Takk for at du besøker Nature.com. Nettleserversjonen du bruker har begrenset CSS-støtte. For best resultat anbefaler vi at du bruker en nyere versjon av nettleseren din (eller deaktiverer kompatibilitetsmodus i Internet Explorer). I mellomtiden, for å sikre kontinuerlig støtte, viser vi nettstedet uten styling eller JavaScript.
Propionsyre (PPA) brukes til å studere rollen til mitokondriell dysfunksjon i nevroutviklingsforstyrrelser som autismespekterforstyrrelse. PPA er kjent for å forstyrre mitokondriell biogenese, metabolisme og omsetning. Effektene av PPA på mitokondriell dynamikk, fisjon og fusjon er imidlertid fortsatt problematiske på grunn av den komplekse tidsmessige naturen til disse mekanismene. Her bruker vi komplementære kvantitative avbildningsteknikker for å undersøke hvordan PPA påvirker mitokondriell ultrastruktur, morfologi og dynamikk i nevronlignende SH-SY5Y-celler. PPA (5 mM) forårsaket en betydelig reduksjon i mitokondrieareal (p < 0,01), ilderdiameter og omkrets (p < 0,05) og areal 2 (p < 0,01). Mitokondriell hendelseslokatoranalyse viste en signifikant økning (p < 0,05) i fisjons- og fusjonshendelser, og opprettholdt dermed integriteten til det mitokondrielle nettverket under stressforhold. I tillegg ble mRNA-ekspresjonen av cMYC (p < 0,0001), NRF1 (p < 0,01), TFAM (p < 0,05), STOML2 (p < 0,0001) og OPA1 (p < 0,05) betydelig redusert. 01). Dette illustrerer ombyggingen av mitokondriell morfologi, biogenese og dynamikk for å opprettholde funksjon under stressforhold. Våre data gir ny innsikt i effektene av PPA på mitokondriedynamikk og fremhever nytten av avbildningsteknikker for å studere de komplekse reguleringsmekanismene som er involvert i mitokondrielle stressresponser.
Mitokondrier er integrerte deltakere i en rekke cellulære funksjoner utover deres typiske roller i energiproduksjon og biosyntese. Mitokondriell metabolisme er en nøkkelregulator av kalsiumsignalering, metabolsk og redoks homeostase, inflammatorisk signalering, epigenetiske modifikasjoner, celleproliferasjon, differensiering og programmert celledød1. Spesielt mitokondriell metabolisme er kritisk for nevronutvikling, overlevelse og funksjon, og er bredt involvert i ulike manifestasjoner av nevropatologi2,3,4.
I løpet av det siste tiåret har metabolsk status dukket opp som en sentral regulator for nevrogenese, differensiering, modning og plastisitet5,6. Nylig har mitokondriell morfologi og dynamikk blitt spesielt viktige komponenter i mitose, en dynamisk prosess som opprettholder et basseng av sunne mitokondrier i celler. Mitokondriell dynamikk reguleres av komplekse, gjensidig avhengige veier som spenner fra mitokondriell biogenese og bioenergetikk til mitokondriell fisjon, fusjon, transport og clearance7,8. Forstyrrelse av noen av disse integrerende mekanismene svekker opprettholdelsen av sunne mitokondrielle nettverk og har betydelige funksjonelle konsekvenser for nevroutvikling9,10. Faktisk observeres dysregulering av mitokondriell dynamikk ved mange psykiatriske, nevrodegenerative og nevroutviklingsforstyrrelser, inkludert autismespekterforstyrrelser (ASD)11,12.
ASD er en heterogen nevroutviklingsforstyrrelse med en kompleks genetisk og epigenetisk arkitektur. Arveligheten til ASD er ubestridt, men den underliggende molekylære etiologien er fortsatt dårlig forstått. Akkumulering av data fra prekliniske modeller, kliniske studier og multi-omiske molekylære datasett gir økende bevis på mitokondriell dysfunksjon ved ASD13,14. Vi utførte tidligere en genomomfattende DNA-metyleringsscreening i en kohort av pasienter med ASD og identifiserte differensielt metylerte gener gruppert langs mitokondrielle metabolske veier15. Vi rapporterte senere differensiell metylering av sentrale regulatorer av mitokondriell biogenese og dynamikk, som var assosiert med økt mtDNA-kopitall og endret urinmetabolsk profil ved ASD16. Våre data gir økende bevis for at mitokondriell dynamikk og homeostase spiller en sentral rolle i patofysiologien til ASD. Derfor er det et sentralt mål for pågående forskning på nevrologiske sykdommer karakterisert ved sekundær mitokondriell dysfunksjon å forbedre den mekanistiske forståelsen av forholdet mellom mitokondriell dynamikk, morfologi og funksjon.
