hemmer for å sikre at den viktigste RC-donoren forblir redusert (det vil si ikke fotooksidert) gjennom hele måleprosessen. Omtrent 3 ml prøve tilsettes en tilpasset roterende celle (ca. 0,1 m i diameter, 350 RPM) med en optisk banelengde på 2 mm for å sikre at prøven i laserbanen har nok tid til mørk tilpasning mellom eksitasjonspulsene. Bruk ~100-fs laserpulser for å forsterke Ti:Sapphire-lasersystemet (Spectra Physics, USA) for å eksitere prøven ved 880 nm med en repetisjonsfrekvens på 1 kHz (20 nJ for NIR eller 100 nJ for Vis). Før datainnsamling, eksponeres prøven for eksitasjonslys i omtrent 30 minutter. Eksponering vil forårsake QA-inaktivering (muligens redusere QA en eller to ganger). Men vær oppmerksom på at denne prosessen er reversibel fordi RC etter en lang periode med mørk tilpasning sakte vil gå tilbake til QA-aktivitet. Et Helios-spektrometer (Ultrafast Systems, USA) ble brukt til å måle transiente spektre med en forsinkelsestid på -10 til 7000 ps. Bruk Surface Xplorer-programvaren (Ultrafast Systems, USA) til å oppdele datasettene, deretter slå sammen og standardisere. Bruk CarpetView-programvarepakken (Light Conversion Ltd., Litauen) til å bruke det kombinerte datasettet til å oppnå differensialspektre relatert til henfall, eller bruk en funksjon som konvolverer flere eksponenter med instrumentresponsen for å tilpasse den spektrale utviklingen med én bølgelengde i Origin (OriginLab, USA).
Som nevnt ovenfor (53) ble det fremstilt en fotosyntetisk film som inneholdt LH1-komplekset, som manglet både RC- og perifer LH2-antenne. Membranen ble fortynnet i 20 mM tris (pH 8,0) og deretter lastet inn i en kvartskyvette med en 2 mm optisk bane. En 30 nJ laserpuls ble brukt til å eksitere prøven ved 540 nm med en forsinkelsestid på -10 til 7000 ps. Behandle datasettet som beskrevet for Rps. pal-prøven.
Membranen ble pelletert ved sentrifugering ved 150 000 RCF i 2 timer ved 4 °C, og deretter ble absorbansen ved 880 nm resuspendert i 20 mM tris-HCl (pH 8,0) og 200 mM NaCl. Løs opp membranen ved sakte omrøring i 2 % (w/v) β-DDM i 1 time i mørket ved 4 °C. Prøven ble fortynnet i 100 mM trietylammoniumkarbonat (pH 8,0) (TEAB; Merck, Storbritannia) til en proteinkonsentrasjon på 2,5 mg ml-1 (Bio-Rad-analyse). Videre prosessering ble utført fra den tidligere publiserte metoden (54), startende med fortynning av 50 μg protein til totalt 50 μl TEAB som inneholdt 1 % (w/v) natriumlaurat (Merck, Storbritannia). Etter sonikering i 60 sekunder ble den redusert med 5 mM tris(2-karboksyetyl)fosfin (Merck, Storbritannia) ved 37 °C i 30 minutter. For S-alkylering, inkuber prøven med 10 mM metyl S-metyltiometansulfonat (Merck, Storbritannia) og tilsett den fra en 200 mM isopropanol-stamløsning i 10 minutter ved romtemperatur. Proteolytisk fordøyelse ble utført ved å tilsette 2 μg trypsin/endoproteinase Lys-C-blanding (Promega Storbritannia) og inkubert ved 37 °C i 3 timer. Laurat-surfaktanten ble ekstrahert ved å tilsette 50 μl etylacetat og 10 μl 10 % (v/v) LC-kvalitet trifluoreddiksyre (TFA; Thermo Fisher Scientific, Storbritannia) og virvles i 60 sekunder. Faseseparasjonen ble fremmet ved sentrifugering ved 15 700 RCF i 5 minutter. I henhold til produsentens protokoll ble en C18-spinnkolonne (Thermo Fisher Scientific, Storbritannia) brukt til å forsiktig aspirere og avsalte den nedre fasen som inneholdt peptidet. Etter tørking ved vakuumsentrifugering ble prøven løst opp i 0,5 % TFA og 3 % acetonitril, og 500 ng ble analysert ved nanoflow RP-kromatografi kombinert med massespektrometri ved bruk av systemparametrene som er beskrevet tidligere.
