Artikkelen er en del av forskningsemnet «Avanserte bioremedieringsteknologier og resirkuleringsprosesser for syntetiske organiske forbindelser (SOC). Se alle 14 artiklene
Lavmolekylære polysykliske aromatiske hydrokarboner (PAH-er) som naftalen og substituerte naftalener (metylnaftalen, naftosyre, 1-naftyl-N-metylkarbamat, etc.) er mye brukt i ulike industrier og er gentoksiske, mutagene og/eller kreftfremkallende for organismer. Disse syntetiske organiske forbindelsene (SOC-ene) eller xenobiotikaene regnes som prioriterte forurensende stoffer og utgjør en alvorlig trussel mot det globale miljøet og folkehelsen. Intensiteten av menneskelige aktiviteter (f.eks. kullforgassning, oljeraffinering, kjøretøyutslipp og landbruksapplikasjoner) bestemmer konsentrasjonen, skjebnen og transporten av disse allestedsnærværende og persistente forbindelsene. I tillegg til fysiske og kjemiske behandlings-/fjerningsmetoder, har grønne og miljøvennlige teknologier som bioremediering, som bruker mikroorganismer som er i stand til å bryte ned POC-er fullstendig eller omdanne dem til giftfrie biprodukter, dukket opp som et trygt, kostnadseffektivt og lovende alternativ. Ulike bakteriearter som tilhører rekkene Proteobacteria (Pseudomonas, Pseudomonas, Comamonas, Burkholderia og Neosphingobacterium), Firmicutes (Bacillus og Paenibacillus) og Actinobacteria (Rhodococcus og Arthrobacter) i jordmikrobiotaen har vist evnen til å bryte ned ulike organiske forbindelser. Metabolske studier, genomikk og metagenomisk analyse hjelper oss å forstå den katabolske kompleksiteten og mangfoldet som er tilstede i disse enkle livsformene, noe som kan brukes videre for effektiv biologisk nedbrytning. Den langvarige eksistensen av PAH-er har resultert i fremveksten av nye nedbrytningsfenotyper gjennom horisontal genoverføring ved bruk av genetiske elementer som plasmider, transposoner, bakteriofager, genomiske øyer og integrerende konjugative elementer. Systembiologi og genteknologi av spesifikke isolater eller modellsamfunn (konsortier) kan muliggjøre omfattende, rask og effektiv bioremediering av disse PAH-ene gjennom synergistiske effekter. I denne gjennomgangen fokuserer vi på de ulike metabolske veiene og mangfoldet, genetisk sammensetning og mangfold, og cellulære responser/tilpasninger hos naftalen og substituerte naftalen-nedbrytende bakterier. Dette vil gi økologisk informasjon for feltapplikasjon og belastningsoptimalisering for effektiv bioremediering.
Rask utvikling av industrier (petrokjemikalier, landbruk, legemidler, tekstilfarger, kosmetikk, osv.) har bidratt til global økonomisk velstand og forbedret levestandard. Denne eksponentielle utviklingen har resultert i produksjonen av et stort antall syntetiske organiske forbindelser (SOC-er), som brukes til å produsere ulike produkter. Disse fremmede forbindelsene eller SOC-ene inkluderer polysykliske aromatiske hydrokarboner (PAH-er), plantevernmidler, herbicider, myknere, fargestoffer, legemidler, organofosfater, flammehemmere, flyktige organiske løsemidler, osv. De slippes ut i atmosfæren, akvatiske og terrestriske økosystemer, hvor de har flerdimensjonale påvirkninger, som forårsaker skadelige effekter på ulike bioformer gjennom endring av fysisk-kjemiske egenskaper og samfunnsstruktur (Petrie et al., 2015; Bernhardt et al., 2017; Sarkar et al., 2020). Mange aromatiske miljøgifter har sterke og destruktive virkninger på mange intakte økosystemer/biodiversitetshotspots (f.eks. korallrev, arktiske/antarktiske isdekker, høyfjellsjøer, dyphavssedimenter, osv.) (Jones 2010; Beyer et al. 2020; Nordborg et al. 2020). Nyere geomikrobiologiske studier har vist at avsetning av syntetisk organisk materiale (f.eks. aromatiske miljøgifter) og deres derivater på overflatene av kunstige strukturer (bygd miljø) (f.eks. kulturarvsteder og monumenter laget av granitt, stein, tre og metall) akselererer nedbrytningen av dem (Gadd 2017; Liu et al. 2018). Menneskelig aktivitet kan intensivere og forverre den biologiske nedbrytningen av monumenter og bygninger gjennom luftforurensning og klimaendringer (Liu et al. 2020). Disse organiske forurensningene reagerer med vanndamp i atmosfæren og legger seg på strukturen, noe som forårsaker fysisk og kjemisk nedbrytning av materialet. Biologisk nedbrytning er allment anerkjent som uønskede endringer i utseendet og egenskapene til materialer forårsaket av levende organismer som påvirker deres bevaring (Pochon og Jaton, 1967). Ytterligere mikrobiell aktivitet (metabolisme) av disse forbindelsene kan redusere strukturell integritet, bevaringseffektivitet og kulturell verdi (Gadd, 2017; Liu et al., 2018). På den annen side har mikrobiell tilpasning til og respons på disse strukturene i noen tilfeller vist seg å være gunstig, ettersom de danner biofilmer og andre beskyttende skorper som reduserer hastigheten på forråtnelse/nedbrytning (Martino, 2016). Derfor krever utviklingen av effektive langsiktige bærekraftige bevaringsstrategier for stein-, metall- og tremonumenter en grundig forståelse av de viktigste prosessene som er involvert i denne prosessen. Sammenlignet med naturlige prosesser (geologiske prosesser, skogbranner, vulkanutbrudd, plante- og bakteriereaksjoner) resulterer menneskelig aktivitet i utslipp av store mengder polysykliske aromatiske hydrokarboner (PAH-er) og annet organisk karbon (OC) i økosystemer. Mange PAH-er som brukes i landbruket (insekticider og plantevernmidler som DDT, atrazin, karbaryl, pentaklorfenol, etc.), industri (råolje, oljeslam/avfall, petroleumsavledet plast, PCB-er, myknere, vaskemidler, desinfeksjonsmidler, fumiganter, dufter og konserveringsmidler), personlig pleieprodukter (solkremer, desinfeksjonsmidler, insektmiddel og polysykliske moskus) og ammunisjon (eksplosiver som 2,4,6-TNT) er potensielle xenobiotika som kan påvirke planetens helse (Srogi, 2007; Vamsee-Krishna og Phale, 2008; Petrie et al., 2015). Denne listen kan utvides til å omfatte petroleumsavledede forbindelser (fyringsoljer, smøremidler, asfaltener), bioplast med høy molekylvekt og ioniske væsker (Amde et al., 2015). Tabell 1 viser ulike aromatiske forurensninger og deres anvendelser i ulike industrier. I de senere årene har menneskeskapte utslipp av flyktige organiske forbindelser, samt karbondioksid og andre klimagasser, begynt å øke (Dvorak et al., 2017). Imidlertid overstiger de menneskeskapte påvirkningene betydelig de naturlige. I tillegg fant vi at en rekke kjemiske forbindelser fortsatt finnes i mange miljøer og har blitt identifisert som nye forurensende stoffer med negative effekter på biomer (figur 1). Miljøbyråer som USAs miljøvernbyrå (USEPA) har inkludert mange av disse forurensende stoffene i sin prioriteringsliste på grunn av deres cytotoksiske, gentoksiske, mutagene og kreftfremkallende egenskaper. Derfor er det behov for strenge avhendingsregler og effektive strategier for avfallsbehandling/fjerning fra forurensede økosystemer. Ulike fysiske og kjemiske behandlingsmetoder som pyrolyse, oksidativ termisk behandling, lufting, deponering, forbrenning osv. er ineffektive og kostbare, og genererer etsende, giftige og vanskelig behandlede biprodukter. Med økende global miljøbevissthet får mikroorganismer som er i stand til å bryte ned disse forurensningene og deres derivater (som halogenerte, nitro-, alkyl- og/eller metyl-forbindelser) stadig større oppmerksomhet (Fennell et al., 2004; Haritash og Kaushik, 2009; Phale et al., 2020; Sarkar et al., 2020; Schwanemann et al., 2020). Bruken av disse stedegne kandidatmikroorganismene alene eller i blandede kulturer (kolonier) for fjerning av aromatiske forurensninger har fordeler når det gjelder miljøsikkerhet, kostnader, effektivitet, virkningsfullhet og bærekraft. Forskere utforsker også integreringen av mikrobielle prosesser med elektrokjemiske redoksmetoder, nemlig bioelektrokjemiske systemer (BES), som en lovende teknologi for behandling/fjerning av forurensninger (Huang et al., 2011). BES-teknologi har fått økende oppmerksomhet på grunn av sin høye effektivitet, lave kostnader, miljøsikkerhet, romtemperaturdrift, biokompatible materialer og evnen til å gjenvinne verdifulle biprodukter (f.eks. elektrisitet, drivstoff og kjemikalier) (Pant et al., 2012; Nazari et al., 2020). Fremveksten av høykapasitets genomsekvensering og omikkverktøy/metoder har gitt en mengde ny informasjon om genetisk regulering, proteomikk og fluksomikk i reaksjonene til ulike nedbrytende mikroorganismer. Å kombinere disse verktøyene med systembiologi har ytterligere forbedret vår forståelse av valg og finjustering av målkatabolske veier i mikroorganismer (dvs. metabolsk design) for å oppnå effektiv og virkningsfull biologisk nedbrytning. For å designe effektive bioremedieringsstrategier ved hjelp av passende kandidatmikroorganismer, må vi forstå det biokjemiske potensialet, metabolske mangfoldet, den genetiske sammensetningen og økologien (autoøkologi/synekologi) til mikroorganismer.
Fig. 1. Kilder og overføringsveier for lavmolekylære PAH-er gjennom ulike miljøer og ulike faktorer som påvirker biota. Stiplede linjer representerer interaksjoner mellom økosystemelementer.
