Nåværende *Nåværende adresse: Köln 50931, Tyskland, Cologne Excellence Cluster Research on Cellular Stress Response in Aging-related Diseases (CECAD).
Nevrodegenerasjon av mitokondrielle sykdommer anses som irreversibel fordi nevroners metabolske plastisitet er begrenset, men effekten av mitokondriell dysfunksjon på cellenes autonomi i nevronal metabolisme i kroppen er dårlig forstått. Her introduserer vi det cellespesifikke proteomet til Purkinje-nevroner med progressiv OXPHOS-mangel forårsaket av forstyrret mitokondriell fusjonsdynamikk. Vi fant at mitokondriell dysfunksjon utløste en dyp endring innen proteomikk, som til slutt førte til sekvensiell aktivering av presise metabolske programmer før celledød. Uventet bestemte vi den åpenbare induksjonen av pyruvatkarboksylase (PCx) og andre anti-aldringsenzymer som supplerer mellomproduktene i TCA-syklusen. Hemming av PCx forverret oksidativt stress og nevrodegenerasjon, noe som indikerer at aterosklerose har en beskyttende effekt i nevroner som mangler OXPHOS. Restaureringen av mitokondriell fusjon i terminalt degenererte nevroner reverserer fullstendig disse metabolske egenskapene, og forhindrer dermed celledød. Våre funn identifiserer tidligere ukjente veier som gir motstandskraft mot mitokondriell dysfunksjon og viser at nevrodegenerasjon kan reverseres selv i de sene stadiene av sykdommen.
Mitokondrienes sentrale rolle i å opprettholde neuronal energimetabolisme understrekes av de omfattende nevrologiske symptomene som er forbundet med menneskelige mitokondrielle sykdommer. De fleste av disse sykdommene er forårsaket av genmutasjoner som regulerer mitokondriell genuttrykk (1, 2) eller genødeleggelse relatert til mitokondriedynamikk, som indirekte påvirker stabiliteten til mitokondrie-DNA (mtDNA) (3, 4). Arbeid i dyremodeller har vist at som respons på mitokondriell dysfunksjon i omkringliggende vev, kan konservative metabolske veier (5-7) aktiveres, noe som gir viktig informasjon for en grundig forståelse av patogenesen til disse komplekse sykdommene. I sterk kontrast er vår forståelse av de metabolske endringene i spesifikke celletyper forårsaket av den generelle svikten i hjernens mitokondrielle adenosintrifosfat (ATP)-produksjon grunnleggende (8), noe som understreker behovet for å identifisere terapeutiske mål som kan brukes til å forebygge eller forhindre sykdom. Forebygge nevrodegenerasjon (9). Mangelen på informasjon skyldes det faktum at nerveceller er allment ansett for å ha svært begrenset metabolsk fleksibilitet sammenlignet med celletypene i omkringliggende vev (10). Gitt at disse cellene spiller en sentral rolle i å koordinere tilførselen av metabolitter til nevroner for å fremme synaptisk overføring og reagere på skader og sykdomstilstander, er evnen til å tilpasse cellemetabolismen til de utfordrende forholdene i hjernevevet nesten begrenset til gliaceller (11-14). I tillegg hindrer den iboende cellulære heterogeniteten i hjernevevet i stor grad studiet av metabolske endringer som forekommer i spesifikke nevrale undergrupper. Som et resultat er det lite kunnskap om de eksakte cellulære og metabolske konsekvensene av mitokondriell dysfunksjon i nevroner.
For å forstå de metabolske konsekvensene av mitokondriell dysfunksjon, isolerte vi Purkinje-nevroner (PN-er) i forskjellige stadier av nevrodegenerasjon forårsaket av ødeleggelse av mitokondriell ytre membranfusjon (Mfn2). Selv om Mfn2-mutasjoner hos mennesker er assosiert med en form for arvelig motorisk sensorisk nevropati kjent som Charcot-Marie-Tooth type 2A (15), er betinget destruksjon av Mfn2 hos mus en velkjent metode for induksjon av oksidasjonsfosforylering (OXPHOS) dysfunksjon. De forskjellige nevronale subtypene (16-19) og den resulterende nevrodegenerative fenotypen er ledsaget av progressive nevrologiske symptomer, som bevegelsesforstyrrelser (18, 19) eller cerebellar ataksi (16). Ved å bruke en kombinasjon av merkefri kvantitativ (LFQ) proteomikk, metabolomikk, avbildning og virologiske metoder, viser vi at progressiv nevrodegenerasjon sterkt induserer pyruvatkarboksylase (PCx) og andre faktorer involvert i arteriosklerose av PN-er in vivo Ekspresjon av enzymer. For å bekrefte relevansen av dette funnet, nedregulerte vi spesifikt uttrykket av PCx i Mfn2-mangelfulle PN-er, og fant at denne operasjonen forverret oksidativt stress og akselererte nevrodegenerasjon, og dermed beviste at azoospermi gir celledød og metabolsk tilpasningsevne. Alvorlig uttrykk av MFN2 kan fullstendig redde den terminale degenerative PN-en med alvorlig OXPHOS-mangel, massivt forbruk av mitokondrielt DNA og tilsynelatende ødelagt mitokondrielt nettverk, noe som ytterligere understreker at denne formen for nevrodegenerasjon til og med kan komme seg i et avansert stadium av sykdommen før celledød.
For å visualisere mitokondriene i Mfn2 knockout-PN-er, brukte vi en musestamme som lar Cre-avhengige mitokondrier målrette mot Cre-ekspresjon i gult fluorescerende protein (YFP) (mtYFP) (20), og sjekket mitokondriemorfologien in vivo. Vi fant at ødeleggelsen av Mfn2-genet i PN-er ville føre til gradvis deling av mitokondrienettverket (figur S1A), og den tidligste endringen ble funnet ved 3 ukers alder. I motsetning til dette begynte den betydelige degenerasjonen av PN-cellelaget, som vist ved tap av Calbindin-immunfarging, ikke før ved 12 ukers alder (figur 1, A og B). Tidsforskjellen mellom de tidligste endringene i mitokondriemorfologi og den synlige starten på nevrondød fikk oss til å undersøke de metabolske endringene utløst av mitokondriell dysfunksjon før celledød. Vi utviklet en fluorescensaktivert cellesorterings- (FACS)-basert strategi for å isolere YFP (YFP+)-uttrykkende PN (figur 1C), og i kontrollmus (Mfn2 + / loxP :: mtYFP loxP- stop-loxP: : L7-cre), heretter referert til som CTRL (figur S1B). Optimaliseringen av gating-strategien basert på den relative intensiteten til YFP-signalet lar oss rense YFP+-kroppen (YFPHigh) fra PN-er fra ikke-PN-er (YFPneg) (figur S1B) eller antatte fluorescerende akson/dendrittiske fragmenter (YFPlow; figur S1D, venstre), bekreftet med konfokalmikroskop (figur S1D, høyre). For å bekrefte identiteten til den klassifiserte populasjonen, utførte vi LFQ-proteomikk og deretter prinsipalkomponentanalyse, og fant at det er et klart skille mellom YFPHigh- og YFPneg-celler (figur S1C). YFPhigh-celler viste en netto anrikning av kjente PN-markører (dvs. Calb1, Pcp2, Grid2 og Itpr3) (21, 22), men ingen anrikning av proteiner som vanligvis uttrykkes i nevroner eller andre celletyper (figur 1D)). En sammenligning mellom prøver i klassifiserte YFPhigh-celler samlet i uavhengige eksperimenter viste en korrelasjonskoeffisient > 0,9, noe som demonstrerer god reproduserbarhet mellom biologiske replikater (figur S1E). Oppsummert validerte disse dataene planen vår for akutt og spesifikk isolering av mulig PN. Fordi L7-cre-driversystemet som brukes induserer mosaikkrekombinasjon i den første uken etter fødsel (23), begynte vi å avlive mus fra CTRL og betinget (Mfn2 loxP / loxP :: mtYFP loxP-stop-loxP :: L7-cre) samle nevroner. Etter at rekombinasjonen er fullført, kalles den Mfn2cKO ved 4 ukers alder. Som sluttpunkt valgte vi 8 ukers alder da PN-laget var intakt til tross for den åpenbare mitokondrielle fragmenteringen (figur 1B og figur S1A). Totalt kvantifiserte vi totalt 3013 proteiner, hvorav omtrent 22 % var basert på MitoCarta 2.0-annoteringer basert på mitokondrieproteomet som mitokondrier (figur 1E) (figur 1E) (24). Differensialgenekspresjonsanalysen utført i uke 8 viste at bare 10,5 % av alle proteiner hadde signifikante endringer (figur 1F og figur S1F), hvorav 195 proteiner var nedregulert og 120 proteiner var oppregulert (figur 1F). Det er verdt å merke seg at den «innovative pathway-analysen» av dette datasettet viser at de differensielt uttrykte genene hovedsakelig tilhører et begrenset sett med spesifikke metabolske veier (figur 1G). Interessant nok, selv om nedreguleringen av signalveier relatert til OXPHOS- og kalsiumsignalering bekrefter induksjonen av mitokondriell dysfunksjon i fusjonsdefekte PN-er, er andre kategorier som hovedsakelig involverer aminosyremetabolisme betydelig oppregulert, noe som er i tråd med metabolismen som forekommer i mitokondrielle PN-er. Omkobling er konsekvent.
(A) Representative konfokale fotografier av cerebellare snitt av CTRL- og Mfn2cKO-mus som viser progressivt tap av PN-er (calbindin, grå); kjerner ble motfarget med DAPI. (B) Kvantifisering av (A) (enveis variansanalyse, ***P <0,001; n = 4 til 6 sirkler fra tre mus). (C) Eksperimentell arbeidsflyt. (D) Varmekartfordeling av markører spesifikke for Purkinje (øverst) og andre celletyper (midten). (E) Venn-diagram som viser antall mitokondrielle proteiner identifisert i den klassifiserte PN-en. (F) Vulkanplott av differensielt uttrykte proteiner i Mfn2cKO-nevroner etter 8 uker (signifikansgrenseverdi på 1,3). (G) Kreativitetsveianalysen viser de fem viktigste oppregulerings- (røde) og nedregulerings- (blå) veiene i Mfn2cKO PN klassifisert som 8 uker. Det gjennomsnittlige uttrykknivået for hvert detekterte protein er vist. Gråtonevarmekart: justert P-verdi. ns, ikke viktig.
Proteomikkdata viste at proteinuttrykket i kompleksene I, III og IV gradvis minket. Kompleksene I, III og IV inneholdt alle essensielle mtDNA-kodede underenheter, mens kompleks II, som kun var kjernekodet, i hovedsak var upåvirket (figur 2A og figur S2A). I ​​samsvar med proteomikkresultatene viste immunhistokjemi av cerebellare vevssnitt at MTCO1-underenhetsnivået (mitokondrie cytokrom C-oksidase-underenhet 1) i kompleks IV i PN gradvis minket (figur 2B). Den mtDNA-kodede underenheten Mtatp8 ble betydelig redusert (figur S2A), mens steady-state-nivået av den kjernekodede ATP-syntase-underenheten forble uendret, noe som er i samsvar med det kjente stabile ATP-syntase-underenheten F1-komplekset når mtDNA-uttrykk er stabilt. Dannelsen er konsistent. Avbryt (7). Evaluering av mtDNA-nivået i de sorterte Mfn2cKO PN-ene ved hjelp av sanntids polymerasekjedereaksjon (qPCR) bekreftet den gradvise nedgangen i mtDNA-kopitall. Sammenlignet med kontrollgruppen, ved 8 ukers alder, var bare omtrent 20 % av mtDNA-nivået beholdt (figur 2C). I samsvar med disse resultatene ble konfokalmikroskopifarging av Mfn2cKO PN-er brukt til å detektere DNA, noe som viser det tidsavhengige forbruket av mitokondrielle nukleotider (figur 2D). Vi fant at bare noen kandidater involvert i mitokondriell proteinnedbrytning og stressrespons var oppregulert, inkludert Lonp1, Afg3l2 og Clpx, og OXPHOS-komplekssamlingsfaktorer. Ingen signifikante endringer i nivåene av proteiner involvert i apoptose ble detektert (figur S2B). Tilsvarende fant vi at mitokondriene og endoplasmatisk retikulumkanaler involvert i kalsiumtransport bare har mindre endringer (figur S2C). I tillegg fant evalueringen av autofagi-relaterte proteiner ingen signifikante endringer, noe som er i samsvar med den synlige induksjonen av autofagosomer observert in vivo ved immunhistokjemi og elektronmikroskopi (figur S3). Imidlertid er den progressive OXPHOS-dysfunksjonen i PN-er ledsaget av åpenbare ultrastrukturelle mitokondrielle endringer. Mitokondrielle klynger kan sees i cellekroppene og dendrittiske trærne til Mfn2cKO PN-er i alderen 5 og 8 uker, og den indre membranstrukturen har gjennomgått dyptgripende endringer (figur S4, A og B). I samsvar med disse ultrastrukturelle endringene og en signifikant reduksjon i mtDNA, viste analyse av akutte cerebrale cerebellare skiver med tetrametylrhodaminmetylester (TMRM) at mitokondriemembranpotensialet i Mfn2cKO PN-er var betydelig redusert (figur S4C).