Bruk MaxQuant v.1.5.3.30 (56) for proteinidentifikasjon og kvantifisering for å søke etter Rps. palustris proteomdatabase (www.uniprot.org/proteomes/UP000001426). Massespektrometri-proteomikkdataene er lagret i ProteomeXchange Alliance gjennom PRIDE-partnerlageret (http://proteomecentral.proteomexchange.org) under datasettidentifikatoren PXD020402.
For analyse ved RPLC kombinert med elektrosprayioniseringsmassespektrometri ble RC-LH1-komplekset fremstilt fra villtype Rps. Ved å bruke den tidligere publiserte metoden (16) var proteinkonsentrasjonen produsert i palustris-celler 2 mg ml-1 i 20 mM Hepes (pH 7,8), 100 mM NaCl og 0,03 % (w/v) β-(Bio-Rad-analyse)) DDM. I henhold til produsentens protokoll, bruk et 2D-rensesett (GE Healthcare, USA) for å ekstrahere 10 μg protein ved utfellingsmetoden, og løs opp bunnfallet i 20 μl 60 % (v/v) maursyre (FA), 20 % (v/v) acetonitril og 20 % (v/v) vann. Fem mikroliter ble analysert ved RPLC (Dionex RSLC) kombinert med massespektrometri (Maxis UHR-TOF, Bruker). Bruk MabPac 1,2 × 100 mm kolonne (Thermo Fisher Scientific, Storbritannia) for separasjon ved 60 °C og 100 μl min-1, med en gradient på 85 % (v/v) løsningsmiddel A [0,1 % (v/v) FA og 0,02 % (V/v) TFA vandig løsning] til 85 % (v/v) løsningsmiddel B [0,1 % (v/v) FA og 0,02 % (v/v) i 90 % (v/v) acetonitril TFA]. Ved å bruke standard elektrospray-ioniseringskilde og standardparametere i mer enn 60 minutter, oppnår massespektrometeret 100 til 2750 m/z (masse-til-ladningsforhold). Ved hjelp av ExPASy bioinformatikkressursportal FindPept-verktøyet (https://web.expasy.org/findpept/), kartlegg massespekteret til underenhetene i komplekset.
Cellene ble dyrket i 72 timer under 100 ml NF-lavt (10 μMm⁻² s⁻¹), medium (30 μMm⁻² s⁻¹) eller høyt (300 μMm⁻² s⁻¹) lys. M22-medium (M22-medium der ammoniumsulfat er utelatt og natriumsuccinat er erstattet med natriumacetat) i en 100 ml skrukorkflaske (23). I fem 30-sekunders sykluser ble 0,1 mikron glasskuler tilsatt i et volumforhold på 1:1 for å lysere cellene og avkjølt på is i 5 minutter. Uoppløselig materiale, ubrutte celler og glasskuler ble fjernet ved sentrifugering ved 16 000 RCF i 10 minutter i en benkmontert mikrosentrifuge. Membranen ble separert i en Ti 70.1-rotor med 100 000 RCF i 20 mM tris-HCl (pH 8,0) med en 40/15 % (w/w) sukrosegradient i 10 timer.