I denne gjennomgangen har vi forsøkt å oppsummere dataene om nedbrytning av enkle PAH-er som naftalen og substituerte naftalener av ulike bakterieisolater, som dekker metabolske veier og mangfold, enzymer involvert i nedbrytning, gensammensetning/innhold og mangfold, cellulære responser og ulike aspekter ved bioremediering. Forståelse av de biokjemiske og molekylære nivåene vil bidra til å identifisere passende vertsstammer og deres videre genteknologi for effektiv bioremediering av slike prioriterte forurensninger. Dette vil bidra til å utvikle strategier for etablering av stedsspesifikke bakteriekonsortier for effektiv bioremediering.
Tilstedeværelsen av et stort antall giftige og farlige aromatiske forbindelser (som tilfredsstiller Huckel-regelen 4n + 2π-elektroner, n = 1, 2, 3, …) utgjør en alvorlig trussel mot ulike miljømedier som luft, jord, sedimenter og overflatevann og grunnvann (Puglisi et al., 2007). Disse forbindelsene har enkle benzenringer (monosykliske) eller flere benzenringer (polysykliske) arrangert i lineær, kantete eller klyngeform og viser stabilitet (stabilitet/ustabilitet) i miljøet på grunn av høy negativ resonansenergi og inerthet (inerthet), noe som kan forklares med deres hydrofobisitet og reduserte tilstand. Når den aromatiske ringen ytterligere erstattes av metyl- (-CH3), karboksyl- (-COOH), hydroksyl- (-OH) eller sulfonat- (-HSO3) grupper, blir den mer stabil, har en sterkere affinitet for makromolekyler og er bioakkumulerende i biologiske systemer (Seo et al., 2009; Phale et al., 2020). Noen polysykliske aromatiske hydrokarboner med lav molekylvekt (LMWAH), som naftalen og dets derivater [metylnaftalen, naftosyre, naftalensulfonat og 1-naftyl-N-metylkarbamat (karbaryl)], er inkludert på listen over prioriterte organiske miljøgifter av US Environmental Protection Agency som gentoksiske, mutagene og/eller kreftfremkallende (Cerniglia, 1984). Utslipp av denne klassen NM-PAH-er i miljøet kan føre til bioakkumulering av disse forbindelsene på alle nivåer i næringskjeden, og dermed påvirke økosystemenes helse (Binkova et al., 2000; Srogi, 2007; Quinn et al., 2009).
Kildene til og transportveiene for PAH-er til biota er primært gjennom migrasjon og interaksjoner mellom ulike økosystemkomponenter som jord, grunnvann, overflatevann, avlinger og atmosfæren (Arey og Atkinson, 2003). Figur 1 viser interaksjonene og fordelingen av ulike lavmolekylære PAH-er i økosystemer og deres veier til biota/menneskelig eksponering. PAH-er avsettes på overflater som følge av luftforurensning og gjennom migrasjon (drift) av kjøretøyutslipp, industrielle eksosgasser (kullforgassing, forbrenning og koksproduksjon) og avsetning av disse. Industrielle aktiviteter som produksjon av syntetiske tekstiler, fargestoffer og maling; treimpregnering; gummiforedling; sementproduksjon; plantevernmiddelproduksjon; og landbruksapplikasjoner er viktige kilder til PAH-er i terrestriske og akvatiske systemer (Bamforth og Singleton, 2005; Wick et al., 2011). Studier har vist at jordsmonn i forsteder og byområder, nær motorveier og i store byer er mer utsatt for polysykliske aromatiske hydrokarboner (PAH-er) på grunn av utslipp fra kraftverk, boligoppvarming, luft- og veitrafikkbelastning og byggevirksomhet (Suman et al., 2016). (2008) viste at PAH-er i jord nær veier i New Orleans, Louisiana, USA var så høye som 7189 μg/kg, mens de i åpne områder bare var 2404 μg/kg. Tilsvarende er det rapportert om PAH-nivåer så høye som 300 μg/kg i områder nær kullforgassingsanlegg i flere amerikanske byer (Kanaly og Harayama, 2000; Bamforth og Singleton, 2005). Jordsmonn fra diverse indiske byer som Delhi (Sharma et al., 2008), Agra (Dubey et al., 2014), Mumbai (Kulkarni og Venkataraman, 2000) og Visakhapatnam (Kulkarni et al., 2014) har blitt rapportert å inneholde høye konsentrasjoner av PAH-er. Aromatiske forbindelser absorberes lettere til jordpartikler, organisk materiale og leirmineraler, og blir dermed viktige karbonlagre i økosystemer (Srogi, 2007; Peng et al., 2008). De viktigste kildene til PAH-er i akvatiske økosystemer er nedbør (våt/tørr nedbør og vanndamp), avrenning fra byer, utslipp av avløpsvann, grunnvannsinnladning osv. (Srogi, 2007). Det er anslått at omtrent 80 % av PAH-ene i marine økosystemer stammer fra nedbør, sedimentasjon og avfallsutslipp (Motelay-Massei et al., 2006; Srogi, 2007). Høyere konsentrasjoner av PAH-er i overflatevann eller sigevann fra avfallsdeponier lekker til slutt ut i grunnvannet, noe som utgjør en stor folkehelsetrussel siden mer enn 70 % av befolkningen i Sør- og Sørøst-Asia drikker grunnvann (Duttagupta et al., 2019). En fersk studie av Duttagupta et al. (2020) av elve- (32) og grunnvannsanalyser (235) fra Vest-Bengal, India, fant at anslagsvis 53 % av byboere og 44 % av landboere (totalt 20 millioner innbyggere) kan være eksponert for naftalen (4,9–10,6 μg/L) og dets derivater. Ulike arealbruksmønstre og økt grunnvannsutvinning anses å være hovedfaktorene som kontrollerer den vertikale transporten (adveksjonen) av lavmolekylære PAH-er i undergrunnen. Avrenning fra landbruket, utslipp av kommunalt og industrielt avløpsvann og utslipp av fast avfall/søppel har vist seg å være påvirket av PAH-er i elvebassenger og sedimenter i undergrunnen. Atmosfærisk nedbør forverrer PAH-forurensningen ytterligere. Høye konsentrasjoner av PAH-er og deres alkylderivater (totalt 51) er rapportert i elver/nedbørsfelt over hele verden, som Fraser-elven, Louan-elven, Denso-elven, Missouri-elven, Anacostia-elven, Ebro-elven og Delaware-elven (Yunker et al., 2002; Motelay-Massei et al., 2006; Li et al., 2010; Amoako et al., 2011; Kim et al., 2018). I sedimentene i Ganges-elvens nedbørfelt ble naftalen og fenantren funnet å være de mest signifikante (påvist i 70 % av prøvene) (Duttagupta et al., 2019). Studier har dessuten vist at klorering av drikkevann kan føre til dannelse av mer giftige oksygenerte og klorerte PAH-er (Manoli og Samara, 1999). PAH-er akkumuleres i korn, frukt og grønnsaker som følge av opptak av planter fra forurenset jord, grunnvann og nedbør (Fismes et al., 2002). Mange vannlevende organismer som fisk, blåskjell, muslinger og reker er forurenset med PAH-er gjennom forbruk av forurenset mat og sjøvann, samt gjennom vev og hud (Mackay og Fraser, 2000). Tilberednings-/foredlingsmetoder som grilling, ovnsbaking, røyking, steking, tørking, baking og koking på trekull kan også føre til betydelige mengder PAH-er i mat. Dette avhenger i stor grad av valg av røykemateriale, fenolisk/aromatisk hydrokarboninnhold, tilberedningsprosedyre, varmetype, fuktighetsinnhold, oksygentilførsel og forbrenningstemperatur (Guillén et al., 2000; Gomes et al., 2013). Polysykliske aromatiske hydrokarboner (PAH-er) er også blitt påvist i melk i varierende konsentrasjoner (0,75–2,1 mg/L) (Girelli et al., 2014). Akkumuleringen av disse PAH-ene i mat avhenger også av matens fysisk-kjemiske egenskaper, mens deres toksiske effekter er relatert til fysiologiske funksjoner, metabolsk aktivitet, absorpsjon, distribusjon og kroppsdistribusjon (Mechini et al., 2011).
Toksisiteten og de skadelige effektene av polysykliske aromatiske hydrokarboner (PAH-er) har vært kjent lenge (Cherniglia, 1984). Polysykliske aromatiske hydrokarboner med lav molekylvekt (LMW-PAH-er) (to til tre ringer) kan binde seg kovalent til forskjellige makromolekyler som DNA, RNA og proteiner, og er kreftfremkallende (Santarelli et al., 2008). På grunn av sin hydrofobe natur er de atskilt av lipidmembraner. Hos mennesker oksiderer cytokrom P450 monooksygenaser PAH-er til epoksider, hvorav noen er svært reaktive (f.eks. baediolepoksid) og kan føre til transformasjon av normale celler til ondartede (Marston et al., 2001). I tillegg er transformasjonsproduktene av PAH-er, som kinoner, fenoler, epoksider, dioler osv., mer giftige enn de opprinnelige forbindelsene. Noen PAH-er og deres metabolske mellomprodukter kan påvirke hormoner og ulike enzymer i metabolismen, og dermed påvirke vekst, sentralnervesystemet, reproduksjons- og immunsystemet negativt (Swetha og Phale, 2005; Vamsee-Krishna et al., 2006; Oostingh et al., 2008). Kortvarig eksponering for PAH-er med lav molekylvekt har vist seg å forårsake nedsatt lungefunksjon og trombose hos astmatikere, og øke risikoen for hud-, lunge-, blære- og mage-tarmkreft (Olsson et al., 2010; Diggs et al., 2011). Dyrestudier har også vist at PAH-eksponering kan ha negative effekter på reproduksjonsfunksjon og utvikling, og kan forårsake grå stær, nyre- og leverskader og gulsott. Ulike PAH-biotransformasjonsprodukter som dioler, epoksider, kinoner og frie radikaler (kationer) har vist seg å danne DNA-addukter. Stabile addukter har vist seg å endre DNA-replikasjonsmaskineriet, mens ustabile addukter kan depurinere DNA (hovedsakelig til adenin og noen ganger til guanin); begge kan generere feil som fører til mutasjoner (Schweigert et al. 2001). I tillegg kan kinoner (benzo-/pan-) generere reaktive oksygenforbindelser (ROS), som forårsaker dødelig skade på DNA og andre makromolekyler, og dermed påvirker vevsfunksjon/levedyktighet (Ewa og Danuta 2017). Kronisk eksponering for lave konsentrasjoner av pyren, bifenyl og naftalen har blitt rapportert å forårsake kreft hos forsøksdyr (Diggs et al. 2012). På grunn av deres dødelige toksisitet er opprydding/fjerning av disse PAH-ene fra berørte/forurensede steder en prioritet.