(A) Tidsforløpsanalyse av uttrykknivået til OXPHOS-komplekset. Vurder kun proteiner med P < 0,05 etter 8 uker (toveis ANOVA). Stiplet linje: Ingen justering sammenlignet med CTRL. (B) Venstre: Et eksempel på en cerebellar seksjon merket med anti-MTCO1-antistoff (skalalinje, 20 μm). Området okkupert av Purkinje-cellelegemer er dekket av gult. Høyre: Kvantifisering av MTCO1-nivåer (enveis variansanalyse; n = 7 til 20 celler analysert fra tre mus). (C) qPCR-analyse av mtDNA-kopitall i den sorterte PN (enveis variansanalyse; n = 3 til 7 mus). (D) Venstre: Et eksempel på en cerebellar seksjon merket med et anti-DNA-antistoff (skalalinje, 20 μm). Området okkupert av Purkinje-cellelegemer er dekket av gult. Høyre: Kvantifisering av mtDNA-lesjoner (enveis variansanalyse; n = 5 til 9 celler fra tre mus). (E) Et eksempel på en akutt cerebellar seksjon som viser mitoYFP + Purkinje-celler (pil) i et helcelle patch clamp-opptak. (F) Kvantifisering av IV-kurve. (G) Representative opptak av depolariserende strøminjeksjon i CTRL- og Mfn2cKO Purkinje-celler. Øverste spor: Den første pulsen som utløste AP. Nederste spor: Maksimal AP-frekvens. (H) Kvantifisering av postsynaptiske spontane innganger (sPSP-er). Det representative opptakssporet og dets zoomforhold er vist i (I). Enveis variansanalyse analysert n = 5 til 20 celler fra tre mus. Data er uttrykt som gjennomsnitt ± SEM; *P < 0,05; **P < 0,01; ***P < 0,001. (J) Representative spor av spontan AP registrert ved hjelp av perforert patch clamp-modus. Øverste spor: Maksimal AP-frekvens. Nederste spor: zoom av en enkelt AP. (K) Kvantifiser gjennomsnittlig og maksimal AP-frekvens i henhold til (J). Mann-Whitney-test; n = 5 celler ble analysert fra fire mus. Dataene er uttrykt som gjennomsnitt ± SEM; ikke viktig.
Tydelig OXPHOS-skade ble oppdaget i den 8 uker gamle Mfn2cKO PN, noe som indikerer at nevronenes fysiologiske funksjon er alvorlig unormal. Derfor analyserte vi de passive elektriske egenskapene til OXPHOS-defekte nevroner ved 4 til 5 uker og 7 til 8 uker ved å utføre helcelle-patch-clamp-opptak i akutte cerebellare skiver (figur 2E). Uventet var det gjennomsnittlige hvilemembranpotensialet og inngangsmotstanden til Mfn2cKO-nevroner lik kontrollen, selv om det var subtile forskjeller mellom cellene (tabell 1). Tilsvarende ble det ikke funnet noen signifikante endringer i strøm-spenningsforholdet (IV-kurve) ved 4 til 5 ukers alder (figur 2F). Imidlertid overlevde ingen Mfn2cKO-nevroner 7 til 8 uker gamle IV-regimet (hyperpolariseringstrinn), noe som indikerer at det er en klar følsomhet for hyperpolariseringspotensial på dette sene stadiet. I motsetning til dette tolereres de depolariserende strømmene som forårsaker repeterende aksjonspotensialutladninger (AP) godt i Mfn2cKO-nevroner, noe som indikerer at deres generelle utladningsmønstre ikke er signifikant forskjellige fra de hos 8 uker gamle kontrollnevroner (tabell 1 og figur 2G). Tilsvarende var frekvensen og amplituden av spontane postsynaptiske strømmer (sPSC-er) sammenlignbare med kontrollgruppen, og hyppigheten av hendelser økte fra 4 uker til 5 uker til 7 uker til 8 uker med en lignende økning (figur 2, H og I). Perioden for synaptisk modning i PN-er (25). Lignende resultater ble oppnådd etter perforerte PN-patcher. Denne konfigurasjonen forhindrer mulig kompensasjon av cellulære ATP-defekter, slik det kan skje ved helcelle-patch-clamp-registrering. Spesielt ble ikke hvilemembranpotensialet og spontan avfyringsfrekvens for Mfn2cKO-nevroner påvirket (figur 2, J og K). Oppsummert indikerer disse resultatene at PN-er med åpenbar OXPHOS-dysfunksjon kan takle høyfrekvente utladningsmønstre godt, noe som indikerer at det finnes en kompensasjonsmekanisme som lar dem opprettholde nesten normale elektrofysiologiske responser.
Dataene er uttrykt som gjennomsnitt ± SEM (enveis variansanalyse, Holm-Sidaks multiple sammenligningstest; *P < 0,05). Enhetsnummeret er angitt med parenteser.
Vi satte oss fore å undersøke om noen kategori i proteomikkdatasettet (figur 1G) inkluderer signalveier som kan motvirke alvorlig OXPHOS-mangel, og dermed forklare hvorfor berørt PN kan opprettholde nesten normal elektrofysiologi (figur 2, E til K). Proteomikkanalyse viste at enzymene involvert i katabolismen av forgrenede aminosyrer (BCAA) var betydelig oppregulert (figur 3A og figur S5A), og sluttproduktet acetyl-CoA (CoA) eller succinyl CoA kan supplere trikarboksylatene i arteriosklerose-syresyklusen (TCA). Vi fant at innholdet av BCAA-transaminase 1 (BCAT1) og BCAT2 begge økte. De katalyserer det første trinnet i BCAA-katabolismen ved å generere glutamat fra α-ketoglutarat (26). Alle underenheter som utgjør det forgrenede ketosyredehydrogenasekomplekset (BCKD) er oppregulert (komplekset katalyserer den påfølgende og irreversible dekarboksyleringen av det resulterende BCAA-karbonskjelettet) (figur 3A og figur S5A). Imidlertid ble det ikke funnet noen åpenbare endringer i selve BCAA i det sorterte PN, noe som kan skyldes økt cellulær opptak av disse essensielle aminosyrene eller bruk av andre kilder (glukose eller melkesyre) for å supplere TCA-syklusen (figur S5B). PN-er som manglet OXPHOS viste også økt glutaminnedbrytning og transamineringsaktiviteter ved 8 ukers alder, noe som kan gjenspeiles av oppreguleringen av mitokondrieenzymene glutaminase (GLS) og glutaminpyruvattransaminase 2 (GPT2) (figur 3, A og C). Det er verdt å merke seg at oppreguleringen av GLS er begrenset til den spleiste isoformen glutaminase C (GLS-GAC) (endringen av Mfn2cKO/CTRL er omtrent 4,5 ganger, P = 0,05), og dens spesifikke oppregulering i kreftvev kan støtte mitokondriell bioenergi. (27).
(A) Varmekartet viser endringen i proteinnivå for den spesifiserte ruten etter 8 uker. (B) Eksempel på en cerebellar skive merket med anti-PCx-antistoff (skalabar, 20 μm). Den gule pilen peker mot Purkinje-cellekroppen. (C) Tidsløpsanalyse av proteinuttrykk identifisert som en viktig kandidat for aterosklerose (multiple t-test, *FDR <5 %; n = 3–5 mus). (D) Over: Et skjematisk diagram som viser de forskjellige måtene å komme inn i det merkede karbonet i [1-13C]pyruvat-traceren (dvs. via PDH eller transarteriell rute). Nederst: Fiolindiagrammet viser prosentandelen av enkeltmerket karbon (M1) omdannet til asparaginsyre, sitronsyre og eplesyre etter merking av akutte cerebellare skiver med [1-13C]pyruvat (paret t-test; ** P <0,01). (E) Omfattende tidshistorikkanalyse av den angitte banen. Vurder kun proteiner med P <0,05 etter 8 uker. Stiplet linje: ingen justeringsverdi (toveis variansanalyse; * P <0,05; *** P <0,001). Dataene er uttrykt som gjennomsnitt ± SEM.
I vår analyse har BCAA-katabolisme blitt en av de viktigste oppreguleringsveiene. Dette faktum tyder sterkt på at ventilasjonsvolumet som går inn i TCA-syklusen kan endres i PN som mangler OXPHOS. Dette kan representere en viktig form for neuronal metabolsk omkobling, som kan ha en direkte innvirkning på neuronal fysiologi og overlevelse under opprettholdelse av alvorlig OXPHOS-dysfunksjon. I samsvar med denne hypotesen fant vi at det viktigste anti-aterosklerotiske enzymet PCx er oppregulert (Mfn2cKO/CTRL endres omtrent 1,5 ganger; figur 3A), som katalyserer omdannelsen av pyruvat til oksaloacetat (28), som antas å være i hjernevev. Ekspresjonen i er begrenset til astrocytter (29, 30). I samsvar med proteomikkresultatene viste konfokalmikroskopi at PCx-ekspresjon var spesifikt og signifikant økt i OXPHOS-defekte PN-er, mens PCx-reaktivitet hovedsakelig var begrenset til de tilstøtende Bergmann-gliacellene i kontrollen (figur 3B). For å funksjonelt teste den observerte oppreguleringen av PCx, behandlet vi akutte cerebellare skiver med [1-13C]pyruvat-traceren. Da pyruvat ble oksidert av pyruvatdehydrogenase (PDH), forsvant isotopmarkøren, men den blir inkorporert i TCA-syklusens mellomprodukter når pyruvat metaboliseres av vaskulære reaksjoner (figur 3D). Til støtte for våre proteomikkdata observerte vi et stort antall markører fra denne traceren i asparaginsyren i Mfn2cKO-skiver, mens sitronsyre og eplesyre også hadde en moderat trend, men ikke signifikant (figur 3D).
I dopaminnevronene hos MitoPark-mus med mitokondriell dysfunksjon forårsaket av dopaminnevroner som spesifikt ødelegger det mitokondrielle transkripsjonsfaktor A-genet (Tfam) (figur S6B), var PCx-ekspresjon også signifikant oppregulert (31), noe som indikerer at acetonsyrearteriosklerose. Forekomsten av sykdommen reguleres under dysfunksjonen av neuronal OXPHOS i kroppen. Det er verdt å merke seg at det har blitt funnet at unike enzymer (32-34) som kan uttrykkes i nevroner som kan være assosiert med arteriosklerose, er signifikant oppregulert i PN-er som mangler OXPHOS, slik som propionyl-CoA-karboksylase (PCC-A), malonyl-CoA som omdanner propionyl-CoA til succinyl-CoA og mitokondrie-eplesyreenzym 3 (ME3), hvis hovedrolle er å gjenvinne pyruvat fra malat (figur 3, A og C) (33, 35). I tillegg fant vi en signifikant økning i Pdk3-enzymet, som fosforylerer og dermed inaktiverer PDH (36), mens ingen endringer ble oppdaget i Pdp1-enzymet som aktiverer PDH eller selve PDH-enzymkomplekset (figur 3A). Konsekvent, i Mern2cKO PN-er, ble fosforyleringen av α1-subenhet α (PDHE1α)-subenheten til pyruvatdehydrogenase E1-komponenten av PDH-komplekset i Ser293 (kjent for å hemme enzymaktiviteten til PDH) forsterket (figur S6C) (figur S6C). Pyruvat har ingen vaskulær tilgang.