Molekylære teknikker brukes ofte til å studere rollen til spesifikke gener i mitokondrielle stressresponser. Denne tilnærmingen kan imidlertid være begrenset av den mangefasetterte og tidsmessige naturen til mitotiske kontrollmekanismer. Dessuten er differensiell ekspresjon av mitokondrielle gener en indirekte indikator på funksjonelle endringer, spesielt siden bare et begrenset antall gener vanligvis analyseres. Derfor har mer direkte metoder for å studere mitokondriefunksjon og bioenergetikk blitt foreslått17. Mitokondriemorfologi er nært knyttet til mitokondriedynamikk. Mitokondrieform, tilkobling og struktur er kritiske for energiproduksjon og mitokondrie- og celleoverlevelse5,18. Dessuten fokuserer de ulike komponentene i mitose på endringer i mitokondriemorfologi, som kan tjene som nyttige endepunkter for mitokondriell dysfunksjon og gi et grunnlag for påfølgende mekanistiske studier.
Mitokondriell morfologi kan observeres direkte ved hjelp av transmisjonselektronmikroskopi (TEM), noe som muliggjør detaljerte studier av cellulær ultrastruktur. TEM visualiserer direkte morfologien, formen og strukturen til mitokondrielle cristae ved oppløsningen av individuelle mitokondrier, i stedet for å utelukkende stole på gentranskripsjon, proteinuttrykk eller mitokondrielle funksjonelle parametere i cellepopulasjoner17,19,20. I tillegg letter TEM studiet av interaksjoner mellom mitokondrier og andre organeller, som endoplasmatisk retikulum og autofagosomer, som spiller nøkkelroller i mitokondriefunksjon og homeostase21,22. Dette gjør TEM til et godt utgangspunkt for å studere mitokondriell dysfunksjon før man fokuserer på spesifikke signalveier eller gener. Etter hvert som mitokondriefunksjon blir stadig mer relevant for nevropatologi, er det et klart behov for å kunne studere mitokondriemorfologi og dynamikk direkte og kvantitativt i in vitro-nevronale modeller.
I denne artikkelen undersøker vi mitokondriedynamikk i en nevronal modell av mitokondriell dysfunksjon ved autismespektrumforstyrrelse. Vi har tidligere rapportert differensiell metylering av propionyl-CoA-karboksylase beta (PCCB) i ASD15, en underenhet av det mitokondrielle propionyl-CoA-karboksylase-enzymet PCC. Dysregulering av PCC er kjent for å forårsake toksisk akkumulering av propionylderivater, inkludert propionsyre (PPA)23,24,25. PPA har vist seg å forstyrre nevronal metabolisme og endre atferd in vivo, og er en etablert dyremodell for å studere nevroutviklingsmekanismer involvert i ASD26,27,28. I tillegg har PPA blitt rapportert å forstyrre mitokondriemembranpotensial, biogenese og respirasjon in vitro, og har blitt mye brukt til å modellere mitokondriell dysfunksjon i nevroner29,30. Imidlertid er virkningen av PPA-indusert mitokondriell dysfunksjon på mitokondriemorfologi og dynamikk fortsatt dårlig forstått.