Ulike fysiske og kjemiske metoder har blitt brukt for å fjerne PAH-er fra forurensede steder/miljøer. Prosesser som forbrenning, deklorering, UV-oksidasjon, fiksering og løsemiddelekstraksjon har mange ulemper, inkludert dannelse av giftige biprodukter, prosesskompleksitet, sikkerhets- og regulatoriske problemer, lav effektivitet og høye kostnader. Mikrobiell biologisk nedbrytning (kalt bioremediering) er imidlertid en lovende alternativ tilnærming som involverer bruk av mikroorganismer i form av renkulturer eller kolonier. Sammenlignet med fysiske og kjemiske metoder er denne prosessen miljøvennlig, ikke-invasiv, kostnadseffektiv og bærekraftig. Bioremediering kan utføres på det berørte stedet (in situ) eller på et spesielt forberedt sted (ex situ) og anses derfor som en mer bærekraftig opprydningsmetode enn tradisjonelle fysiske og kjemiske metoder (Juhasz og Naidu, 2000; Andreoni og Gianfreda, 2007; Megharaj et al., 2011; Phale et al., 2020; Sarkar et al., 2020).
Å forstå de mikrobielle metabolske trinnene involvert i nedbrytningen av aromatiske forurensninger har enorme vitenskapelige og økonomiske implikasjoner for økologisk og miljømessig bærekraft. Anslagsvis 2,1 × 1018 gram karbon (C) lagres i sedimenter og organiske forbindelser (dvs. olje, naturgass og kull, dvs. fossilt brensel) over hele verden, noe som gir et betydelig bidrag til den globale karbonsyklusen. Rask industrialisering, utvinning av fossilt brensel og menneskelig aktivitet tømmer imidlertid disse litosfæriske karbonreservoarene, og frigjør anslagsvis 5,5 × 1015 g organisk karbon (som forurensninger) i atmosfæren årlig (Gonzalez-Gaya et al., 2019). Mesteparten av dette organiske karbonet kommer inn i terrestriske og marine økosystemer gjennom sedimentasjon, transport og avrenning. I tillegg forurenser nye syntetiske forurensninger avledet fra fossilt brensel, som plast, myknere og plaststabilisatorer (ftalater og deres isomerer), marine, jord- og akvatiske økosystemer og deres biota alvorlig, og forverrer dermed den globale klimarisikoen. Ulike typer mikroplast, nanoplast, plastfragmenter og deres giftige monomerprodukter utvunnet fra polyetylentereftalat (PET) har samlet seg i Stillehavet mellom Nord-Amerika og Sørøst-Asia, og dannet «den store stillehavssøppelplassen», noe som skader marint liv (Newell et al., 2020). Vitenskapelige studier har vist at det ikke er mulig å fjerne slike forurensninger/avfall ved hjelp av fysiske eller kjemiske metoder. I denne sammenhengen er de mest nyttige mikroorganismene de som er i stand til å oksidativt metabolisere forurensninger til karbondioksid, kjemisk energi og andre ikke-giftige biprodukter som til slutt går inn i andre næringssyklusprosesser (H2, O2, N2, S2, P2, Fe2, etc.). Derfor er det avgjørende å forstå den mikrobielle økofysiologien til mineralisering av aromatiske forurensninger og dens miljøkontroll for å vurdere den mikrobielle karbonsyklusen, netto karbonbudsjett og fremtidige klimarisikoer. Gitt det presserende behovet for å fjerne slike forbindelser fra miljøet, har det dukket opp ulike økoindustrier med fokus på rene teknologier. Alternativt anses verdiutnyttelse av industriavfall/avfallskjemikalier som akkumuleres i økosystemer (dvs. en tilnærming som omdanner avfall til rikdom) som en av grunnpilarene i sirkulærøkonomien og bærekraftsmålene (Close et al., 2012). Derfor er det av største betydning å forstå de metabolske, enzymatiske og genetiske aspektene ved disse potensielle nedbrytningskandidatene for effektiv fjerning og bioremediering av slike aromatiske forurensninger.
Blant de mange aromatiske forurensningene legger vi spesiell vekt på lavmolekylære PAH-er som naftalen og substituerte naftalener. Disse forbindelsene er hovedkomponenter i petroleumsavledet drivstoff, tekstilfargestoffer, forbrukerprodukter, plantevernmidler (møllkuler og insektmidler), myknere og tanniner, og er derfor utbredt i mange økosystemer (Preuss et al., 2003). Nyere rapporter fremhever akkumulering av naftalenkonsentrasjoner i akvifersedimenter, grunnvann og jord i undergrunnen, vadosesoner og elveleier, noe som tyder på bioakkumulering i miljøet (Duttagupta et al., 2019, 2020). Tabell 2 oppsummerer de fysisk-kjemiske egenskapene, anvendelsene og helseeffektene av naftalen og dets derivater. Sammenlignet med andre høymolekylære PAH-er er naftalen og dets derivater mindre hydrofobe, mer vannløselige og vidt distribuert i økosystemer, så de brukes ofte som modellsubstrater for å studere metabolismen, genetikken og det metabolske mangfoldet til PAH-er. Et stort antall mikroorganismer er i stand til å metabolisere naftalen og dets derivater, og omfattende informasjon er tilgjengelig om deres metabolske veier, enzymer og regulatoriske egenskaper (Mallick et al., 2011; Phale et al., 2019, 2020). I tillegg er naftalen og dets derivater utpekt som prototypeforbindelser for vurdering av miljøforurensning på grunn av deres høye forekomst og biotilgjengelighet. Det amerikanske miljøvernbyrået (EPA) anslår at gjennomsnittlige nivåer av naftalen er 5,19 μg per kubikkmeter fra sigarettrøyk, hovedsakelig fra ufullstendig forbrenning, og 7,8 til 46 μg fra sidestrømsrøyk, mens eksponering for kreosot og naftalen er 100 til 10 000 ganger høyere (Preuss et al. 2003). Spesielt naftalen har vist seg å ha arts-, region- og kjønnsspesifikk respiratorisk toksisitet og kreftfremkallende egenskaper. Basert på dyrestudier har Det internasjonale byrået for kreftforskning (IARC) klassifisert naftalen som et "mulig kreftfremkallende stoff for mennesker" (gruppe 2B)1. Eksponering for substituerte naftalener, primært ved inhalasjon eller parenteral (oral) administrering, forårsaker lungevevsskade og øker forekomsten av lungesvulster hos rotter og mus (National Toxicology Program 2). Akutte effekter inkluderer kvalme, oppkast, magesmerter, diaré, hodepine, forvirring, kraftig svetting, feber, takykardi, osv. På den annen side har det bredspektrede karbamat-insekticidet karbaryl (1-naftyl N-metylkarbamat) blitt rapportert å være giftig for vannlevende virvelløse dyr, amfibier, honningbier og mennesker, og har vist seg å hemme acetylkolinesterase og forårsake lammelse (Smulders et al., 2003; Bulen og Distel, 2011). Derfor er det avgjørende å forstå mekanismene for mikrobiell nedbrytning, genetisk regulering, enzymatiske og cellulære reaksjoner for å utvikle bioremedieringsstrategier i forurensede miljøer.
Tabell 2. Detaljert informasjon om de fysisk-kjemiske egenskapene, bruksområdene, identifikasjonsmetodene og tilhørende sykdommer for naftalen og dets derivater.
I forurensede nisjer kan hydrofobe og lipofile aromatiske forurensninger forårsake en rekke cellulære effekter på miljømikrobiomet (samfunnet), som endringer i membranfluiditet, membranpermeabilitet, hevelse i lipid-dobbeltlaget, forstyrrelse av energioverføring (elektrontransportkjede/protonmotivkraft) og aktiviteten til membranassosierte proteiner (Sikkema et al., 1995). I tillegg genererer noen løselige mellomprodukter som katekoler og kinoner reaktive oksygenarter (ROS) og danner addukter med DNA og proteiner (Penning et al., 1999). Dermed utøver forekomsten av slike forbindelser i økosystemer et selektivt press på mikrobielle samfunn for å bli effektive nedbrytere på ulike fysiologiske nivåer, inkludert opptak/transport, intracellulær transformasjon, assimilering/utnyttelse og kompartmentalisering.
Et søk i Ribosomal Database Project-II (RDP-II) avdekket at totalt 926 bakteriearter ble isolert fra medier eller anrikningskulturer forurenset med naftalen eller dets derivater. Proteobacteria-gruppen hadde det høyeste antallet representanter (n = 755), etterfulgt av Firmicutes (52), Bacteroidetes (43), Actinobacteria (39), Tenericutes (10) og uklassifiserte bakterier (8) (figur 2). Representanter for γ-Proteobacteria (Pseudomonadales og Xanthomonadales) dominerte alle gramnegative grupper med høyt G+C-innhold (54 %), mens Clostridiales og Bacillales (30 %) var grampositive grupper med lavt G+C-innhold. Pseudomonas (det høyeste antallet, 338 arter) ble rapportert å være i stand til å bryte ned naftalen og dets metylderivater i ulike forurensede økosystemer (kulltjære, petroleum, råolje, slam, oljesøl, avløpsvann, organisk avfall og deponier) samt i intakte økosystemer (jord, elver, sedimenter og grunnvann) (figur 2). Videre viste anrikningsstudier og metagenomisk analyse av noen av disse regionene at udyrkede Legionella- og Clostridium-arter kan ha nedbrytningskapasitet, noe som indikerer behovet for å dyrke disse bakteriene for å studere nye veier og metabolsk mangfold.
Fig. 2. Taksonomisk mangfold og økologisk fordeling av bakterielle representanter i miljøer forurenset med naftalen og naftalenderivater.