Til slutt fant vi at superveien for serin- og glysinbiosyntese, den relaterte mitokondrielle folatsyklusen (1C) og prolinbiosyntesen (figur 1G og figur S5C) alle er betydelig oppregulert, ifølge rapporter, under aktiveringsprosessen. De omkringliggende vevene aktiveres med mitokondriell dysfunksjon (5-7). Konfokal analyse som støtter disse proteomikkdataene viste at i PN med manglende OXPHOS ble cerebellarskiver av 8 uker gamle mus utsatt for serinhydroksymetyltransferase 2 (SHMT2), et nøkkelenzym i den mitokondrielle folatsyklusen. Signifikant immunrespons (figur S5D). I 13 CU-glukose-inkuberte akutte cerebellarskiver bekreftet metabolske sporingseksperimenter ytterligere oppreguleringen av serin- og prolinbiosyntese, noe som indikerer at strømmen av karbonisoformer til serin og prolin økte (figur S5E). Siden reaksjonene fremmet av GLS og GPT2 er ansvarlige for syntesen av glutamat fra glutamin og transamineringen mellom glutamat og α-ketoglutarat, indikerer oppreguleringen av disse at OXPHOS-mangelfulle nevroner har økt behov for glutamat. Dette kan være rettet mot å opprettholde den økte biosyntesen av prolin (figur S5C). I motsetning til disse endringene viste en proteomisk analyse av cerebellare astrocytter fra PN-spesifikke Mfn2cKO-mus at disse signalveiene (inkludert alle antiperoksidaser) ikke endret seg signifikant i uttrykk, noe som demonstrerer at denne metabolske omdirigeringen er selektiv for degradert PN (fig. S6, D til G).
Oppsummert avdekket disse analysene signifikant forskjellige mønstre av tidsmessig aktivering av spesifikke metabolske veier i PN-er. Selv om unormal nevronal mitokondriefunksjon kan føre til tidlig aterosklerose og 1C-ombygging (figur 3E og figur S5C), og til og med forutsigbare endringer i uttrykket av I- og IV-komplekser, er endringene i serin de novo-syntese først tydelige i de sene stadiene. OXPHOS-dysfunksjon (figur 3E og figur S5C). Disse funnene definerer en sekvensiell prosess der stressindusert mitokondrie (1C-syklus) og cytoplasma (serinbiosyntese) reagerer synergistisk med økningen i aterosklerose i TCA-syklusen for å omforme nevronal metabolisme.
8 uker gamle OXPHOS-defekte PN-er kan opprettholde høyfrekvent eksitasjonsaktivitet og gjennomgå betydelig metabolsk retilkobling for å kompensere for mitokondriell dysfunksjon. Denne oppdagelsen reiser en interessant mulighet for at selv i dette øyeblikket kan disse cellene også motta terapeutisk intervensjon for å forsinke eller forhindre nevrodegenerasjon. Vi løste denne muligheten gjennom to uavhengige intervensjoner. I den første metoden designet vi en Cre-avhengig adeno-assosiert virus (AAV)-vektor slik at MFN2 kan uttrykkes selektivt i OXPHOS-defekte PN-er in vivo (figur S7A). AAV-en som koder for MFN2 og det fluorescerende reportergenet mCherry (Mfn2-AAV) ble verifisert i primære nevronkulturer in vitro, noe som forårsaket at MFN2 ble uttrykt på en Cre-avhengig måte og reddet mitokondriemorfologien, og dermed forhindret nevromutasjon i Mfn2cKO-nevroner (figur S7, B, D og E). Deretter utførte vi in ​​vivo-eksperimenter for å stereotaktisk levere 8 uker gammel Mfn2-AAV til lillehjernen hos Mfn2cKO- og kontrollmus, og analyserte 12 uker gamle mus (figur 4A). De behandlede Mfn2cKO-musene døde (figur 1, A og B) (16). Viral transduksjon in vivo resulterte i selektiv uttrykk av PN i noen lillehjernesirkler (figur S7, G og H). Injeksjonen av kontroll-AAV som kun uttrykker mCherry (Ctrl-AAV) hadde ingen signifikant effekt på graden av nevrodegenerasjon hos Mfn2cKO-dyr. I motsetning til dette viste analysen av Mfn2cKO-er transdusert med Mfn2-AAV en signifikant beskyttende effekt av PN-cellelaget (figur 4, B og C). Spesielt ser det ut til at nevrontettheten er nesten umulig å skille fra kontrolldyrene (figur 4, B og C, og figur S7, H og I). Ekspresjon av MFN1, men ikke MFN2, er like effektivt for å redde nevrondød (figur 4C og figur S7, C og F), noe som indikerer at ekspresjon av ektopisk MFN1 effektivt kan supplere mangelen på MFN2. Videre analyse på enkelt PN-nivå viste at Mfn2-AAV i stor grad reddet ultrastrukturen til mitokondrier, normaliserte mtDNA-nivåer og reverserte den høye ekspresjonen av anti-angiogenese-markøren PCx ​​(figur 4, C til E). Visuell inspeksjon av de reddede Mfn2cKO-musene i hviletilstand viste at deres holdning og motoriske symptomer (bevegelse S1 til S3) ble forbedret. Avslutningsvis viser disse eksperimentene at forsinket reintroduksjon av MFN2 i PN-er med alvorlig mangel på OXPHOS er tilstrekkelig til å reversere mtDNA-forbruk og indusere aterosklerose, og dermed forhindre aksondegenerasjon og nevrondød in vivo.
(A) Et skjema som viser den eksperimentelle tidsplanen for injeksjon av AAV som koder for MFN2 når den angitte metabolske veien er aktivert. (B) Representative konfokale bilder av 12 uker gamle cerebellare skiver transdusert ved 8 uker i Mfn2cKO-mus og merket med anti-Calbindin-antistoff. Høyre: Skalering av aksonfibre. Skalaen til aksonzoomen er 450 og 75 μm. (C) Venstre: Kvantifisering av Purkinje-celletetthet i AAV-transduksjonssløyfen (AAV+) (enveis variansanalyse; n = 3 mus). Høyre: mtDNA-fokusanalyse i transdusert PN ved uke 12 (uparet t-test; n = 6 celler fra tre mus). * P <0,05; ** P <0,01. (D) Representative transmisjonselektronmikroskopibilder av PN-er av Mfn2cKO cerebellare seksjoner transdusert med de angitte virusvektorene. Den rosa masken illustrerer området okkupert av dendritter, og den gulprikkede firkanten illustrerer zoomen til høyre; n representerer kjernen. Skalalinje, 1 μm. (E) viser et eksempel på PCx-farging i PN transdusert etter 12 uker. Skalalinje, 20 μm. OE, overekspresjon; FC, fold endring.
Til slutt undersøkte vi viktigheten av peroksidaseindusert celleoverlevelse hos PN-er som har opplevd OXPHOS-dysfunksjon. Vi genererte mCherry som koder for AAV-shRNA (short hairpin RNA) spesifikt rettet mot mus PCx mRNA (AAV-shPCx), og injiserte viruset eller dets krypterte kontroll (AAV-scr) i lillehjernen hos Mfn2cKO-mus. Injeksjonen ble utført i den fjerde aldersuken (figur 5A) for å oppnå effektiv PCx-nedbrytning i perioden da PCx-ekspresjon økte (figur 3C) og PN-cellelaget fortsatt var intakt (figur 1A). Det er verdt å merke seg at nedbrytning av PCx (figur S8A) fører til en betydelig akselerasjon av PN-død, som er begrenset til den infiserte ringen (figur 5, B og C). For å forstå mekanismen bak de metabolske effektene indusert av PCx-oppregulering, studerte vi redoksstatusen til PN-er etter PCx-knockdown og AAV-mediert optisk biosensor Grx1-roGFP2 ble uttrykt samtidig (figur S8, B til D) for å evaluere glutation. Den relative endringen i peptid-redokspotensial (38). Deretter utførte vi to-foton fluorescens-livstidsavbildningsmikroskopi (FLIM) i akutte hjerneskiver av 7 uker gamle Mfn2cKO- eller kontrollkullsøsken for å oppdage potensielle endringer i cytoplasmisk redoksstatus etter å ha verifisert FLIM-forhold (figur S8, E til G). Analysen viste en signifikant økning i oksidasjonstilstanden til en enkelt Mfn2cKO-PN-er som mangler PCx-ekspresjon, noe som er forskjellig fra kontrollnevroner eller Mfn2cKO-PN-er som kun uttrykker kryptert shRNA (figur 5, D og E). Når PCx-ekspresjon ble nedregulert, økte prosentandelen av Mfn2cKO PN-er som viste en sterkt oksidert tilstand med mer enn tre ganger (figur 5E), noe som indikerer at PCx-oppregulering opprettholdt redokskapasiteten til degenererte nevroner.
(A) Et skjema som viser den eksperimentelle tidsplanen for injeksjon av AAV som koder for shPCx når den angitte metabolske veien er aktivert. (B) Representative konfokale fotografier av 8 uker gamle cerebellare snitt i Mfn2cKO-mus transdusert og merket med anti-calcineurin-antistoff etter 4 uker. Skala, 450 μm. (C) Kvantifisering av Purkinje-celletetthet i AAV-transduserte løkker (enveis variansanalyse; n = 3 til 4 mus). Data er uttrykt som gjennomsnitt ± SEM; ***P < 0,001. (D) Representativt FLIM-bilde viser gjennomsnittlig levetid for 7 uker gamle PN-uttrykkende glutation-redoks-sensor Grx1-roGFP2 under de spesifiserte eksperimentelle forholdene. LUT (oppslagstabell) forhold: overlevelsestidsintervall (i pikosekunder). Skala, 25 μm. (E) Histogrammet viser fordelingen av Grx1-roGFP2-livstidsverdier fra (D) (n=158 til 368 celler i to mus under hver betingelse). Kakediagrammet over hvert histogram viser antall celler med betydelig lengre (rød, oksidert) eller kortere (blå, redusert) levetidsverdier, som overstiger 1 SD av den gjennomsnittlige levetidsverdien i CTRL-AAV-scr. (F) Den foreslåtte modellen viser den beskyttende effekten av oppregulering av neuronal PCx.
Alt i alt viser dataene vi presenterer her at re-ekspresjon av MFN2 fullstendig kan redde avansert PN med alvorlig OXPHOS-mangel, alvorlig mtDNA-uttømming og ekstremt unormal ista-lignende morfologi, og dermed gi kontinuerlig fremgang selv ved avanserte sykdommer. Nevrodegenerasjon gir reversibel bevis på stadiet før celledød. Denne graden av metabolsk fleksibilitet understrekes ytterligere av nevroners evne til å indusere aterosklerose (en omkobling av TCA-syklusen), som hemmer PCx-ekspresjon i PN-er som mangler OXPHOS og forsterker celledød, og dermed spiller en beskyttende rolle (figur 5F).
I denne studien ga vi bevis for at PN-ers respons på OXPHOS-dysfunksjon er å gradvis konvergere til TCA-syklus aterosklerose gjennom den differensielle aktiveringsveien aktivert av metabolske programmer. Vi bekreftet den proteomiske analysen med mange komplementære metoder og avslørte at når nevroner utfordres av alvorlig mitokondriell dysfunksjon, har de en tidligere ukjent form for metabolsk elastisitet. Til vår overraskelse markerer ikke hele omkoblingsprosessen nødvendigvis den terminale metabolske tilstanden som følger med nevrodegenerasjon gradvis og irreversibelt, men dataene våre antyder at det kan utgjøre en vedlikeholdsnevron selv i stadiet før celledød (funksjonell kompensasjonsmekanisme). Dette funnet indikerer at nevroner har en betydelig grad av metabolsk plastisitet i kroppen. Dette faktum beviser at senere gjeninnføring av MFN2 kan reversere uttrykket av viktige metabolske markører og forhindre PN-degenerasjon. Tvert imot hemmer det aterosklerose og akselererer transseksuelle nerver.