Som beskrevet i vårt tidligere arbeid, immunodeteksjon av His-taggen på PufW (16). Kort sagt, det rensede kjernekomplekset (11,8 nM) eller membranen som inneholder samme konsentrasjon av RC (bestemt ved oksidasjon, subtraksjon av det reduserte differansespekteret og matching av belastningen på den fargede gelen) i 2x SDS-lastebuffer (Merck, Storbritannia) ble fortynnet to ganger. Proteinene ble separert på en replika 12% bis-tris NuPage-gel (Thermo Fisher Scientific, Storbritannia). En gel ble farget med Coomassie Brilliant Blue (Bio-Rad, Storbritannia) for å laste og visualisere RC-L-underenheten. Proteinet på den andre gelen ble overført til en metanolaktivert polyvinylidenfluorid (PVDF)-membran (Thermo Fisher Scientific, Storbritannia) for immunanalyse. PVDF-membranen ble blokkert i 50 mM tris-HCl (pH 7,6), 150 mM NaCl, 0,2 % (v/v) Tween-20 og 5 % (w/v) skummetmelkpulver, og deretter inkubert med det primære anti-His-antistoffet (fortynn antistoffbufferen [50 mM tris-HCl (pH 7,6), 150 mM NaCl og 0,05 % (v/v) Tween-20] i 1:1000 A190-114A, Bethyl Laboratories, USA) i 4 timer. Etter vask 3 ganger i 5 minutter i antistoffbuffer, ble membranen kombinert med pepperrotperoksidase (Sigma-Aldrich, Storbritannia) anti-mus sekundært antistoff (fortynnet 1:10 000 i antistoffbuffer). Inkuber for å tillate deteksjon (5 minutter etter 3 vask i antistoffbuffer) ved bruk av WESTAR ETA C 2.0 kjemiluminescenssubstrat (Cyanagen, Italia) og Amersham Imager 600 (GE Healthcare, Storbritannia).
Ved å tegne intensitetsfordelingen til hver fargede gel eller immunoassay-bane, integrere arealet under toppen og beregne intensitetsforholdet mellom RC-L (farget gel) og Protein-W (immunoassay), behandle bildet i ImageJ (57). Disse forholdstallene ble konvertert til molare forhold ved å anta at forholdet mellom RC-L og protein-W i den rene RC-LH114-W-prøven var 1:1 og normalisere hele datasettet deretter.
For tilleggsmateriale til denne artikkelen, se http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/7/3/eabe2631/DC1
Dette er en artikkel med åpen tilgang distribuert under vilkårene i Creative Commons Attribution License. Artikkelen tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium under forutsetning av at det originale verket er korrekt sitert.
Merk: Vi ber deg bare om å oppgi e-postadressen din, slik at personen du anbefaler til siden vet at du vil at de skal se e-posten, og at den ikke er spam. Vi vil ikke registrere noen e-postadresser.
Dette spørsmålet brukes til å teste om du er en besøkende og forhindre automatisk spaminnsending.
David JK Swainsbury, Park Qian, Philip J. Jackson, Kaitlyn M. Faries, Dariusz M. Niedzwiedzki, Elizabeth C. Martin, David A. Farmer, Lorna A. Malone, Rebecca F. Thompson, Neil A. Ranson, Daniel P. Canniffe, Mark J. Dickman, Dewey Holten, Christine Kirmaier, Andrew Hitchcock, C. Neil Hunter
Høyoppløsningsstrukturen til lysfelle 1-komplekset i reaksjonssenteret gir ny innsikt i kinondynamikken.
David JK Swainsbury, Park Qian, Philip J. Jackson, Kaitlyn M. Faries, Dariusz M. Niedzwiedzki, Elizabeth C. Martin, David A. Farmer, Lorna A. Malone, Rebecca F. Thompson, Neil A. Ranson, Daniel P. Canniffe, Mark J. Dickman, Dewey Holten, Christine Kirmaier, Andrew Hitchcock, C. Neil Hunter
Høyoppløsningsstrukturen til lysfelle 1-komplekset i reaksjonssenteret gir ny innsikt i kinondynamikken.
©2021 American Association for the Advancement of Science. alle rettigheter forbeholdt. AAAS er partner av HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef og COUNTER. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.