Blant de ulike mikroorganismene som bryter ned aromatiske hydrokarboner, er de fleste i stand til å bryte ned naftalen som eneste kilde til karbon og energi. Hendelsesforløpet involvert i naftalenmetabolismen er beskrevet for Pseudomonas sp. (stammer: NCIB 9816-4, G7, AK-5, PMD-1 og CSV86), Pseudomonas stutzeri AN10, Pseudomonas fluorescens PC20 og andre stammer (ND6 og AS1) (Mahajan et al., 1994; Resnick et al., 1996; Annweiler et al., 2000; Basu et al., 2003; Dennis og Zylstra, 2004; Sota et al., 2006); Metabolismen initieres av en multikomponent dioksygenase [naftalendioksygenase (NDO), en ringhydroksylerende dioksygenase] som katalyserer oksidasjonen av en av de aromatiske ringene i naftalen ved bruk av molekylært oksygen som det andre substratet, og omdanner naftalen til cis-naftalendiol (figur 3). Cis-dihydrodiol omdannes til 1,2-dihydroksynaftalen av en dehydrogenase. En ringspaltende dioksygenase, 1,2-dihydroksynaftalendioksygenase (12DHNDO), omdanner 1,2-dihydroksynaftalen til 2-hydroksykromen-2-karboksylsyre. Enzymatisk cis-trans-isomerisering produserer trans-o-hydroksybenzylidenpyruvat, som spaltes av hydratase-aldolase til salisylaldehyd og pyruvat. Den organiske syren pyruvat var den første C3-forbindelsen som ble avledet fra naftalenkarbonskjelettet og dirigert inn i den sentrale karbonveien. I tillegg omdanner NAD+-avhengig salisylaldehyddehydrogenase salisylaldehyd til salisylsyre. Metabolisme på dette stadiet kalles den "øvre veien" for naftalennedbrytning. Denne veien er svært vanlig i de fleste naftalennedbrytende bakterier. Det finnes imidlertid noen få unntak; for eksempel, i den termofile Bacillus hamburgii 2, initieres naftalennedbrytning av naftalen-2,3-dioksygenase til danner 2,3-dihydroksynaftalen (Annweiler et al., 2000).
Figur 3. Nedbrytningsveier for naftalen, metylnaftalen, naftosyre og karbaryl. Sirklede tall representerer enzymer som er ansvarlige for den sekvensielle omdannelsen av naftalen og dets derivater til påfølgende produkter. 1 — naftalendioksygenase (NDO); 2, cis-dihydrodioldehydrogenase; 3, 1,2-dihydroksynaftalendioksygenase; 4, 2-hydroksykromen-2-karboksylsyreisomerase; 5, trans-O-hydroksybenzylidenpyruvathydratase-aldolase; 6, salisylaldehyddehydrogenase; 7, salisylat-1-hydroksylase; 8, katekol-2,3-dioksygenase (C23DO); 9, 2-hydroksymukonatsemialdehyddehydrogenase; 10, 2-oksopent-4-enoathydratase; 11, 4-hydroksy-2-oksopentanoat-aldolase; 12, acetaldehyddehydrogenase; 13, katekol-1,2-dioksygenase (C12DO); 14, mukonat-cykloisomerase; 15, mukonolakton delta-isomerase; 16, β-ketoadipatenolaktonhydrolase; 17, β-ketoadipat-succinyl-CoA-transferase; 18, β-ketoadipat-CoA-tiolase; 19, succinyl-CoA: acetyl-CoA-succinyltransferase; 20, salicylat-5-hydroksylase; 21 – gentisat 1,2-dioksygenase (GDO); 22, maleylpyruvatisomerase; 23, fumarylpyruvathydrolase; 24, metylnaftalenhydroksylase (NDO); 25, hydroksymetylnaftalendehydrogenase; 26, naftaldehyddehydrogenase; 27, 3-formylsalisylsyreoksidase; 28, hydroksyisoftalatdekarboksylase; 29, karbarylhydrolase (CH); 30, 1-naftol-2-hydroksylase.
Avhengig av organismen og dens genetiske sammensetning, metaboliseres den resulterende salisylsyren videre enten via katekolveien ved bruk av salisylat 1-hydroksylase (S1H) eller via gentisatveien ved bruk av salisylat 5-hydroksylase (S5H) (figur 3). Siden salisylsyre er det viktigste mellomproduktet i naftalenmetabolismen (øvre vei), blir trinnene fra salisylsyre til TCA-mellomproduktet ofte referert til som den nedre veien, og genene er organisert i et enkelt operon. Det er vanlig å se at genene i det øvre vei-operonet (nah) og det nedre vei-operonet (sal) reguleres av felles regulatoriske faktorer; for eksempel fungerer NahR og salisylsyre som indusere, slik at begge operonene kan metabolisere naftalen fullstendig (Phale et al., 2019, 2020).
I tillegg spaltes katekol syklisk til 2-hydroksymukonatsemialdehyd via meta-signalveien av katekol 2,3-dioksygenase (C23DO) (Yen et al., 1988) og hydrolyseres videre av 2-hydroksymukonatsemialdehydhydrolase for å danne 2-hydroksypent-2,4-diensyre. 2-hydroksypent-2,4-dienoat omdannes deretter til pyruvat og acetaldehyd av en hydratase (2-oksopent-4-enoathydratase) og en aldolase (4-hydroksy-2-oksopentanoat-aldolase) og går deretter inn i den sentrale karbonsignalveien (figur 3). Alternativt spaltes katekol syklisk til cis,cis-mukonat via orto-signalveien av katekol 1,2-oksygenase (C12DO). Mukonat-cykloisomerase, mukonolaktonisomerase og β-ketoadipat-nollaktonhydrolase omdanner cis,cis-mukonat til 3-oksoadipat, som går inn i den sentrale karbonveien via succinyl-CoA og acetyl-CoA (Nozaki et al., 1968) (figur 3).
I gentisatveien (2,5-dihydroksybenzoat) spaltes den aromatiske ringen av gentisat 1,2-dioksygenase (GDO) for å danne maleylpyruvat. Dette produktet kan hydrolyseres direkte til pyruvat og malat, eller det kan isomeriseres for å danne fumarylpyruvat, som deretter kan hydrolyseres til pyruvat og fumarat (Larkin og Day, 1986). Valget av den alternative veien har blitt observert i både gramnegative og grampositive bakterier på biokjemisk og genetisk nivå (Morawski et al., 1997; Whyte et al., 1997). Gramnegative bakterier (Pseudomonas) foretrekker å bruke salisylsyre, som er en induser av naftalenmetabolisme, og dekarboksylerer den til katekol ved hjelp av salisylat 1-hydroksylase (Gibson og Subramanian, 1984). På den annen side, i grampositive bakterier (Rhodococcus), omdanner salisylat 5-hydroksylase salisylsyre til gentisinsyre, mens salisylsyre ikke har noen induktiv effekt på transkripsjonen av naftalen-gener (Grund et al., 1992) (figur 3).
Det har blitt rapportert at arter som Pseudomonas CSV86, Oceanobacterium NCE312, Marinhomonas naphthotrophicus, Sphingomonas paucimobilis 2322, Vibrio cyclotrophus, Pseudomonas fluorescens LP6a, Pseudomonas og Mycobacterium kan bryte ned monometylnaftalen eller dimetylnaftalen (Dean-Raymond og Bartha, 1975; Cane og Williams, 1982; Mahajan et al., 1994; Dutta et al., 1998; Hedlund et al., 1999). Blant dem har nedbrytningsveien for 1-metylnaftalen og 2-metylnaftalen til Pseudomonas sp. CSV86 blitt tydelig studert på biokjemisk og enzymatisk nivå (Mahajan et al., 1994). 1-metylnaftalen metaboliseres via to veier. Først hydroksyleres den aromatiske ringen (den usubstituerte ringen til metylnaftalen) for å danne cis-1,2-dihydroksy-1,2-dihydro-8-metylnaftalen, som oksideres videre til metylsalisylat og metylkatekol, og deretter går inn i den sentrale karbonveien etter ringspalting (figur 3). Denne veien kalles "karbonkildeveien". I den andre "avgiftningsveien" kan metylgruppen hydroksyleres av NDO for å danne 1-hydroksymetylnaftalen, som oksideres videre til 1-naftosyre og skilles ut i kulturmediet som et blindveiprodukt. Studier har vist at stammen CSV86 ikke er i stand til å vokse på 1- og 2-naftosyre som eneste karbon- og energikilde, noe som bekrefter dens avgiftningsvei (Mahajan et al., 1994; Basu et al., 2003). I 2-metylnaftalen gjennomgår metylgruppen hydroksylering av hydroksylase for å danne 2-hydroksymetylnaftalen. I tillegg gjennomgår den usubstituerte ringen i naftalenringen ringhydroksylering for å danne en dihydrodiol, som oksideres til 4-hydroksymetylkatekol i en serie enzymkatalyserte reaksjoner og går inn i den sentrale karbonveien via meta-ringspaltingsveien. Tilsvarende ble det rapportert at S. paucimobilis 2322 bruker NDO til å hydroksylere 2-metylnaftalen, som videre oksideres for å danne metylsalisylat og metylkatekol (Dutta et al., 1998).
Naftosyrer (substituerte/usubstituerte) er biprodukter fra avgiftning/biotransformasjon som dannes under nedbrytningen av metylnaftalen, fenantren og antracen, og som frigjøres til det brukte kulturmediet. Det har blitt rapportert at jordisolatet Stenotrophomonas maltophilia CSV89 er i stand til å metabolisere 1-naftosyre som en karbonkilde (Phale et al., 1995). Metabolismen begynner med dihydroksylering av den aromatiske ringen for å danne 1,2-dihydroksy-8-karboksynaftalen. Den resulterende diolen oksideres til katekol via 2-hydroksy-3-karboksybenzylidenpyruvat, 3-formylsalisylsyre, 2-hydroksyisoftalsyre og salisylsyre, og går inn i den sentrale karbonveien via meta-ring-spaltingsveien (figur 3).