Et av de mest fascinerende funnene i forskningen vår er at PN-er som mangler OXPHOS kan modifisere TCA-syklusmetabolismen ved å oppregulere enzymer som spesifikt stimulerer arteriosklerose. Metabolsk omorganisering er et vanlig trekk ved kreftceller, hvorav noen er avhengige av glutamin for å supplere TCA-syklusmellomprodukter for å produsere reduserende ekvivalenter, som driver respirasjonskjeden og opprettholder produksjonen av lipid- og nukleotidbiosynteseforløpere (39, 40). En nylig studie viste at i perifere vev som opplever OXPHOS-dysfunksjon, er retilkoblingen av glutamin/glutamatmetabolisme også et fremtredende trekk (5, 41), der retningen for glutamininntreden i TCA-syklusen avhenger av på grunn av alvorlighetsgraden av OXPHOS-skaden (41). Det mangler imidlertid klare bevis for noen likhet mellom neuronal metabolsk plastisitet i kroppen og dens mulige relevans i sykdomskonteksten. I en nylig in vitro-studie ble det vist at primære kortikale nevroner mobiliserer glutamatbassenger for nevrotransmisjon, og dermed fremmer oksidativ metabolisme og aterosklerose under metabolske stressforhold (42). Det er verdt å merke seg at under farmakologisk hemming av TCA-syklusenzymet succinatdehydrogenase, antas pyruvatkarboksylering å opprettholde syntesen av oksaloacetat i dyrkede cerebellare granulære nevroner (34). Imidlertid har den fysiologiske relevansen av disse mekanismene for hjernevev (der aterosklerose antas å være hovedsakelig begrenset til astrocytter) fortsatt viktig fysiologisk betydning (43). I dette tilfellet viser dataene våre at PN-er som er skadet av OXPHOS i kroppen, kan bli omstilt til BCAA-nedbrytning og pyruvatkarboksylering, som er de to hovedkildene til tilskudd av TCA-pool-mellomprodukter. Selv om det antatte bidraget fra BCAA-katabolisme til neuronal energimetabolisme har blitt foreslått, i tillegg til rollen til glutamat og GABA for nevrotransmisjon (44), er det fortsatt ingen bevis for disse mekanismene in vivo. Derfor er det lett å spekulere i at dysfunksjonelle PN-er automatisk kan kompensere for forbruket av TCA-mellomprodukter drevet av assimileringsprosessen ved å øke aterosklerose. Spesielt kan oppregulering av PCx være nødvendig for å opprettholde en økt etterspørsel etter asparaginsyre, noe som antydes i prolifererende celler med mitokondriell dysfunksjon (45). Vår metabolomikkanalyse avdekket imidlertid ingen signifikante endringer i steady-state-nivået av asparaginsyre i Mfn2cKO PN-er (figur S6A), noe som antagelig gjenspeiler den ulike metabolske utnyttelsen av asparaginsyre mellom prolifererende celler og post-mitotiske nevroner. Selv om den eksakte mekanismen for PCx-oppregulering i dysfunksjonelle nevroner in vivo gjenstår å karakterisere, viste vi at denne premature responsen spiller en viktig rolle i å opprettholde redokstilstanden til nevroner, noe som ble demonstrert i FLIM-eksperimenter på cerebellare skiver. Spesielt kan det å forhindre PN-er i å oppregulere PCx føre til en mer oksidert tilstand og akselerere celledød. Aktivering av BCAA-nedbrytning og karboksylering av pyruvat er ikke måter å karakterisere perifere vev med mitokondriell dysfunksjon (7). Derfor ser de ut til å være en prioritert egenskap ved OXPHOS-mangelfulle nevroner, selv om ikke den eneste egenskapen, som er viktig for nevrodegenerasjon.
Cerebellar sykdom er en heterogen type nevrodegenerativ sykdom som vanligvis manifesterer seg som ataksi og ofte skader PN-er (46). Denne nevronpopulasjonen er spesielt sårbar for mitokondriell dysfunksjon fordi deres selektive degenerasjon hos mus er tilstrekkelig til å reprodusere mange av de motoriske symptomene som karakteriserer menneskelig spinocerebellar ataksi (16, 47, 48). Ifølge rapporter er en transgen musemodell med et mutantgen assosiert med menneskelig spinocerebellar ataksi og har mitokondriell dysfunksjon (49, 50), noe som understreker viktigheten av å studere konsekvensene av OXPHOS-mangel i PNPH. Derfor er det spesielt egnet for å effektivt isolere og studere denne unike nevronpopulasjonen. Men gitt at PN-er er svært følsomme for trykk og står for en lav andel av hele cerebellarcellepopulasjonen, er selektiv separasjon av dem som hele celler fortsatt et utfordrende aspekt for mange omics-baserte studier. Selv om det er nesten umulig å oppnå absolutt fravær av kontaminering av andre celletyper (spesielt voksent vev), kombinerte vi et effektivt dissosiasjonstrinn med FACS for å oppnå et tilstrekkelig antall levedyktige nevroner for nedstrøms proteomikkanalyse, og har ganske høy proteindekning (omtrent 3000 proteiner) sammenlignet med det eksisterende datasettet for hele lillehjernen (51). Ved å bevare levedyktigheten til hele celler, lar metoden vi tilbyr her oss ikke bare sjekke endringene i metabolske veier i mitokondriene, men også sjekke endringene i de cytoplasmatiske motpartene, noe som komplementerer bruken av mitokondrielle membrantagger for å berike celletypen. Den nye metoden for antall mitokondrier i komplekse vev (52, 53). Metoden vi beskriver er ikke bare relatert til studiet av Purkinje-celler, men kan enkelt brukes på alle typer celler for å adressere metabolske endringer i syke hjerner, inkludert andre modeller av mitokondriell dysfunksjon.
Til slutt har vi identifisert et terapeutisk vindu under denne metabolske omorganiseringsprosessen som fullstendig kan reversere de viktigste tegnene på cellulært stress og forhindre nevronal degenerasjon. Derfor kan forståelsen av de funksjonelle implikasjonene av omkoblingen beskrevet her gi grunnleggende innsikt i mulige behandlinger for å opprettholde nevronal levedyktighet under mitokondriell dysfunksjon. Fremtidig forskning rettet mot å dissekere endringer i energimetabolisme i andre hjernecelletyper er nødvendig for å fullt ut avsløre anvendeligheten av dette prinsippet på andre nevrologiske sykdommer.
MitoPark-mus har blitt beskrevet tidligere (31). C57BL/6N-mus med loxP-flankerende Mfn2-gener har blitt beskrevet tidligere (18) og krysset med L7-Cre-mus (23). Det resulterende dobbeltheterozygote avkommet ble deretter krysset med homozygote Mfn2loxP/Mfn2loxP-mus for å generere Purkinje-spesifikke gen-knockouts for Mfn2 (Mfn2loxP/Mfn2loxP; L7-cre). I en delmengde av paring ble Gt (ROSA26) SorStop-mito-YFP-allelet (stop-mtYFP) introdusert gjennom ytterligere krysninger (20). Alle dyreprosedyrer ble utført i samsvar med europeiske, nasjonale og institusjonelle retningslinjer og godkjent av LandesamtfürNatur of Umwelt and Verbraucherschutz, Nordrhein-Westfalen, Tyskland. Dyrearbeid følger også veiledningen fra European Federation of Laboratory Animal Sciences Associations.
Etter bedøvelse av den gravide kvinnens cervikale dislokasjon, isoleres museembryoet (E13). Barken ble dissekert i Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) tilsatt 10 mM Hepes og overført til Dulbeccos Modified Eagle's Medium som inneholdt papain (20 U/ml) og cystein (1μg/ml). Vevet inkuberes i DMEM) og dissosieres ved enzymatisk nedbrytning. (Ml) ved 37 °C i 20 minutter, og deretter mekanisk malt i DMEM tilsatt 10 % føtalt bovint serum. Cellene ble sådd på dekkglass belagt med polylysin med en tetthet på 2 × 10⁶ per 6 cm kulturskål eller med en tetthet på 0,5 × 10⁶ celler/cm² for bildeanalyse. Etter 4 timer ble mediet erstattet med Neurobasal serumfritt medium som inneholdt 1 % B27-tilskudd og 0,5 mM GlutaMax. Nevronene ble deretter holdt ved 37 °C og 5 % CO2 gjennom hele eksperimentet, og tilført mat én gang i uken. For å indusere rekombinasjon in vitro ble 3 μl (24-brønns kulturskål) eller 0,5 μl (24-brønns plate) av følgende AAV9-virusvektor brukt til å behandle nevroner på den andre dagen in vitro: AAV9.CMV.PI.eGFP. WPRE.bGH (Addgene, katalognummer 105530-AAV9) og AAV9.CMV.HI.eGFP-Cre.WPRE.SV40 (Addgene, katalognummer 105545-AAV9).
Mus Mfn1 og Mfn2 komplementært DNA (hentet fra henholdsvis Addgene plasmid #23212 og #23213) er merket med V5-sekvensen (GKPIPNPLLGLDST) ved C-terminalen, og er fusjonert med mCherry i ramme gjennom T2A-sekvensen. Grx1-roGFP2 er en gave fra Heidelberg TP Dick DFKZ (Deutsches Krebsforschungszentrum). Ved å erstatte tdTomato-kassetten ved hjelp av konvensjonelle kloningsmetoder, ble kassetten subklonet inn i pAAV-CAG-FLEX-tdTomato-ryggraden (Addgene referansenummer 28306) for å generere pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5, pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN1-V5 og pAAV-CAG-FLEX-Grx-roGFP2-vektorer. En lignende strategi ble brukt for å generere kontrollvektoren pAAV-CAG-FLEX-mCherry. For å generere AAV-shPCx-konstruksjonen kreves en plasmid-AAV-vektor (VectorBuilder, pAAV [shRNA] -CMV-mCherry-U6-mPcx- [shRNA#1]), som inneholder DNA-sekvensen som koder for shRNA-et som er rettet mot muse-PCx (5′CTTTCGCTCTAAGGTGCTAAACTCGAGTTTAGCACCTTAGAGCGAAAG 3′). Under kontroll av U6-promotoren brukes mCherry under kontroll av CMV-promotoren. Produksjonen av hjelpe-AAV-vektorer ble utført i henhold til produsentens instruksjoner (Cell Biolabs). Kort sagt, bruk et overføringsplasmid som forbigående bærer mCherry-T2A-MFN2-V5 (pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5), mCherry-T2A-MFN1-V5 (pAAV-CAG-FLEX-mCherry). Transfeksjon av 293AAV-celler-T2A-MFN1-V5), mCherry (pAAV-CAG-FLEX-mCherry) eller Grx-roGFP2 (pAAV-CAG-FLEX-Grx-roGFP2) kodende gen, samt kodende for AAV1-kapsidprotein og tilbehørsprotein. Pakking av plasmidplasmid, ved bruk av kalsiumfosfatmetoden. Den rå virussupernatanten ble oppnådd ved fryse-tine-sykluser i et tørris/etanolbad og lysert celler i fosfatbufret saltvann (PBS). AAV-vektoren ble renset ved diskontinuerlig jodiksanolgradient-ultrasentrifugering (24 timer ved 32 000 rpm og 4 °C) og konsentrert ved bruk av et Amicon ultra-15 sentrifugalfilter. Genomtiter av AAV1-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5 [2,9 × 1013 genomkopi (GC)/ml], AAV1-CAG-FLEX-mCherry (6,1 × 1012 GC/ml), AAV1-CAG-FLEX ble som tidligere beskrevet (54), målt ved sanntids kvantitativ PCR (qPCR) -MFN1-V5 (1,9 × 1013 GC/ml) og AAV1-CAG-FLEX-Grx-roGFP2 (8,9 × 1012 GC/ml).