Karbaryl er et plantevernmiddel som inneholder naftylkarbamat. Siden den grønne revolusjonen i India på 1970-tallet har bruken av kunstgjødsel og plantevernmidler ført til en økning i utslipp av polysykliske aromatiske hydrokarboner (PAH) fra ikke-punktkilder i landbruket (Pingali, 2012; Duttagupta et al., 2020). Anslagsvis 55 % (85 722 000 hektar) av det totale jordbruksarealet i India behandles med kjemiske plantevernmidler. I løpet av de siste fem årene (2015–2020) har den indiske landbrukssektoren brukt i gjennomsnitt 55 000 til 60 000 tonn plantevernmidler årlig (Department of Cooperatives and Farmers Welfare, Ministry of Agriculture, Government of India, august 2020). I de nordlige og sentrale Gangesslettene (statene med høyest befolkning og befolkningstetthet) er bruken av plantevernmidler på avlinger utbredt, med insektmidler som dominerer. Karbaryl (1-naftyl-N-metylkarbamat) er et bredspektret, moderat til svært giftig karbamat-insektmiddel som brukes i indisk landbruk med en gjennomsnittlig mengde på 100–110 tonn. Det selges vanligvis under handelsnavnet Sevin og brukes til å kontrollere insekter (bladlus, ildmaur, lopper, midd, edderkopper og mange andre utendørs skadedyr) som påvirker en rekke avlinger (mais, soyabønner, bomull, frukt og grønnsaker). Noen mikroorganismer som Pseudomonas (NCIB 12042, 12043, C4, C5, C6, C7, Pseudomonas putida XWY-1), Rhodococcus (NCIB 12038), Sphingobacterium spp. (CF06), Burkholderia (C3), Micrococcus og Arthrobacter kan også brukes til å kontrollere andre skadedyr. Det har blitt rapportert at RC100 kan bryte ned karbaryl (Larkin og Day, 1986; Chapalamadugu og Chaudhry, 1991; Hayatsu et al., 1999; Swetha og Phale, 2005; Trivedi et al., 2017). Nedbrytningsveien til karbaryl har blitt grundig studert på biokjemiske, enzymatiske og genetiske nivåer i jordisolater av Pseudomonas sp.-stammene C4, C5 og C6 (Swetha og Phale, 2005; Trivedi et al., 2016) (fig. 3). Metabolismen starter med hydrolyse av esterbindingen av karbarylhydrolase (CH4) for å danne 1-naftol, metylamin og karbondioksid. 1-naftol omdannes deretter til 1,2-dihydroksynaftalen av 1-naftolhydroksylase (1-NH), som metaboliseres videre via den sentrale karbonveien via salisylat og gentisat. Noen karbarylnedbrytende bakterier har vist seg å metabolisere den til salisylsyre via spalting av katekol-orto-ringen (Larkin og Day, 1986; Chapalamadugu og Chaudhry, 1991). Det er verdt å merke seg at naftalennedbrytende bakterier primært metaboliserer salisylsyre via katekol, mens karbarylnedbrytende bakterier foretrekker å metabolisere salisylsyre via gentisatveien.
Naftalensulfonsyre/disulfonsyre og naftylaminsulfonsyrederivater kan brukes som mellomprodukter i produksjonen av azofargestoffer, fuktemidler, dispergeringsmidler osv. Selv om disse forbindelsene har lav toksisitet for mennesker, har cytotoksisitetsvurderinger vist at de er dødelige for fisk, dafnier og alger (Greim et al., 1994). Representanter for slekten Pseudomonas (stammene A3, C22) har vist seg å starte metabolisme ved dobbel hydroksylering av den aromatiske ringen som inneholder sulfonsyregruppen for å danne en dihydrodiol, som videre omdannes til 1,2-dihydroksynaftalen ved spontan spalting av sulfittgruppen (Brilon et al., 1981). Den resulterende 1,2-dihydroksynaftalen kataboliseres via den klassiske naftalenveien, dvs. katekol- eller gentisatveien (figur 4). Det har blitt vist at aminonaftalensulfonsyre og hydroksynaftalensulfonsyre kan brytes ned fullstendig av blandede bakterielle konsortier med komplementære katabolske veier (Nortemann et al., 1986). Det har blitt vist at ett medlem av konsortiet avsvovler aminonaftalensulfonsyre eller hydroksynaftalensulfonsyre ved 1,2-dioksygenering, mens aminosalicylat eller hydroksysalisylat frigjøres til kulturmediet som en blindveimetabolitt og deretter tas opp av andre medlemmer av konsortiet. Naftalendisulfonsyre er relativt polar, men dårlig biologisk nedbrytbar og kan derfor metaboliseres via forskjellige veier. Den første avsvovlingen skjer under regioselektiv dihydroksylering av den aromatiske ringen og sulfonsyregruppen; Den andre avsvovlingen skjer under hydroksylering av 5-sulfosalicylsyre av salisylsyre-5-hydroksylase for å danne gentisinsyre, som går inn i den sentrale karbonveien (Brilon et al., 1981) (figur 4). Enzymene som er ansvarlige for nedbrytning av naftalen er også ansvarlige for metabolismen av naftalensulfonat (Brilon et al., 1981; Keck et al., 2006).
Figur 4. Metabolske veier for nedbrytning av naftalensulfonat. Tallene i sirklene representerer enzymene som er ansvarlige for metabolismen av naftylsulfonat, lik/identiske med enzymene beskrevet i FIG. 3.
Lavmolekylære PAH-er (LMW-PAH-er) er reduserbare, hydrofobe og dårlig løselige, og derfor ikke utsatt for naturlig nedbrytning/degradering. Aerobe mikroorganismer er imidlertid i stand til å oksidere dem ved å absorbere molekylært oksygen (O2). Disse enzymene tilhører hovedsakelig klassen oksidoreduktaser og kan utføre forskjellige reaksjoner som aromatisk ringhydroksylering (mono- eller dihydroksylering), dehydrogenering og aromatisk ringspalting. Produktene som oppnås fra disse reaksjonene har en høyere oksidasjonstilstand og metaboliseres lettere gjennom den sentrale karbonveien (Phale et al., 2020). Enzymene i nedbrytningsveien har vist seg å være induserbare. Aktiviteten til disse enzymene er svært lav eller ubetydelig når celler dyrkes på enkle karbonkilder som glukose eller organiske syrer. Tabell 3 oppsummerer de forskjellige enzymene (oksygenaser, hydrolaser, dehydrogenaser, oksidaser, etc.) som er involvert i metabolismen av naftalen og dets derivater.
Tabell 3. Biokjemiske egenskaper ved enzymer som er ansvarlige for nedbrytningen av naftalen og dets derivater.
Radioisotopstudier (18O2) har vist at inkorporering av molekylært O2 i aromatiske ringer av oksygenaser er det viktigste trinnet i å aktivere videre biologisk nedbrytning av en forbindelse (Hayaishi et al., 1955; Mason et al., 1955). Inkorporering av ett oksygenatom (O) fra molekylært oksygen (O2) i substratet initieres av enten endogene eller eksogene monooksygenaser (også kalt hydroksylaser). Et annet oksygenatom reduseres til vann. Eksogene monooksygenaser reduserer flavin med NADH eller NADPH, mens flavin i endomonooksygenaser reduseres av substratet. Hydroksyleringsposisjonen resulterer i mangfold i produktdannelse. For eksempel hydroksylerer salisylat 1-hydroksylase salisylsyre i C1-posisjonen og danner katekol. På den annen side hydroksylerer multikomponentssalicylat 5-hydroksylasen (som inneholder reduktase-, ferredoksin- og oksygenase-subenheter) salisylsyre i C5-posisjonen og danner gentisinsyre (Yamamoto et al., 1965).
Dioksygenaser inkorporerer to O2-atomer i substratet. Avhengig av hvilke produkter som dannes, deles de inn i ringhydroksylerende dioksygenaser og ringspaltende dioksygenaser. Ringhydroksylerende dioksygenaser omdanner aromatiske substrater til cis-dihydrodioler (f.eks. naftalen) og er utbredt blant bakterier. Til dags dato har det blitt vist at organismer som inneholder ringhydroksylerende dioksygenaser er i stand til å vokse på ulike aromatiske karbonkilder, og disse enzymene er klassifisert som NDO (naftalen), toluendioksygenase (TDO, toluen) og bifenyldioksygenase (BPDO, bifenyl). Både NDO og BPDO kan katalysere dobbeltoksidasjon og sidekjedehydroksylering av forskjellige polysykliske aromatiske hydrokarboner (toluen, nitrotoluen, xylen, etylbenzen, naftalen, bifenyl, fluoren, indol, metylnaftalen, naftalensulfonat, fenantren, antracen, acetofenon, etc.) (Boyd og Sheldrake, 1998; Phale et al., 2020). NDO er et flerkomponentsystem som består av en oksidoreduktase, et ferredoksin og en aktiv seteholdig oksygenasekomponent (Gibson og Subramanian, 1984; Resnick et al., 1996). Den katalytiske enheten til NDO består av en stor α-underenhet og en liten β-underenhet arrangert i en α3β3-konfigurasjon. NDO tilhører en stor familie av oksygenaser, og dens α-subenhet inneholder et Rieske-sete [2Fe-2S] og et mononukleært ikke-hemjern, som bestemmer substratspesifisiteten til NDO (Parales et al., 1998). Typisk overføres to elektroner fra reduksjonen av pyridinnukleotid i én katalytisk syklus til Fe(II)-ionet i det aktive setet via en reduktase, et ferredoksin og et Rieske-sete. De reduserende ekvivalentene aktiverer molekylært oksygen, som er en forutsetning for substratdihydroksylering (Ferraro et al., 2005). Til dags dato har bare noen få NDO-er blitt renset og karakterisert i detalj fra forskjellige stammer, og den genetiske kontrollen av veiene involvert i naftalen-nedbrytning har blitt studert i detalj (Resnick et al., 1996; Parales et al., 1998; Karlsson et al., 2003). Ringspaltende dioksygenaser (endo- eller orto-ringspaltende enzymer og eksodiol- eller meta-ringspaltende enzymer) virker på hydroksylerte aromatiske forbindelser. For eksempel er den orto-ringspaltende dioksygenasen katekol-1,2-dioksygenase, mens den meta-ringspaltende dioksygenasen er katekol-2,3-dioksygenase (Kojima et al., 1961; Nozaki et al., 1968). I tillegg til forskjellige oksygenaser finnes det også forskjellige dehydrogenaser som er ansvarlige for dehydrogeneringen av aromatiske dihydrodioler, alkoholer og aldehyder, og som bruker NAD+/NADP+ som elektronakseptorer, som er noen av de viktige enzymene involvert i metabolismen (Gibson og Subramanian, 1984; Shaw og Harayama, 1990; Fahle et al., 2020).
Enzymer som hydrolaser (esteraser, amidaser) er en annen viktig klasse enzymer som bruker vann til å spalte kovalente bindinger og viser bred substratspesifisitet. Karbarylhydrolase og andre hydrolaser anses å være komponenter i periplasmaet (transmembranen) hos medlemmer av gramnegative bakterier (Kamini et al., 2018). Karbaryl har både en amid- og en esterbinding; derfor kan den hydrolyseres av enten esterase eller amidase for å danne 1-naftol. Karbaryl i Rhizobium rhizobium-stammen AC10023 og Arthrobacter-stammen RC100 har blitt rapportert å fungere som henholdsvis en esterase og amidase. Karbaryl i Arthrobacter-stammen RC100 fungerer også som en amidase. RC100 har vist seg å hydrolysere fire insektmidler av N-metylkarbamatklassen som karbaryl, metomyl, mefenaminsyre og XMC (Hayaatsu et al., 2001). Det ble rapportert at CH i Pseudomonas sp. C5pp kan virke på karbaryl (100 % aktivitet) og 1-naftylacetat (36 % aktivitet), men ikke på 1-naftylacetamid, noe som indikerer at det er en esterase (Trivedi et al., 2016).
Biokjemiske studier, enzymreguleringsmønstre og genetisk analyse har vist at naftalen-nedbrytningsgenene består av to induserbare regulatoriske enheter eller "operoner": nah ("oppstrømsveien", som omdanner naftalen til salisylsyre) og sal ("nedstrømsveien", som omdanner salisylsyre til den sentrale karbonveien via katekol). Salisylsyre og dens analoger kan fungere som indusere (Shamsuzzaman og Barnsley, 1974). I nærvær av glukose eller organiske syrer undertrykkes operonet. Figur 5 viser den komplette genetiske organiseringen av naftalen-nedbrytning (i operonform). Flere navngitte varianter/former av nah-genet (ndo/pah/dox) er beskrevet og funnet å ha høy sekvenshomologi (90 %) blant alle Pseudomonas-arter (Abbasian et al., 2016). Genene til naftalen-oppstrømsveien var generelt ordnet i en konsensusrekkefølge som vist i figur 5A. Et annet gen, nahQ, ble også rapportert å være involvert i naftalenmetabolisme og var vanligvis lokalisert mellom nahC og nahE, men dets faktiske funksjon gjenstår å avklare. Tilsvarende ble nahY-genet, ansvarlig for naftalensensitiv kjemotaksi, funnet i den distale enden av nah-operonet hos noen medlemmer. I Ralstonia sp. ble U2-genet som koder for glutation S-transferase (gsh) funnet å være lokalisert mellom nahAa og nahAb, men påvirket ikke naftalenutnyttelsesegenskapene (Zylstra et al., 1997).
Figur 5. Genetisk organisering og mangfold observert under nedbrytning av naftalen blant bakteriearter; (A) Øvre naftalenvei, metabolisme av naftalen til salisylsyre; (B) Nedre naftalenvei, salisylsyre via katekol til den sentrale karbonveien; (C) salisylsyre via gentisat til den sentrale karbonveien.
Den «nedre signalveien» (sal-operonet) består vanligvis av nahGTHINLMOKJ og omdanner salisylat til pyruvat og acetaldehyd via katekolmetariseringsspaltingsveien. nahG-genet (som koder for salisylathydroksylase) ble funnet å være konservert i den proksimale enden av operonet (fig. 5B). Sammenlignet med andre naftalen-nedbrytende stammer er nah- og sal-operonene tandem og svært nært beslektet (ca. 7,5 kb) i P. putida CSV86. I noen gramnegative bakterier, som Ralstonia sp. U2, Polaramonas naphthalenivorans CJ2 og P. putida AK5, metaboliseres naftalen som en sentral karbonmetabolitt via gentisatveien (i form av sgp/nag-operonet). Genkassetten er vanligvis representert i formen nagAaGHAbAcAdBFCQEDJI, hvor nagR (som koder for en LysR-type regulator) er plassert i den øvre enden (figur 5C).
Karbaryl går inn i den sentrale karbonsyklusen via metabolismen av 1-naftol, 1,2-dihydroksynaftalen, salisylsyre og gentisinsyre (figur 3). Basert på genetiske og metabolske studier har det blitt foreslått å dele denne karbonveien inn i «oppstrøms» (konvertering av karbaryl til salisylsyre), «midtre» (konvertering av salisylsyre til gentisinsyre) og «nedstrøms» (konvertering av gentisinsyre til mellomprodukter i den sentrale karbonveien) (Singh et al., 2013). Genomisk analyse av C5pp (supercontig A, 76,3 kb) viste at mcbACBDEF-genet er involvert i omdannelsen av karbaryl til salisylsyre, etterfulgt av mcbIJKL i omdannelsen av salisylsyre til gentisinsyre, og mcbOQP i omdannelsen av gentisinsyre til sentrale karbonmellomprodukter (fumarat og pyruvat, Trivedi et al., 2016) (figur 6).
Det har blitt rapportert at enzymer involvert i nedbrytningen av aromatiske hydrokarboner (inkludert naftalen og salisylsyre) kan induseres av de tilsvarende forbindelsene og hemmes av enkle karbonkilder som glukose eller organiske syrer (Shingler, 2003; Phale et al., 2019, 2020). Blant de ulike metabolske veiene til naftalen og dets derivater, har de regulatoriske egenskapene til naftalen og karbaryl blitt studert i en viss grad. For naftalen reguleres gener i både oppstrøms og nedstrøms veier av NahR, en transaktiv positiv regulator av LysR-typen. Den er nødvendig for induksjon av nah-genet av salisylsyre og dens påfølgende høynivåekspresjon (Yen og Gunsalus, 1982). Videre har studier vist at integrerende vertsfaktor (IHF) og XylR (sigma 54-avhengig transkripsjonsregulator) også er kritiske for transkripsjonsaktivering av gener i naftalenmetabolisme (Ramos et al., 1997). Studier har vist at enzymer i katekol-meta-ringåpningsveien, nemlig katekol 2,3-dioksygenase, induseres i nærvær av naftalen og/eller salisylsyre (Basu et al., 2006). Studier har vist at enzymer i katekol-orto-ringåpningsveien, nemlig katekol 1,2-dioksygenase, induseres i nærvær av benzosyre og cis,cis-mukonat (Parsek et al., 1994; Tover et al., 2001).
I stamme C5pp koder fem gener, mcbG, mcbH, mcbN, mcbR og mcbS, for regulatorer som tilhører LysR/TetR-familien av transkripsjonsregulatorer som er ansvarlige for å kontrollere karbarylnedbrytning. Det homologe genet mcbG ble funnet å være nærmest beslektet med LysR-type regulatoren PhnS (58 % aminosyreidentitet) involvert i fenantrenmetabolisme i Burkholderia RP00725 (Trivedi et al., 2016). McbH-genet ble funnet å være involvert i den mellomliggende signalveien (konvertering av salisylsyre til gentisinsyre) og tilhører LysR-type transkripsjonsregulatoren NagR/DntR/NahR i Pseudomonas og Burkholderia. Medlemmer av denne familien ble rapportert å gjenkjenne salisylsyre som et spesifikt effektormolekyl for induksjon av nedbrytningsgener. På den annen side ble tre gener, mcbN, mcbR og mcbS, som tilhører transkripsjonsregulatorer av typen LysR og TetR, identifisert i nedstrømsbanen (metabolitter i gentisat-sentrale karbonbane).
Hos prokaryoter er horisontale genoverføringsprosesser (erverv, utveksling eller overføring) via plasmider, transposoner, profager, genomiske øyer og integrerende konjugative elementer (ICE) viktige årsaker til plastisitet i bakterielle genomer, noe som fører til gevinst eller tap av spesifikke funksjoner/egenskaper. Dette lar bakterier raskt tilpasse seg forskjellige miljøforhold, noe som gir potensielle adaptive metabolske fordeler for verten, som nedbrytning av aromatiske forbindelser. Metabolske endringer oppnås ofte gjennom finjustering av nedbrytningsoperoner, deres reguleringsmekanismer og enzymspesifisiteter, noe som letter nedbrytningen av et bredere spekter av aromatiske forbindelser (Nojiri et al., 2004; Phale et al., 2019, 2020). Genkassettene for naftalennedbrytning har vist seg å være lokalisert på en rekke mobile elementer som plasmider (konjugative og ikke-konjugative), transposoner, genomer, ICE-er og kombinasjoner av forskjellige bakteriearter (figur 5). I Pseudomonas G7 transkriberes nah- og sal-operonene til plasmid NAH7 i samme orientering og er en del av et defekt transposon som krever transposase Tn4653 for mobilisering (Sota et al., 2006). I Pseudomonas-stammen NCIB9816-4 ble genet funnet på det konjugative plasmidet pDTG1 som to operoner (omtrent 15 kb fra hverandre) som ble transkribert i motsatte retninger (Dennis og Zylstra, 2004). I Pseudomonas putida-stammen AK5 koder det ikke-konjugative plasmidet pAK5 for enzymet som er ansvarlig for naftalennedbrytning via gentisatveien (Izmalkova et al., 2013). I Pseudomonas-stammen PMD-1 er nah-operonet lokalisert på kromosomet, mens sal-operonet er lokalisert på det konjugative plasmidet pMWD-1 (Zuniga et al., 1981). I Pseudomonas stutzeri AN10 er imidlertid alle naftalen-nedbrytningsgener (nah- og sal-operoner) lokalisert på kromosomet og rekrutteres antagelig gjennom transposisjon, rekombinasjon og omorganisering (Bosch et al., 2000). I Pseudomonas sp. CSV86 er nah- og sal-operonene lokalisert i genomet i form av ICE (ICECSV86). Strukturen er beskyttet av tRNAGly etterfulgt av direkte repetisjoner som indikerer rekombinasjons-/festesteder (attR og attL) og en faglignende integrase lokalisert i begge ender av tRNAGly, og dermed strukturelt lik ICEclc-elementet (ICEclcB13 i Pseudomonas knackmusii for klorokatekol-nedbrytning). Det har blitt rapportert at gener på ICE kan overføres ved konjugering med en ekstremt lav overføringsfrekvens (10-8), og dermed overføre nedbrytningsegenskaper til mottakeren (Basu og Phale, 2008; Phale et al., 2019).