Primære nevroner ble skrapt av i iskald 1x PBS, pelletert og deretter homogenisert i 0,5 % Triton X-100 / 0,5 % natriumdeoksykolat/PBS-lysebuffer som inneholdt fosfatase og proteasehemmer (Roche). Proteinkvantifisering ble utført ved bruk av bicinkoninsyreanalyse (Thermo Fisher Scientific). Proteinene ble deretter separert ved SDS-polyakrylamidgelelektroforese og deretter blottet på en polyvinylidenfluoridmembran (GE Healthcare). Blokker uspesifikke steder og inkuber med det primære antistoffet (se tabell S1 for detaljer) i 5 % melk i TBST (Tris-bufret saltvann med Tween), vasketrinn og sekundært antistoff i TBST Incubate. Inkuber med primært antistoff over natten ved +4 °C. Etter vask, påfør det sekundære antistoffet i 2 timer ved romtemperatur. Deretter, ved å inkubere det samme blottet med et anti-β-aktin-antistoff, ble den samme mengden bekreftet. Deteksjon ved å konvertere til kjemiluminescens og forsterke kjemiluminescens (GE Healthcare).
Nevronene som tidligere var sådd på dekkglass ble fiksert med 4 % paraformaldehyd (PFA)/PBS på det angitte tidspunktet ved romtemperatur i 10 minutter. Dekkglassene ble først permeert med 0,1 % Triton X-100/PBS i 5 minutter ved romtemperatur, og deretter i blokkeringsbuffer [3 % bovint serumalbumin (BSA)/PBS]. På den andre dagen ble dekkglassene vasket med blokkeringsbuffer og inkubert med det passende fluoroforkonjugerte sekundære antistoffet i 2 timer ved romtemperatur. Til slutt ble prøvene vasket grundig i PBS med 4′,6-diamidino-2-fenylindol (DAPI) motfarget og deretter fiksert på objektglass med Aqua-Poly/Mount.
Mus (hanner og hunner) ble bedøvet ved intraperitoneal injeksjon av ketamin (130 mg/kg) og xylazin (10 mg/kg) og administrert subkutant med karprofen-analgetikum (5 mg/kg). De ble plassert i et stereotaktisk instrument (Kopf) utstyrt med en varm pute. Avdekk hodeskallen og bruk en tannbor til å tynne ut den delen av lillehjernen som tilsvarer mis-benet (fra lambda: hale 1,8, lateral 1, tilsvarer lobuli IV og V). Bruk en buet sprøytenål ​​til å forsiktig lage et lite hull i hodeskallen for å unngå å forstyrre vaskulaturen nedenfor. Deretter settes den tynne, trukne glasskapillæren sakte inn i mikrohullet (fra -1,3 til -1 på ventralsiden av dura mater), og 200 til 300 nl AAV injiseres i mikroinjektoren (Narishige) med manuelle sprøyter (Narishige) flere ganger ved lavt trykk over en periode på 10 til 20 minutter. Etter infusjonen, plasser kapillærrøret i ytterligere 10 minutter for å la viruset spre seg fullstendig. Etter at kapillærrørene er trukket tilbake, sys huden forsiktig for å minimere sårbetennelse og la dyret komme seg. Dyrene ble behandlet med smertestillende midler (caspofen) i flere dager etter operasjonen, i løpet av hvilken tid deres fysiske tilstand ble nøye overvåket, og deretter ble de avlivet på det angitte tidspunktet. Alle prosedyrer ble utført i samsvar med europeiske, nasjonale og institusjonelle retningslinjer og ble godkjent av LandesamtfürNatur of Umwelt and Verbraucherschutz, Nordrhein-Westfalen, Tyskland.
Dyrene ble bedøvet med ketamin (100 mg/kg) og xylazin (10 mg/kg), og hjertet ble først perfusert med 0,1 M PBS, og deretter med 4 % PFA i PBS. Vevet ble dissekert og fiksert i 4 % PFA/PBS over natten ved 4 °C. En vibrerende kniv (Leica Microsystems GmbH, Wien, Østerrike) ble brukt til å fremstille sagittale snitt (50 μm tykke) fra den fikserte hjernen i PBS. Med mindre annet er spesifisert, ble farging av frittflytende snitt utført som beskrevet ovenfor (13) ved romtemperatur og omrøring. Kort sagt, først ble de oppnådde skivene permeabilisert med 0,5 % Triton X-100/PBS i 15 minutter ved romtemperatur; for noen epitoper (Pcx og Shmt2), ved å varme skivene i tris-EDTA-buffer ved 80 °C (pH 9) i 25 minutter i stedet for dette trinnet. Deretter ble snittene inkubert med primært antistoff (se tabell S1) i blokkeringsbuffer (3 % BSA/PBS) ved 4 °C over natten under omrøring. Neste dag ble snittene vasket med blokkeringsbuffer og inkubert med det passende fluoroforkonjugerte sekundære antistoffet i 2 timer ved romtemperatur. Til slutt ble snittene vasket grundig i PBS, motfarget med DAPI og deretter fiksert med AquaPolymount på et objektglass.
Et laserskanningskonfokalmikroskop (TCS SP8-X eller TCS Digital Light Sheet, Leica Microsystems) utstyrt med en hvitlyslaser og en 405-diode ultrafiolett laser ble brukt til å avbilde prøven. Ved å eksitere fluoroforen og samle inn signalet med Hybrid Detector (HyDs), ble LAS-X-programvare brukt til å samle inn stablede bilder i samsvar med Nyquist-sampling i sekvensiell modus: for ikke-kvantitative paneler er det svært dynamiske signaler (for eksempel i somatiske celler og dendritter) (mtYFP). Bruk HyD til å detektere antall PN-er i BrightR-modus). Gating fra 0,3 til 6 ns brukes for å redusere bakgrunnsstråling.
Sanntidsavbildning av sorterte celler. Etter sortering i Neurobasal-A-medium som inneholdt 1 % B27-tilskudd og 0,5 mM GlutaMax, ble cellene umiddelbart sådd på poly-l-lysin-belagte glassplater (μ-Slide8 Well, Ibidi, katalognummer 80826), og deretter holdt ved 37 °C og 5 % CO2 i 1 time for å la cellene sette seg. Sanntidsavbildning ble utført på et Leica SP8 laserskanningskonfokalmikroskop utstyrt med en hvit laser, HyD, 63 × [1,4 numerisk apertur (NA)] oljeobjektivlinse og et varmetrinn.
Musen ble raskt bedøvet med karbondioksid og halshugget. Hjernen ble raskt fjernet fra hodeskallen og kuttet i sagittale snitt med en tykkelse på 200 μm (for 13C-merkingseksperimentet) eller 275 μm (for to fotoneksperimenter) fylt med følgende materialer. Iskremen (HM-650 V, Thermo Fisher Scientific, Walldorf, Tyskland) er fylt med følgende stoffer: 125 mM iskald, karbonmettet (95 % O2 og 5 % CO2) lav-Ca2 + kunstig cerebrospinalvæske (ACSF) NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM natriumfosfatbuffer, 25 mM NaHCO3, 25 mM glukose, 0,5 mM CaCl2 og 3,5 mM MgCl2 (osmotisk trykk på 310 til 330 mmol). Overfør de oppnådde hjerneskivene til et preinkubasjonskammer som inneholder høyere Ca2 + ACSF (125,0 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM natriumfosfatbuffer, 25,0 mM NaHCO3, 25,0 mM d-glukose, 1,0 mM CaCl2 og 2,0 mM MgCl2) Medium) pH 7,4 og 310 til 320 mmol).
Under avbildningsprosessen ble skivene flyttet til et dedikert avbildningsrom, og eksperimentet ble utført under kontinuerlig ACSF-perfusjon ved en konstant temperatur på 32° til 33°C. Et multifotonlaserskanningsmikroskop (TCS SP8 MP-OPO, Leica Microsystems) utstyrt med en Leica 25x objektivlinse (NA 0,95, vann), Ti:Sapphire-laser (Chameleon Vision II, Coherent) ble brukt til skiveavbildning. FLIM-modul (PicoHarp300, PicoQuant).
FLIM av Grx1-roGFP2. Endringene i den cytoplasmatiske redokstilstanden til PN-er ble målt med to-foton FLIM i sagittale hjerneskiver, hvor Grx1-roGFP2-biosensoren målrettet PN-er. I PN-laget velges opptaksfeltet omtrent 50 til 80 μm under skiveoverflaten for å sikre at det er en levedyktig PN (det vil si mangel på perlestruktur eller neuronale morfologiske endringer langs dendrittene) og den dobbelt positive roGFP2-sensoren og AAV-kodende shRNA PCx eller dens kontrollsekvens (hver med mCherry som uttrykker). Samle enkeltstabelbilder med 2x digital zoom [eksitasjonsbølgelengde: 890 nm; 512 nm 512 piksler]. Deteksjon: intern HyD, fluoresceinisotiocyanat (FITC) filtergruppe] og bildegjennomsnitt innen 2 til 3 minutter brukes for å sikre at nok fotoner samles inn (1000 fotoner totalt) for kurvetilpasning. Sensitiviteten til Grx1-roGFP2-proben og verifiseringen av FLIM-forholdene ble utført ved å overvåke levetidsverdien til roGFP2 når eksogent 10 mM H2O2 ble tilsatt til perfusjons-ACSF (for å maksimere oksidasjon, noe som resulterer i økt levetid), og deretter tilsatt 2 mM ditiotreitol (minimerer reduksjonsgraden, noe som resulterer i en reduksjon i levetid) (figur S8, D til G). Bruk FLIMfit 5.1.1-programvaren til å analysere de innhentede resultatene, tilpass den enkle eksponensielle forfallskurven for hele bildet til den målte IRF (instrumentresponsfunksjon), og χ2 er omtrent 1. For å beregne levetiden til en enkelt PN ble masken rundt nervelegemet tegnet manuelt, og den gjennomsnittlige levetiden i hver maske ble brukt til kvantifisering.
Mitokondriepotensialanalyse. Etter at den akutte seksjonen ble inkubert med 100 nM TMRM direkte tilsatt den perfuserte ACSF i 30 minutter, ble endringene i mitokondriepotensialet til PN-ene målt med et tofotonmikroskop. TMRM-avbildning ble utført ved å eksitere proben ved 920 nm og bruke intern HyD (tetrametylrhodaminisotiocyanat: 585/40 nm) for å samle inn signaler; ved å bruke samme eksitasjonsbølgelengde, men bruke en annen intern HyD (FITC: 525/50) for å avbilde mtYFP. Bruk ImageJs Image Calculator-plugin for å evaluere mitokondriepotensialet på enkeltcellenivå. Kort sagt brukes plugin-ligningen: signal = min (mtYFP, TMRM) for å identifisere mitokondrieregionen som viser TMRM-signalet i Purkinje Somali i det konfokale bildet av den tilsvarende kanalen. Deretter kvantifiseres pikselområdet i den resulterende masken, og normaliseres deretter på det tilsvarende terskel-enkeltstabelbildet av mtYFP-kanalen for å oppnå den mitokondrielle fraksjonen som viser mitokondriepotensialet.
Bildet ble dekonvolvert med Huygens Pro (Scientific Volume Imaging)-programvaren. For de skannede bildene av fliser lages montasjen av en enkelt flis ved hjelp av den automatiske syalgoritmen levert av LAS-X-programvaren. Etter bildekalibrering, bruk ImageJ og Adobe Photoshop for å behandle bildet videre og justere lysstyrke og kontrast jevnt. Bruk Adobe Illustrator for grafisk forberedelse.
mtDNA-fokusanalyse. Antall mtDNA-lesjoner ble kvantifisert på cerebellare seksjoner merket med antistoffer mot DNA ved hjelp av konfokalmikroskop. Hvert målområde ble opprettet for cellekroppen og kjernen i hver celle, og det respektive området ble beregnet ved hjelp av Multi Measure-pluginen (ImageJ-programvare). Trekk kjernearealet fra cellekroppsarealet for å få det cytoplasmatiske området. Til slutt ble Analyze Particles-pluginen (ImageJ-programvare) brukt til å automatisk kvantifisere de cytoplasmatiske DNA-punktene som indikerer mtDNA på terskelbildet, og de oppnådde resultatene ble normalisert til PN-gjennomsnittet for CTRL-mus. Resultatene uttrykkes som gjennomsnittlig antall nukleosider per celle.