De fleste genene som er ansvarlige for nedbrytning av karbaryl er lokalisert på plasmider. Arthrobacter sp. RC100 inneholder tre plasmider (pRC1, pRC2 og pRC300), hvorav to konjugative plasmider, pRC1 og pRC2, koder for enzymene som omdanner karbaryl til gentisat. På den annen side er enzymene som er involvert i omdannelsen av gentisat til de sentrale karbonmetabolittene lokalisert på kromosomet (Hayaatsu et al., 1999). Bakterier av slekten Rhizobium. Stamme AC100, brukt for omdannelse av karbaryl til 1-naftol, inneholder plasmid pAC200, som bærer cehA-genet som koder for CH som en del av Tnceh-transposonet omgitt av innsettingselementlignende sekvenser (istA og istB) (Hashimoto et al., 2002). I Sphingomonas-stammen CF06 antas karbaryl-nedbrytningsgenet å være tilstede i fem plasmider: pCF01, pCF02, pCF03, pCF04 og pCF05. DNA-homologien til disse plasmidene er høy, noe som indikerer eksistensen av en genduplikasjonshendelse (Feng et al., 1997). I en karbaryl-nedbrytende symbiont bestående av to Pseudomonas-arter inneholder stammen 50581 et konjugativt plasmid pCD1 (50 kb) som koder for mcd-karbarylhydrolasegenet, mens det konjugative plasmidet i stammen 50552 koder for et 1-naftol-nedbrytende enzym (Chapalamadugu og Chaudhry, 1991). I Achromobacter-stammen WM111 er mcd-furadanhydrolasegenet lokalisert på et 100 kb plasmid (pPDL11). Dette genet har vist seg å være tilstede på forskjellige plasmider (100, 105, 115 eller 124 kb) i forskjellige bakterier fra forskjellige geografiske regioner (Parekh et al., 1995). I Pseudomonas sp. C5pp er alle gener som er ansvarlige for karbarylnedbrytning lokalisert i et genom som strekker seg over 76,3 kb sekvens (Trivedi et al., 2016). Genomanalyse (6,15 Mb) avdekket tilstedeværelsen av 42 MGE-er og 36 GEI-er, hvorav 17 MGE-er var lokalisert i supercontig A (76,3 kb) med et gjennomsnittlig asymmetrisk G+C-innhold (54–60 mol%), noe som tyder på mulige horisontale genoverføringshendelser (Trivedi et al., 2016). P. putida XWY-1 viser et lignende arrangement av karbarylnedbrytende gener, men disse genene er lokalisert på et plasmid (Zhu et al., 2019).
I tillegg til metabolsk effektivitet på biokjemiske og genomiske nivåer, viser mikroorganismer også andre egenskaper eller responser som kjemotaksi, egenskaper for modifisering av celleoverflaten, kompartmentalisering, preferensiell utnyttelse, produksjon av biosurfaktanter, etc., som hjelper dem med å metabolisere aromatiske forurensninger mer effektivt i forurensede miljøer (figur 7).
Figur 7. Ulike cellulære responsstrategier hos ideelle aromatiske hydrokarbonnedbrytende bakterier for effektiv biologisk nedbrytning av fremmede forurensende forbindelser.
Kjemotaktiske responser anses å være faktorer som forsterker nedbrytningen av organiske forurensninger i heterogent forurensede økosystemer. (2002) viste at kjemotaksi av Pseudomonas sp. G7 til naftalen økte nedbrytningshastigheten for naftalen i akvatiske systemer. Villtypestammen G7 degraderte naftalen mye raskere enn en kjemotaksi-defekt mutantstamme. NahY-proteinet (538 aminosyrer med membrantopologi) ble funnet å være ko-transkribert med metakleavage-signalveigenene på NAH7-plasmidet, og i likhet med kjemotaksitransdusere ser dette proteinet ut til å fungere som en kjemoreseptor for nedbrytning av naftalen (Grimm og Harwood 1997). En annen studie av Hansel et al. (2009) viste at proteinet er kjemotaktisk, men nedbrytningshastigheten er høy. (2011) demonstrerte en kjemotaktisk respons fra Pseudomonas (P. putida) på gassformig naftalen, hvor diffusjon i gassfase resulterte i en jevn strøm av naftalen til cellene, noe som kontrollerte den kjemotaktiske responsen til cellene. Forskerne utnyttet denne kjemotaktiske oppførselen til å konstruere mikrober som ville øke nedbrytningshastigheten. Studier har vist at kjemosensoriske veier også regulerer andre cellulære funksjoner som celledeling, cellesyklusregulering og biofilmdannelse, og dermed bidrar til å kontrollere nedbrytningshastigheten. Imidlertid hindres det å utnytte denne egenskapen (kjemotaksi) for effektiv nedbrytning av flere flaskehalser. De største hindringene er: (a) forskjellige paraloge reseptorer gjenkjenner de samme forbindelsene/ligandene; (b) eksistensen av alternative reseptorer, dvs. energisk tropisme; (c) signifikante sekvensforskjeller i de sensoriske domenene til samme reseptorfamilie; og (d) mangel på informasjon om de viktigste bakterielle sensorproteinene (Ortega et al., 2017; Martin-Mora et al., 2018). Noen ganger produserer biologisk nedbrytning av aromatiske hydrokarboner flere metabolitter/mellomprodukter, som kan være kjemotaktiske for én gruppe bakterier, men frastøtende for andre, noe som kompliserer prosessen ytterligere. For å identifisere interaksjonene mellom ligander (aromatiske hydrokarboner) og kjemiske reseptorer, konstruerte vi hybride sensorproteiner (PcaY, McfR og NahY) ved å fusjonere sensor- og signaldomenene til Pseudomonas putida og Escherichia coli, som er rettet mot reseptorene for henholdsvis aromatiske syrer, TCA-mellomprodukter og naftalen (Luu et al., 2019).
Under påvirkning av naftalen og andre polysykliske aromatiske hydrokarboner (PAH-er) gjennomgår strukturen til bakteriemembranen og mikroorganismenes integritet betydelige endringer. Studier har vist at naftalen forstyrrer acylkjedens interaksjon gjennom hydrofobe interaksjoner, og dermed øker membranens hevelse og fluiditet (Sikkema et al., 1995). For å motvirke denne skadelige effekten regulerer bakterier membranfluiditeten ved å endre forholdet og fettsyresammensetningen mellom iso/anteiso forgrenede fettsyrer og isomerisere cis-umettede fettsyrer til de tilsvarende trans-isomerene (Heipieper og de Bont, 1994). I Pseudomonas stutzeri dyrket på naftalenbehandling økte forholdet mellom mettede og umettede fettsyrer fra 1,1 til 2,1, mens i Pseudomonas JS150 økte dette forholdet fra 7,5 til 12,0 (Mrozik et al., 2004). Når Achromobacter KAs 3–5-celler dyrket på naftalen, viste de celleaggregering rundt naftalenkrystaller og en reduksjon i celleoverflateladning (fra -22,5 til -2,5 mV) ledsaget av cytoplasmisk kondensasjon og vakuolisering, noe som indikerer endringer i cellestruktur og celleoverflateegenskaper (Mohapatra et al., 2019). Selv om cellulære/overflatemessige endringer er direkte assosiert med bedre opptak av aromatiske forurensninger, har relevante biotekniske strategier ikke blitt grundig optimalisert. Manipulering av celleform har sjelden blitt brukt for å optimalisere biologiske prosesser (Volke og Nikel, 2018). Sletting av gener som påvirker celledeling forårsaker endringer i cellemorfologi. Sletting av gener som påvirker celledeling forårsaker endringer i cellemorfologi. Hos Bacillus subtilis har celleseptumproteinet SepF vist seg å være involvert i septumdannelse og er nødvendig for påfølgende trinn i celledelingen, men det er ikke et essensielt gen. Sletting av gener som koder for peptidglykanhydrolaser i Bacillus subtilis resulterte i celleforlengelse, økt spesifikk vekstrate og forbedret enzymproduksjonskapasitet (Cui et al., 2018).
Kompartmentalisering av karbarylnedbrytningsveien har blitt foreslått for å oppnå effektiv nedbrytning av Pseudomonas-stammene C5pp og C7 (Kamini et al., 2018). Det foreslås at karbaryl transporteres inn i det periplasmatiske rommet gjennom det ytre membranseptumet og/eller gjennom diffunderbare poriner. CH₄ er et periplasmisk enzym som katalyserer hydrolysen av karbaryl til 1-naftol, som er mer stabil, mer hydrofob og mer giftig. CH₄ er lokalisert i periplasmaet og har lav affinitet for karbaryl, og kontrollerer dermed dannelsen av 1-naftol, og forhindrer dermed akkumulering i celler og reduserer dens toksisitet for celler (Kamini et al., 2018). Den resulterende 1-naftolen transporteres inn i cytoplasmaet over den indre membranen ved partisjonering og/eller diffusjon, og hydroksyleres deretter til 1,2-dihydroksynaftalen av enzymet 1NH₃ med høy affinitet for videre metabolisme i den sentrale karbonveien.