Proteinuttrykksanalyse. Bruk ImageJs Image Calculator-plugin for å evaluere proteinuttrykk i PN på enkeltcellenivå. Kort sagt, i det enkeltlags konfokale bildet av den tilsvarende kanalen, gjennom ligningen: signal = min (mtYFP, antistoff), identifiseres den mitokondrielle regionen som viser immunreaktivitet mot et bestemt antistoff i Purkina. Deretter kvantifiseres pikselområdet i den resulterende masken, og normaliseres deretter på det tilsvarende terskel-enkeltstabelbildet av mtYFP-kanalen for å oppnå den mitokondrielle fraksjonen av det viste proteinet.
Analyse av Purkinje-celletetthet. Cell Counter-pluginen til ImageJ ble brukt til å evaluere Purkinje-tetthet ved å dele antallet Purkinje-celler som ble telt med lengden på lillehjernen som var okkupert av de telte cellene.
Prøveforberedelse og innsamling. Hjernene fra kontrollgruppen og Mfn2cKO-mus ble fiksert i 2 % PFA/2,5 % glutaraldehyd i 0,1 M fosfatbuffer (PB), og deretter ble koronale snitt fremstilt ved bruk av ciliater (Leica Mikrosysteme GmbH, Wien, Østerrike) (tykkelse 50 til 60 μm). Deretter ble de fiksert i PB-buffer i 1 % os-tetraoksid og 1,5 % kaliumferrocyanid ved romtemperatur i 1 time. Snittene ble vasket tre ganger med destillert vann og deretter farget med 70 % etanol som inneholdt 1 % uranylacetat i 20 minutter. Snittene ble deretter dehydrert i gradert alkohol og innstøpt i Durcupan ACM (Araldite casting resin M) epoksyharpiks (Electron Microscopy Sciences, katalognummer 14040) mellom silikonbelagte glassplater, og til slutt polymerisert i ovnen ved 60 °C i 48 timer. Området med lillehjernenbark ble valgt ut, og 50 nm ultratynne snitt ble kuttet på Leica Ultracut (Leica Mikrosysteme GmbH, Wien, Østerrike) og plukket opp på et 2×1 mm kobberspaltegitter belagt med polystyrenfilm. Snittene ble farget med en løsning av 4 % uranylacetat i H2O i 10 minutter, vasket med H2O flere ganger, deretter med Reynolds blycitrat i H2O i 10 minutter, og deretter vasket med H2O flere ganger. Mikrografer ble tatt med et transmisjonselektronmikroskop Philips CM100 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) ved bruk av et TVIPS (Tietz Video and Image Processing System) TemCam-F416 digitalkamera (TVIPS GmbH, Gauting, USA, Tyskland).
For mus infisert med AAV ble hjernen separert og skåret i en 1 mm tykk sagittal seksjon, og lillehjernen ble undersøkt med et fluorescensmikroskop for å identifisere den AAV-infiserte ringen (det vil si mCherry-ekspresjon). Kun eksperimenter der AAV-injeksjon resulterer i en svært høy transduksjonseffektivitet av Purkinje-cellelaget (dvs. nesten hele laget) i minst to påfølgende lillehjerneringer brukes. Den AAV-transduserte løkken ble mikrodissekert for fiksering over natten (4 % PFA og 2,5 % glutaraldehyd i 0,1 M kokatbuffer) og videre bearbeidet. For EPON-innstøping ble det fikserte vevet vasket med 0,1 M natriumkokatbuffer (Applichem) og inkubert med 2 % OsO4 (os, Science Services; Caco) i 0,1 M natriumkokatbuffer (Applichem) i 4 timer, deretter vasket i 2 timer. Gjenta 3 ganger med 0,1 M kokamidbuffer. Deretter ble den stigende serien med etanol brukt til å inkubere hver etanoloppløsning ved 4 °C i 15 minutter for å dehydrere vevet. Vevet ble overført til propylenoksid og inkubert over natten i EPON (Sigma-Aldrich) ved 4 °C. Plasser vevet i frisk EPON ved romtemperatur i 2 timer, og legg det deretter inn ved 62 °C i 72 timer. Bruk en ultramikrotom (Leica Microsystems, UC6) og en diamantkniv (Diatome, Biel, Sveits) til å skjære 70 nm ultratynne snitt, og farge med 1,5 % uranylacetat i 15 minutter ved 37 °C, og farge med blycitratoppløsning i 4 minutter. Elektronmikrofotografiene ble tatt med et JEM-2100 Plus transmisjonselektronmikroskop (JEOL) utstyrt med Camera OneView 4K 16-bit (Gatan) og DigitalMicrograph-programvare (Gatan). For analyse ble elektronmikrografer tatt med 5000× eller 10 000× digital zoom.
Morfologisk analyse av mitokondrier. For alle analyser ble konturene til individuelle mitokondrier manuelt skissert i digitale bilder ved hjelp av ImageJ-programvaren. Ulike morfologiske parametere analyseres. Mitokondrietettheten uttrykkes som en prosentandel oppnådd ved å dele det totale mitokondriearealet til hver celle med cytoplasmaarealet (cytoplasmaareal = celleareal-cellekjerneareal) × 100. Rundheten til mitokondriene beregnes med formelen [4π∙(areal/omkrets 2)]. Mitokondrienes ista-morfologi ble analysert og delt inn i to kategorier («rørformede» og «blister») i henhold til deres hovedformer.
Analyse av antall og tetthet av autofagosomer/lysosomer. Bruk ImageJ-programvaren til å manuelt skissere konturene til hvert autofagosom/lysosom i det digitale bildet. Autofagosom-/lysosomarealet uttrykkes som en prosentandel beregnet ved å dele det totale autofagosom-/lysosomstrukturarealet til hver celle med cytoplasmaarealet (cytoplasmaareal = celleareal-kjerneareal) × 100. Tettheten av autofagosomer/lysosomer beregnes ved å dele det totale antallet med antall autofagosom-/lysosomstrukturer per celle (i form av cytoplasmaareal) (cytoplasmatisk areal = celleareal-kjerneareal).
Merking for akutt seksjonering og prøvepreparering. For eksperimenter som krever glukosemerking, overfør de akutte hjerneskivene til et preinkubasjonskammer, som inneholder mettet karbon (95 % O2 og 5 % CO2), ACSF med høyt Ca2+-innhold (125,0 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM natriumfosfatbuffer, 25,0 mM NaHCO3, 25,0 mM d-glukose, 1,0 mM CaCl2 og 2,0 mM MgCl2, justert til pH 7,4 og 310 til 320 mOsm), hvor glukose er 13C6-glukosesubstitusjon (Eurisotop, katalognummer CLM-1396). For eksperimenter som krever pyruvatmerking, overfør de akutte hjerneskivene til høyere Ca2 + ACSF (125,0 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM natriumfosfatbuffer, 25,0 mM NaHCO3, 25,0 mM d-glukose, 1,0 mM CaCl2 og tilsett 2,0 mM MgCl2, juster til pH 7,4 og 310 til 320 mOsm), og tilsett 1 mM 1-[1-13C]pyruvat (Eurisotop, katalognummer CLM-1082). Inkuber snittene i 90 minutter ved 37 °C. På slutten av eksperimentet ble snittene raskt vasket med en vandig løsning (pH 7,4) som inneholdt 75 mM ammoniumkarbonat, og deretter homogenisert i 40:40:20 (v:v:v) acetonitril (ACN): metanol:vann. Etter at snittene var inkubert på is i 30 minutter, ble prøvene sentrifugert ved 21 000 g i 10 minutter ved 4 °C, og den klare supernatanten ble tørket i en SpeedVac-konsentrator. Den resulterende tørkede metabolittpelleten ble lagret ved -80 °C inntil analyse.
Væskekromatografi-massespektrometri-analyse av 13C-merkede aminosyrer. For væskekromatografi-massespektrometri (LC-MS)-analyse ble metabolittpelleten resuspendert i 75 μl vann av LC-MS-kvalitet (Honeywell). Etter sentrifugering ved 21 000 g i 5 minutter ved 4 °C ble 20 μl av den klarnede supernatanten brukt til aminosyrefluksanalyse, mens resten av ekstraktet umiddelbart ble brukt til anionanalyse (se nedenfor). Aminosyreanalyse ble utført ved bruk av den tidligere beskrevne benzoylkloridderivatiseringsprotokollen (55, 56). I det første trinnet ble 10 μl 100 mM natriumkarbonat (Sigma-Aldrich) tilsatt til 20 μl metabolittekstrakt, og deretter ble 10 μl 2 % benzoylklorid (Sigma-Aldrich) tilsatt til LC-kvalitet ACN. Prøven ble virvles kort og deretter sentrifugert ved 21 000 g i 5 minutter ved 20 °C. Overfør den klarede supernatanten til et 2 ml autosampler-ampulle med et konisk glassinnsats (200 μl volum). Prøvene ble analysert ved hjelp av Acquity iClass ultra-høyytelses LC-system (Waters) koblet til Q-Exactive (QE)-HF (Ultra High Field Orbitrap) høyoppløselig presisjonsmassespektrometer (Thermo Fisher Scientific). For analyse ble 2 μl av den derivatiserte prøven injisert i en 100 × 1,0 mm høyfast silika T3-kolonne (Waters) som inneholdt 1,8 μm partikler. Strømningshastigheten er 100 μl/min, og buffersystemet består av buffer A (10 mM ammoniumformiat og 0,15 % maursyre i vann) og buffer B (ACN). Gradienten er som følger: 0 % B ved 0 minutter; 0 % B. 0 til 15 % B ved 0 til 0,1 minutter; 15 til 17 % B ved 0,1 til 0,5 minutter; B ved 17 til 55 % ved 0,5 til 14 minutter; B ved 55 til 70 % ved 14 til 14,5 minutter; ved 14,5 til 70 til 100 % B ved 18 minutter; 100 % B ved 18 til 19 minutter; 100 til 0 % B ved 19 til 19,1 minutter; 0 % B ved 19,1 til 28 minutter (55, 56). QE-HF-massespektrometeret opererer i positiv ioniseringsmodus med et masseområde på m/z (masse/ladningsforhold) på 50 til 750. Den anvendte oppløsningen er 60 000, og det oppnådde forsterkningskontroll-ionemålet (AGC) er 3 × 10⁶, og den maksimale ionetiden er 100 millisekunder. Den oppvarmede elektrosprayioniseringskilden (ESI) opererer med en sprayspenning på 3,5 kV, en kapillærtemperatur på 250 °C, en kappeluftstrøm på 60 AU (vilkårlige enheter) og en hjelpeluftstrøm på 20 AU til 250 °C. S-linsen er satt til 60 AU.
Anionkromatografi-MS-analyse av 13C-merkede organiske syrer. Det gjenværende metabolittutfellingen (55 μl) ble analysert ved hjelp av et Dionex-ionekromatografisystem (ICS 5000+, Thermo Fisher Scientific) koblet til et QE-HF massespektrometer (Thermo Fisher Scientific). Kort fortalt ble 5 μl metabolittekstrakt injisert i en Dionex IonPac AS11-HC-kolonne utstyrt med HPLC (2 mm × 250 mm, partikkelstørrelse 4 μm, Thermo Fisher Scientific) i push-in delvis sløyfemodus med et fyllingsforhold på 1. Dionex IonPac AG11-HC beskyttelseskolonne (2 mm x 50 mm, 4 μm, Thermo Fisher Scientific). Kolonnetemperaturen holdes ved 30 °C, og autosampleren er satt til 6 °C. Bruk en kaliumhydroksidpatron levert med avionisert vann for å generere en kaliumhydroksidgradient gjennom eluentgeneratoren. Separasjon av metabolitter med en strømningshastighet på 380 μl/min, med følgende gradient: 0 til 3 minutter, 10 mM KOH; 3 til 12 minutter, 10 til 50 mM KOH; 12 til 19 minutter, 50 til 100 mM KOH; 19 til 21 minutter, 100 mM KOH; 21 til 21,5 minutter, 100 til 10 mM KOH. Kolonnen ble re-ekvilibrert under 10 mM KOH i 8,5 minutter.
De eluerte metabolittene kombineres med en 150 μl/min isopropanol-tilskuddsstrøm etter kolonnen og ledes deretter til et høyoppløselig massespektrometer som opererer i negativ ioniseringsmodus. MS overvåker masseområdet fra m/z 50 til 750 med en oppløsning på 60 000. AGC er satt til 1 × 106, og maksimal ionetid holdes på 100 ms. Den oppvarmede ESI-kilden ble drevet med en sprayspenning på 3,5 kV. De andre innstillingene for ionekilden er som følger: kapillærtemperatur 275 °C; kappegasstrøm, 60 AU; hjelpegasstrøm, 20 AU ved 300 °C, og S-linseinnstilling til 60 AU.
Dataanalyse av 13C-merkede metabolitter. Bruk TraceFinder-programvare (versjon 4.2, Thermo Fisher Scientific) for dataanalyse av isotopforholdet. Identiteten til hver forbindelse ble verifisert av en pålitelig referanseforbindelse og analysert uavhengig. For å utføre isotopberikelsesanalyse ble arealet av det ekstraherte ionkromatogrammet (XIC) for hver 13C-isotop (Mn) ekstrahert fra [M + H]+, hvor n er karbontallet til målforbindelsen, brukt til å analysere aminosyrer, eller [MH]+ brukes til å analysere anioner. Massenøyaktigheten til XIC er mindre enn fem deler per million, og nøyaktigheten til RT er 0,05 minutter. Berikelsesanalysen utføres ved å beregne forholdet mellom hver detekterte isotop og summen av alle isotoper av den tilsvarende forbindelsen. Disse forholdstallene er gitt som prosentverdier for hver isotop, og resultatene uttrykkes som molar prosentberikelse (MPE), som beskrevet tidligere (42).
Den frosne nevronpelleten ble homogenisert i iskald 80 % metanol (v/v), virvles og inkubert ved -20 °C i 30 minutter. Virvles prøven igjen og rør ved +4 °C i 30 minutter. Prøven ble sentrifugert ved 21 000 g i 5 minutter ved 4 °C, og deretter ble den resulterende supernatanten samlet og tørket ved hjelp av en SpeedVac-konsentrator ved 25 °C for senere analyse. Som beskrevet ovenfor ble LC-MS-analyse utført på aminosyrene i de sorterte cellene. Ved hjelp av TraceFinder (versjon 4.2, Thermo Fisher Scientific) ble dataanalyse utført ved bruk av den monoisotopiske massen til hver forbindelse. Kvantilnormalisering av metabolittdata ble utført ved hjelp av preprocessCore-programvarepakken (57).
Forberedelse av snitt. Musen ble raskt bedøvet med karbondioksid og halshugget, hjernen ble raskt fjernet fra hodeskallen, og den isfylte vibrerende kniven (HM-650 V, Thermo Fisher Scientific, Walldorf, Tyskland) ble brukt til å skjære den i sagittale snitt på 300 til 375 μm. Kald karbongassing (95 % O2 og 5 % CO2) Lavt Ca2 + ACSF (125,0 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM natriumfosfatbuffer, 25,0 mM NaHCO3, 25,0 mM d-glukose, 1,0 mM CaCl2 og 6,0 mM MgCl2. Juster til pH 7,4 og 310 til 330 mOsm). Overfør de oppnådde hjerneskivene til et kammer som inneholder høyere Ca2 + ACSF (125,0 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM natriumfosfatbuffer, 25,0 mM NaHCO3, 25,0 mM d-glukose, 4,0 mM CaCl2 og mM 3,5 MgCl2) pH 7,4 og 310 til 320 mOsm). Oppbevar skivene i 20 til 30 minutter slik at de kan gjenopprettes før opptak.
opptak. Et mikroskopbord utstyrt med et fast opptakskammer og en 20x vann-immersionsobjektivlinse (Scientifica) ble brukt til alle opptakene. De antatte Purkinje-cellene ble identifisert ved (i) kroppsstørrelse, (ii) anatomisk plassering av lillehjernen og (iii) uttrykk av det fluorescerende mtYFP-reportergenet. Patch-pipetten med en spissmotstand på 5 til 11 megohm trekkes ut av en borsilikatglasskapillær (GB150-10, 0,86 mm × 1,5 mm × 100 mm, Science Products, Hofheim, Tyskland) og en horisontal Instruments-pipette (P-1000, Sutter), Novato, CA). Alle opptak ble utført av ELC-03XS npi patch clamp-forsterker (npi electronic GmbH, Tam, Tyskland), som ble kontrollert av programvaren Signal (versjon 6.0, Cambridge Electronic, Cambridge, Storbritannia). Eksperimentet ble tatt opp med en samplingsfrekvens på 12,5 kHz. Signalet filtreres med to kortpass Bessel-filtre med grensefrekvenser på henholdsvis 1,3 og 10 kHz. Kapasitansen til membranen og pipetten kompenseres av kompensasjonskretsen ved hjelp av forsterkeren. Alle eksperimentene ble utført under kontroll av et Orca-Flash 4.0-kamera (Hamamatsu, Gerden, Tyskland), som ble kontrollert av Hokawo-programvaren (versjon 2.8, Hamamatsu, Gerden, Tyskland).
Rutinemessig helcellekonfigurasjon og -analyse. Rett før opptak fylles pipetten med den interne løsningen som inneholder følgende stoffer: 4,0 mM KCl, 2,0 mM NaCl, 0,2 mM EGTA, 135,0 mM kaliumglukonat, 10,0 mM Hepes, 4,0 mM ATP (Mg), 0,5 mM guanosintrifosfat (GTP) (Na) og 10,0 mM kreatininfosfat ble justert til pH 7,25, og det osmotiske trykket var 290 mOsm (sukrose). Umiddelbart etter at en kraft på 0 pA ble påført for å sprekke membranen, ble hvilemembranpotensialet målt. Inngangsmotstanden måles ved å påføre hyperpolariserte strømmer på -40, -30, -20 og -10 pA. Mål størrelsen på spenningsresponsen og bruk Ohms lov til å beregne inngangsmotstanden. Spontan aktivitet ble registrert i en spenningstang i 5 minutter, og sPSC ble identifisert og målt i Igor Pro (versjon 32 7.01, WaveMetrics, Lake Oswego, Oregon, USA) ved hjelp av et halvautomatisk gjenkjenningsskript. IV-kurven og steady-state-strømmen måles ved å klemme batteriet ved forskjellige potensialer (startende fra -110 mV) og øke spenningen i trinn på 5 mV. Produksjonen av AP ble testet ved å påføre en depolariserende strøm. Klem cellen ved -70 mV mens du påfører en depolariserende strømpuls. Juster trinnstørrelsen for hver opptaksenhet separat (10 til 60 pA). Beregn den maksimale AP-frekvensen ved å manuelt telle pulstoppene som forårsaker den høyeste AP-frekvensen. AP-terskelen analyseres ved å bruke den andre deriverte av depolarisasjonspulsen som først utløser en eller flere AP-er.
Konfigurasjon og analyse av perforert patch. Utfør perforert patch-registrering ved hjelp av standardprotokoller. Bruk en ATP- og GTP-fri pipette som ikke inneholder følgende ingredienser: 128 mM glukonat K, 10 mM KCl, 10 mM Hepes, 0,1 mM EGTA og 2 mM MgCl2, og juster til pH 7,2 (ved bruk av KOH). ATP og GTP utelates fra den intracellulære løsningen for å forhindre ukontrollert permeabilitet av cellemembranen. Patch-pipetten fylles med en amfotericinholdig intern løsning (omtrent 200 til 250 μg/ml; G4888, Sigma-Aldrich) for å oppnå en stanset patch-registrering. Amfotericin ble løst opp i dimetylsulfoksid (sluttkonsentrasjon: 0,1 til 0,3 %; DMSO; D8418, Sigma-Aldrich). Konsentrasjonen av DMSO som ble brukt hadde ingen signifikant effekt på de studerte nevronene. Under stanseprosessen ble kanalmotstanden (Ra) kontinuerlig overvåket, og eksperimentet ble startet etter at amplituden til Ra og AP stabiliserte seg (20–40 minutter). Spontan aktivitet måles i en spennings- og/eller strømtang i 2 til 5 minutter. Dataanalyse ble utført ved hjelp av Igor Pro (versjon 7.05.2, WaveMetrics, USA), Excel (versjon 2010, Microsoft Corporation, Redmond, USA) og GraphPad Prism (versjon 8.1.2, GraphPad Software Inc., La Jolla, CA). For å identifisere spontane AP-er brukes IgorPros NeuroMatic v3.0c-plugin. Identifiser AP-er automatisk ved hjelp av en gitt terskel, som justeres individuelt for hver post. Bruk spikeintervallet til å bestemme spikefrekvensen med den maksimale øyeblikkelige spikefrekvensen og den gjennomsnittlige spikefrekvensen.
PN-isolering. Ved å tilpasse seg den tidligere publiserte protokollen ble PN-er renset fra muse-lillehjernen på et spesifisert stadium (58). Kort sagt ble lillehjernen dissekert og finhakket i iskaldt dissosiasjonsmedium [uten HBSS Ca2+ og Mg2+, tilsatt 20 mM glukose, penicillin (50 U/ml) og streptomycin (0,05 mg/ml)], og deretter ble mediet fordøyd i papain [HBSS, tilsatt 1-cystein·HCl (1 mg/ml), papain (16 U/ml) og deoksyribonuklease I (DNase I; 0,1 mg/ml)]. Behandlet i 30 minutter ved 30 °C. Vask først vevet i HBSS-medium som inneholder eggeslim (10 mg/ml), BSA (10 mg/ml) og DNase (0,1 mg/ml) ved romtemperatur for å forhindre enzymatisk fordøyelse, og deretter i HBSS-medium som inneholder 20 mM glukose. Mal forsiktig inn HBSS, penicillin (50 U/ml), streptomycin (0,05 mg/ml) og DNase (0,1 mg/ml) for å frigjøre enkeltceller. Den resulterende cellesuspensjonen ble filtrert gjennom en 70 μm cellefilter, deretter ble cellene pelletert ved sentrifugering (1110 rpm, 5 minutter, 4 °C) og resuspendert i sorteringsmedium [HBSS, tilsatt 20 mM glukose, 20 % føtalt bovint serum, penicillin (50 U/ml) og streptomycin (0,05 mg/ml)]; evaluer cellelevedyktighet med propidiumjodid og juster celletettheten til 1 × 10⁶ til 2 × 10⁶ celler/ml. Før flowcytometri ble suspensjonen filtrert gjennom en 50 μm cellefilter.
Flowcytometer. Cellesortering ble utført ved 4 °C ved bruk av FACSAria III-maskin (BD Biosciences) og FACSDiva-programvare (BD Biosciences, versjon 8.0.1). Cellesuspensjonen ble sortert ved bruk av en 100 μm dyse under et trykk på 20 psi med en hastighet på ~2800 hendelser/sek. Siden tradisjonelle gatingkriterier (cellestørrelse, bimodal diskriminering og spredningsegenskaper) ikke kan sikre korrekt isolering av PN fra andre celletyper, settes gatingstrategien basert på direkte sammenligning av YFP-intensiteten og autofluorescensen i mitoYFP+ ​​og kontroll-mitoYFP−-musene. YFP eksiteres ved å bestråle prøven med en 488 nm laserlinje, og signalet detekteres ved bruk av et 530/30 nm båndpassfilter. Hos mitoYFP+-mus brukes den relative styrken til Rosa26-mitoYFP-reportergenet også til å skille mellom nevrale kropps- og aksonfragmenter. 7-AAD eksiteres med en 561 nm gul laser og detekteres med et 675/20 nm båndpassfilter for å ekskludere døde celler. For å separere astrocytter samtidig ble cellesuspensjonen farget med ACSA-2-APC, deretter ble prøven bestrålt med en 640 nm laserlinje, og et 660/20 nm båndpassfilter ble brukt til å detektere signalet.
De innsamlede cellene ble pelletert ved sentrifugering (1110 rpm, 5 minutter, 4 °C) og lagret ved -80 °C inntil bruk. Mfn2cKO-mus og kullvalpene deres klassifiseres samme dag for å minimere prosedyremessig variasjon. FACS-datapresentasjon og -analyse ble utført ved hjelp av FlowJo-programvare (FlowJo LLC, Ashland, Oregon, USA).