Selv om mikroorganismer har de genetiske og metabolske evnene til å bryte ned xenobiotiske karbonkilder, er den hierarkiske strukturen i deres utnyttelse (dvs. fortrinnsrett bruk av enkle fremfor komplekse karbonkilder) en stor hindring for biologisk nedbrytning. Tilstedeværelsen og utnyttelsen av enkle karbonkilder nedregulerer gener som koder for enzymer som bryter ned komplekse/ikke-foretrukne karbonkilder som PAH-er. Et godt studert eksempel er at når glukose og laktose tilføres Escherichia coli samtidig, utnyttes glukose mer effektivt enn laktose (Jacob og Monod, 1965). Pseudomonas har blitt rapportert å bryte ned en rekke PAH-er og xenobiotiske forbindelser som karbonkilder. Hierarkiet for karbonkildeutnyttelse i Pseudomonas er organiske syrer > glukose > aromatiske forbindelser (Hylemon og Phibbs, 1972; Collier et al., 1996). Det finnes imidlertid et unntak. Interessant nok er Pseudomonas sp. CSV86 viser en unik hierarkisk struktur som fortrinnsvis bruker aromatiske hydrokarboner (benzosyre, naftalen, etc.) i stedet for glukose, og ko-metaboliserer aromatiske hydrokarboner med organiske syrer (Basu et al., 2006). I denne bakterien er ikke genene for nedbrytning og transport av aromatiske hydrokarboner nedregulert, selv i nærvær av en andre karbonkilde som glukose eller organiske syrer. Ved dyrking i glukose- og aromatiske hydrokarbonmedium ble det observert at genene for glukosetransport og metabolisme var nedregulert, aromatiske hydrokarboner ble brukt i den første logaritmiske fasen, og glukose ble brukt i den andre logaritmiske fasen (Basu et al., 2006; Choudhary et al., 2017). På den annen side påvirket ikke tilstedeværelsen av organiske syrer uttrykket av aromatisk hydrokarbonmetabolisme, så denne bakterien forventes å være en kandidatstamme for biologiske nedbrytningsstudier (Phale et al., 2020).
Det er velkjent at hydrokarbonbiotransformasjon kan forårsake oksidativt stress og oppregulering av antioksidantenzymer i mikroorganismer. Ineffektiv naftalen-biologisk nedbrytning både i stasjonære faseceller og i nærvær av giftige forbindelser fører til dannelse av reaktive oksygenarter (ROS) (Kang et al. 2006). Siden naftalen-nedbrytende enzymer inneholder jern-svovelklynger, vil jernet i hem- og jern-svovelproteiner oksideres under oksidativt stress, noe som fører til proteininaktivering. Ferredoksin-NADP+ reduktase (Fpr), sammen med superoksiddismutase (SOD), medierer den reversible redoksreaksjonen mellom NADP+/NADPH og to molekyler av ferredoksin eller flavodoksin, og dermed fjerner ROS og gjenoppretter jern-svovelsenteret under oksidativt stress (Li et al. 2006). Det har blitt rapportert at både Fpr og SodA (SOD) i Pseudomonas kan induseres av oksidativt stress, og økt SOD- og katalaseaktivitet ble observert i fire Pseudomonas-stammer (O1, W1, As1 og G1) under vekst under forhold tilsatt naftalen (Kang et al., 2006). Studier har vist at tilsetning av antioksidanter som askorbinsyre eller jern(II) (Fe2+) kan øke vekstraten til naftalen. Når Rhodococcus erythropolis vokste i naftalenmedium, økte transkripsjonen av oksidativt stressrelaterte cytokrom P450-gener, inkludert sodA (Fe/Mn superoksiddismutase), sodC (Cu/Zn superoksiddismutase) og recA (Sazykin et al., 2019). Komparativ kvantitativ proteomisk analyse av Pseudomonas-celler dyrket i naftalen viste at oppregulering av ulike proteiner assosiert med oksidativ stressrespons er en stressmestringsstrategi (Herbst et al., 2013).
Det er rapportert at mikroorganismer produserer biosurfaktanter under påvirkning av hydrofobe karbonkilder. Disse overflateaktive stoffene er amfifile overflateaktive forbindelser som kan danne aggregater ved olje-vann- eller luft-vann-grensesnitt. Dette fremmer pseudo-solubilisering og letter adsorpsjonen av aromatiske hydrokarboner, noe som resulterer i effektiv biologisk nedbrytning (Rahman et al., 2002). På grunn av disse egenskapene er biosurfaktanter mye brukt i ulike industrier. Tilsetning av kjemiske overflateaktive stoffer eller biosurfaktanter til bakteriekulturer kan forbedre effektiviteten og hastigheten på hydrokarbonnedbrytningen. Blant de biosurfaktantene har rhamnolipider produsert av Pseudomonas aeruginosa blitt grundig studert og karakterisert (Hisatsuka et al., 1971; Rahman et al., 2002). I tillegg inkluderer andre typer biosurfaktanter lipopeptider (muciner fra Pseudomonas fluorescens), emulgator 378 (fra Pseudomonas fluorescens) (Rosenberg og Ron, 1999), trehalosedisakkaridlipider fra Rhodococcus (Ramdahl, 1985), lichenin fra Bacillus (Saraswathy og Hallberg, 2002) og overflateaktivt middel fra Bacillus subtilis (Siegmund og Wagner, 1991) og Bacillus amyloliquefaciens (Zhi et al., 2017). Disse potente overflateaktive stoffene har vist seg å redusere overflatespenningen fra 72 dyn/cm til mindre enn 30 dyn/cm, noe som gir bedre hydrokarbonabsorpsjon. Det har blitt rapportert at Pseudomonas, Bacillus, Rhodococcus, Burkholderia og andre bakteriearter kan produsere forskjellige rhamnolipid- og glykolipidbaserte biosurfaktanter når de dyrkes i naftalen- og metylnaftalenmedier (Kanga et al., 1997; Puntus et al., 2005). Pseudomonas maltophilia CSV89 kan produsere ekstracellulært biosurfaktant Biosur-Pm når den dyrkes på aromatiske forbindelser som naftosyre (Phale et al., 1995). Kinetikken til Biosur-Pm-dannelse viste at syntesen er en vekst- og pH-avhengig prosess. Det ble funnet at mengden Biosur-Pm produsert av celler ved nøytral pH var høyere enn ved pH 8,5. Celler dyrket ved pH 8,5 var mer hydrofobe og hadde høyere affinitet for aromatiske og alifatiske forbindelser enn celler dyrket ved pH 7,0. I Rhodococcus spp. N6, høyere karbon-til-nitrogen-forhold (C:N) og jernbegrensning er optimale forhold for produksjon av ekstracellulære biosurfaktanter (Mutalik et al., 2008). Det har blitt gjort forsøk på å forbedre biosyntesen av biosurfaktanter (surfaktiner) ved å optimalisere stammer og fermentering. Titeren av overflateaktivt middel i kulturmediet er imidlertid lav (1,0 g/L), noe som er en utfordring for storskala produksjon (Jiao et al., 2017; Wu et al., 2019). Derfor har genteknologiske metoder blitt brukt for å forbedre biosyntesen. Imidlertid er teknisk modifisering vanskelig på grunn av operonets store størrelse (∼25 kb) og kompleks biosyntetisk regulering av quorum sensing-systemet (Jiao et al., 2017; Wu et al., 2019). En rekke genteknologiske modifikasjoner har blitt utført i Bacillus-bakterier, hovedsakelig med sikte på å øke surfaktinproduksjonen ved å erstatte promoteren (srfA-operonet), overuttrykke surfaktineksportproteinet YerP og de regulatoriske faktorene ComX og PhrC (Jiao et al., 2017). Imidlertid har disse genteknologiske metodene bare oppnådd én eller få genetiske modifikasjoner og har ennå ikke nådd kommersiell produksjon. Derfor er videre studier av kunnskapsbaserte optimaliseringsmetoder nødvendig.
Studier av PAH-biologisk nedbrytning utføres hovedsakelig under standard laboratorieforhold. På forurensede steder eller i forurensede miljøer har det imidlertid vist seg at mange abiotiske og biotiske faktorer (temperatur, pH, oksygen, næringsstofftilgjengelighet, substratbiotilgjengelighet, andre xenobiotika, hemming av sluttproduktet osv.) endrer og påvirker mikroorganismers nedbrytningskapasitet.
Temperatur har en betydelig effekt på biologisk nedbrytning av PAH. Når temperaturen øker, synker konsentrasjonen av oppløst oksygen, noe som påvirker metabolismen til aerobe mikroorganismer, siden de krever molekylært oksygen som et av substratene for oksygenaser som utfører hydroksylering eller ringspaltingsreaksjoner. Det bemerkes ofte at forhøyet temperatur omdanner de opprinnelige PAH-ene til mer giftige forbindelser, og dermed hemmer biologisk nedbrytning (Muller et al., 1998).
Det har blitt bemerket at mange PAH-forurensede steder har ekstreme pH-verdier, som for eksempel steder forurenset av sure gruvedreneringsanlegg (pH 1–4) og steder for forgassing av naturgass/kull som er forurenset med alkalisk sigevann (pH 8–12). Disse forholdene kan påvirke den biologiske nedbrytningsprosessen alvorlig. Derfor anbefales det å justere pH-verdien ved å tilsette egnede kjemikalier (med moderat til svært lavt oksidasjons-reduksjonspotensial) som ammoniumsulfat eller ammoniumnitrat for alkaliske jordarter eller kalking med kalsiumkarbonat eller magnesiumkarbonat for sure steder før bruk av mikroorganismer til bioremediering (Bowlen et al. 1995; Gupta og Sar 2020).
Oksygentilførsel til det berørte området er den hastighetsbegrensende faktoren for PAH-biologisk nedbrytning. På grunn av redoksforholdene i miljøet krever in situ bioremedieringsprosesser vanligvis oksygentilførsel fra eksterne kilder (jordbearbeiding, luftgjennomblåsing og kjemisk tilsetning) (Pardieck et al., 1992). Odenkranz et al. (1996) viste at tilsetning av magnesiumperoksid (en oksygenfrigjørende forbindelse) til en forurenset akvifer effektivt kunne bioremediere BTEX-forbindelser. En annen studie undersøkte in situ-nedbrytningen av fenol og BTEX i en forurenset akvifer ved å injisere natriumnitrat og konstruere ekstraksjonsbrønner for å oppnå effektiv bioremediering (Bewley og Webb, 2001).