Som nevnt ovenfor (59) brukes sanntids-PCR til å isolere DNA fra de sorterte nevronene for påfølgende mtDNA-kvantifisering. Lineariteten og terskelfølsomheten ble initialt testet ved å kjøre qPCR på forskjellige antall celler. Kort sagt, samle 300 PN i en lysisbuffer bestående av 50 mM tris-HCl (pH 8,5), 1 mM EDTA, 0,5 % Tween 20 og proteinase K (200 ng/ml) og inkuber ved 55 °C i 120 minutter. Cellene ble videre inkubert ved 95 °C i 10 minutter for å sikre fullstendig inaktivering av proteinase K. Ved hjelp av en TaqMan-probe (Thermo Fisher) spesifikk for mt-Nd1 ble mtDNA målt ved semi-kvantitativ PCR i 7900HT Real-Time PCR-systemet (Thermo Fisher Scientific). Science, katalognummer Mm04225274_s1), mt-Nd6 (Thermo Fisher Scientific, katalognummer AIVI3E8) og 18S (Thermo Fisher Scientific, katalognummer Hs99999901_s1) gener.
Proteomprøvepreparering. Ved å varme opp løsningen ved 95 °C i 10 minutter og sonikere i lyseringsbuffer [6 M guanidinklorid, 10 mM tris(2-karboksyetyl)fosfinhydroklorid, 10 mM kloracetamid og 100 mM tris-Lyse frosne nevronpellets i HCl]. På Bioruptor (Diagenode) i 10 minutter (30 sekunder puls / 30 sekunder pauseperiode). Prøven ble fortynnet 1:10 i 20 mM tris-HCl (pH 8,0), blandet med 300 ng trypsin-gull (Promega) og inkubert over natten ved 37 °C for å oppnå fullstendig fordøyelse. På den andre dagen ble prøven sentrifugert ved 20 000 g i 20 minutter. Supernatanten ble fortynnet med 0,1 % maursyre, og løsningen ble avsaltet med hjemmelagde StageTips. Prøven ble tørket i et SpeedVac-instrument (Eppendorf-konsentrator pluss 5305) ved 45 °C, og deretter ble peptidet suspendert i 0,1 % maursyre. Alle prøvene ble fremstilt samtidig av samme person. For å analysere astrocyttprøvene ble 4 μg avsaltede peptider merket med en tandemmassemerkelapp (TMT10plex, katalognummer 90110, Thermo Fisher Scientific) med et forhold mellom peptid og TMT-reagens på 1:20. For TMT-merking ble 0,8 mg TMT-reagens resuspendert i 70 μl vannfri ACN, og det tørkede peptidet ble rekonstituert i 9 μl 0,1 M TEAB (trietylammoniumbikarbonat), hvortil 7 μl TMT-reagens i ACN ble tilsatt. Konsentrasjonen var 43,75 %. Etter 60 minutters inkubasjon ble reaksjonen stoppet med 2 μl 5 % hydroksylamin. De merkede peptidene ble samlet, tørket, resuspendert i 200 μl 0,1 % maursyre (FA), delt i to og deretter avsaltet ved hjelp av hjemmelagde StageTips. Ved hjelp av UltiMate 3000 ultrahøyytelsesvæskekromatograf (UltiMate 3000 ultrahøyytelsesvæskekromatograf) ble en av de to halvdelene fraksjonert på en 1 mm x 150 mm Acquity kromatografisk kolonne fylt med 130 Å1,7 μm C18-partikler (Waters, katalognr. SKU: 186006935). Thermo Fisher Scientific). Separer peptidene med en strømningshastighet på 30 μl/min, separer fra 1 % til 50 % buffer B i 85 minutter med en trinnvis gradient på 96 minutter, fra 50 % til 95 % buffer B i 3 minutter, deretter 8 minutter for 95 % buffer B; Buffer A er 5 % ACN og 10 mM ammoniumbikarbonat (ABC), og buffer B er 80 % ACN og 10 mM ABC. Samle fraksjoner hvert 3. minutt og kombiner dem i to grupper (1 + 17, 2 + 18 osv.) og tørk dem i en vakuumsentrifuge.
LC-MS/MS-analyse. For massespektrometri ble peptidene (nummer r119.aq) separert på en 25 cm, 75 μm indre diameter PicoFrit-analysekolonne (ny objektivlinse, delenummer PF7508250) utstyrt med 1,9 μm ReproSil-Pur 120 C18-AQ medium (Dr. Maisch, mat), bruk EASY-nLC 1200 (Thermo Fisher Scientific, Tyskland). Kolonnen ble holdt ved 50 °C. Buffer A og B er henholdsvis 0,1 % maursyre i vann og 0,1 % maursyre i 80 % ACN. Peptidene ble separert fra 6 % til 31 % buffer B i 65 minutter og fra 31 % til 50 % buffer B i 5 minutter med en gradient på 200 nl/min. De eluerte peptidene ble analysert på et Orbitrap Fusion massespektrometer (Thermo Fisher Scientific). M/z-måling av peptidforløperen utføres med en oppløsning på 120 000 i området 350 til 1500 m/z. Ved bruk av 27 % normalisert kollisjonsenergi velges den sterkeste forløperen med en ladningstilstand på 2 til 6 for høyenergi-C-felledissosiasjons-(HCD)-spaltning. Syklustiden settes til 1 s. M/z-verdien til peptidfragmentet ble målt i ionefellen ved bruk av det minste AGC-målet på 5 × 104 og den maksimale injeksjonstiden på 86 ms. Etter fragmentering ble forløperen plassert på den dynamiske eksklusjonslisten i 45 sekunder. TMT-merkede peptider ble separert på en 50 cm, 75 μm Acclaim PepMap-kolonne (Thermo Fisher Scientific, katalognummer 164942), og migrasjonsspektrene ble analysert på et Orbitrap Lumos Tribrid massespektrometer (Thermo Fisher Scientific) utstyrt med høyfelts asymmetriske bølgeformioner (FAIMS) (Thermo Fisher Scientific) som opererer ved to kompensasjonsspenninger på −50 og −70 V. MS3 valgt basert på synkroniseringsforløperen brukes til måling av TMT-rapportionsignalet. Peptidseparasjonen ble utført på EASY-nLC 1200, ved bruk av en 90 % lineær gradienteluering, med en bufferkonsentrasjon på 6 % til 31 %; buffer A var 0,1 % FA, og buffer B var 0,1 % FA og 80 % ACN. Den analytiske kolonnen opereres ved 50 °C. Bruk FreeStyle (versjon 1.6, Thermo Fisher Scientific) for å dele den opprinnelige filen i henhold til FAIMS-kompensasjonsspenningen.
Proteinidentifikasjon og kvantifisering. Ved hjelp av den integrerte Andromeda-søkemotoren ble de opprinnelige dataene analysert med MaxQuant versjon 1.5.2.8 (https://maxquant.org/). I tillegg til Cre-rekombinase- og YFP-sekvensene hentet fra Aequorea victoria, ble peptidfragmentspektre søkt etter den kanoniske sekvensen og isoformsekvensen til musereferanseproteomet (Proteom-ID UP000000589, lastet ned fra UniProt i mai 2017). Metioninoksidasjon og protein N-terminal acetylering ble satt som variable modifikasjoner; cysteinkarbamoylmetylering ble satt som faste modifikasjoner. Fordøyelsesparametrene er satt til "spesifisitet" og "trypsin/P". Minimum antall peptider og barberpeptider som brukes for proteinidentifikasjon er 1; minimum antall unike peptider er 0. Under betingelsene for peptidkartmatching var proteinidentifikasjonsraten 0,01. Alternativet "Andre peptid" er aktivert. Bruk alternativet «match between runs» for å overføre vellykkede identifikasjoner mellom forskjellige originalfiler. Bruk LFQ minimum ratio count 1 for label-free quantification (LFQ) (60). LFQ-intensiteten filtreres for minst to gyldige verdier i minst én genotypegruppe på hvert tidspunkt, og ekstrapoleres fra en normalfordeling med en bredde på 0,0,3 og flyttes ned 1,8. Bruk Perseus computing platform (https://maxquant.net/perseus/) og R (https://r-project.org/) for å analysere LFQ-resultatene. En toveis moderat t-test fra limma-programvarepakken ble brukt til differensiell ekspresjonsanalyse (61). Utforskende dataanalyse utføres ved hjelp av ggplot, FactoMineR, factoextra, GGally og pheatmap. De TMT-baserte proteomikkdataene ble analysert ved hjelp av MaxQuant versjon 1.6.10.43. Søk etter rådata for proteomikk fra UniProts database for humane proteomikk, som ble lastet ned i september 2018. Analysen inkluderer korreksjonsfaktoren for isotoprenhet levert av produsenten. Bruk limma i R for differensiell uttrykkanalyse. De opprinnelige dataene, søkeresultatene i databasen og arbeidsflyten og resultatene for dataanalysen er alle lagret i ProteomeXchange-alliansen gjennom PRIDE-partnerlageret med datasettidentifikatoren PXD019690.
Funksjonelle annoteringer beriker analysen. Ingenuity Pathway Analysis (QIAGEN)-verktøyet ble brukt til å bestemme rikdommen til de funksjonelle annotasjonstermene i datasettet etter 8 uker (figur 1). Kort sagt brukes den kvantitative proteinlisten hentet fra LC-MS/MS (tandem massespektrometri) dataanalyse med følgende filterkriterier: Mus musculus er valgt som art og bakgrunn, og kategorien viser at P-verdien justert av Benjamini for anrikning 0,05 eller lavere anses som signifikant. For denne grafen vises de fem største overskytende kategoriene i hver klynge basert på den justerte P-verdien. Ved bruk av multippel t-test, bruk av det to-trinns lineære boost-programmet til Benjamini, Krieger og Yekutieli (Q = 5 %), utføres tidsforløpsproteinuttrykksanalyse på de viktige kandidatene identifisert i hver kategori, og hver rad analyseres separat. Det er ikke nødvendig å bruke en konsistent SD.
For å sammenligne resultatene fra denne studien med publiserte databaser og generere et Venn-diagram i figur 1, kombinerte vi den kvantitative proteinlisten med MitoCarta 2.0-annoteringer (24). Bruk nettverktøyet Draw Venn Diagram (http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/) for å generere diagrammet.
For detaljert informasjon om de statistiske prosedyrene som brukes for proteomikkanalyse, se den tilsvarende delen av Materialer og metoder. For alle andre eksperimenter finnes detaljert informasjon i den tilhørende forklaringen. Med mindre annet er spesifisert, er alle data uttrykt som gjennomsnitt ± SEM, og alle statistiske analyser ble utført ved hjelp av GraphPad Prism 8.1.2-programvaren.
For tilleggsmateriale til denne artikkelen, se http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/35/eaba8271/DC1
Dette er en artikkel med åpen tilgang distribuert under vilkårene i Creative Commons Attribution-Non-Commercial License, som tillater bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, så lenge den endelige bruken ikke er for kommersiell vinning og forutsetningen er at det originale verket er korrekt. Referanse.
Merk: Vi ber deg bare om å oppgi e-postadressen din, slik at personen du anbefaler til siden vet at du vil at de skal se e-posten, og at den ikke er spam. Vi vil ikke registrere noen e-postadresser.
Dette spørsmålet brukes til å teste om du er en besøkende og forhindre automatisk spaminnsending.
Av E. Motori, I. Atanassov, SMV Kochan, K. Folz-Donahue, V. Sakthivelu, P. Giavalisco, N. Toni, J. Puyal, N.-G. Larson
Proteomikkanalyse av dysfunksjonelle nevroner viste at metabolske programmer aktiveres for å motvirke nevrodegenerasjon.
Av E. Motori, I. Atanassov, SMV Kochan, K. Folz-Donahue, V. Sakthivelu, P. Giavalisco, N. Toni, J. Puyal, N.-G. Larson
Proteomikkanalyse av dysfunksjonelle nevroner viste at metabolske programmer aktiveres for å motvirke nevrodegenerasjon.
©2020 American Association for the Advancement of Science. alle rettigheter forbeholdt. AAAS er partner av HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef og COUNTER. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.