Denne studien bruker komplementære avbildningsteknikker for å kvantifisere effektene av PPA på mitokondriell morfologi, dynamikk og funksjon i SH-SY5Y-celler. Først utviklet vi en TEM-metode for å visualisere endringer i mitokondriell morfologi og ultrastruktur17,31,32. Gitt mitokondrienes dynamiske natur33, brukte vi også mitokondriell hendelseslokaliseringsanalyse (MEL) for å kvantifisere endringer i balansen mellom fisjons- og fusjonshendelser, mitokondrietall og volum under PPA-stress. Til slutt undersøkte vi om mitokondriell morfologi og dynamikk er assosiert med endringer i uttrykket av gener involvert i biogenese, fisjon og fusjon. Samlet sett illustrerer dataene våre utfordringen med å belyse kompleksiteten til mekanismene som regulerer mitokondriell dynamikk. Vi fremhever nytten av TEM i å studere mitokondriell morfologi som et målbart konvergent endepunkt for mitose i SH-SY5Y-celler. I tillegg fremhever vi at TEM-data gir den rikeste informasjonen når den kombineres med avbildningsteknikker som også fanger opp dynamiske hendelser som respons på metabolsk stress. Ytterligere karakterisering av de molekylære reguleringsmekanismene som støtter nevroncellemitose kan gi viktig innsikt i den mitokondrielle komponenten i nervesystemet og nevrodegenerative sykdommer.
For å indusere mitokondriell stress ble SH-SY5Y-celler behandlet med PPA ved bruk av 3 mM og 5 mM natriumpropionat (NaP). Før TEM ble prøvene utsatt for kryogen prøvepreparering ved bruk av høytrykksfrysing og frysing (fig. 1a). Vi utviklet en automatisert mitokondriell bildeanalysepipeline for å måle åtte morfologiske parametere av mitokondriepopulasjoner på tvers av tre biologiske replikater. Vi fant at PPA-behandling signifikant endret fire parametere: areal 2, areal, omkrets og Feret-diameter (fig. 1b–e). Areal 2 minket signifikant med både 3 mM og 5 mM PPA-behandling (p = 0,0183 og p = 0,002, henholdsvis) (fig. 1b), mens areal (p = 0,003), omkrets (p = 0,0106) og Feret-diameter alle har minket signifikant. Det var en signifikant reduksjon (p = 0,0172) i 5 mM-behandlingsgruppen sammenlignet med kontrollgruppen (fig. 1c–e). Signifikante reduksjoner i areal og omkrets viste at celler behandlet med 5 mM PPA hadde mindre, mer avrundede mitokondrier, og at disse mitokondriene var mindre forlengede enn de i kontrollcellene. Dette er også i samsvar med en signifikant reduksjon i Feret-diameteren, en uavhengig parameter som indikerer en reduksjon i den største avstanden mellom partikkelkantene. Endringer i ultrastrukturen til cristae ble observert: cristae ble mindre uttalt under påvirkning av PPA-stress (fig. 1a, panel B). Imidlertid reflekterte ikke alle bildene tydelig ultrastrukturen til cristae, så en kvantitativ analyse av disse endringene ble ikke utført. Disse TEM-dataene kan gjenspeile tre mulige scenarier: (1) PPA forsterker fisjon eller hemmer fusjon, noe som får eksisterende mitokondrier til å krympe i størrelse; (2) forbedret biogenese skaper nye, mindre mitokondrier eller (3) induserer begge mekanismene samtidig. Selv om disse forholdene ikke kan skilles fra hverandre ved TEM, indikerer signifikante morfologiske endringer endringer i mitokondriell homeostase og dynamikk under PPA-stress. Vi utforsket deretter ytterligere parametere for å ytterligere karakterisere denne dynamikken og de potensielle mekanismene som ligger til grunn for den.
Propionsyre (PPA) omformer mitokondrienes morfologi. (a) Representative transmisjonselektronmikroskopibilder (TEM) som viser at mitokondriestørrelsen avtar og mitokondriene blir mindre og mer avrundede med økende PPA-behandling; henholdsvis 0 mM (ubehandlet), 3 mM og 5 mM. Røde piler indikerer mitokondrier. (b–e) SH-SY5Y-celler behandlet med PPA i 24 timer ble fremstilt for TEM, og resultatene ble analysert ved hjelp av Fiji/ImageJ. Fire av de åtte parameterne viste signifikante forskjeller mellom kontrollceller (ubehandlet, 0 mM PPA) og behandlede celler (3 mM og 5 mM PPA). (b) Region 2, (c) Areal, (d) Omkrets, (e) Ilderdiameter. Enveis variansanalyse (kontroll vs. behandling) og Dunnetts multiple sammenligningstest ble brukt til å bestemme signifikante forskjeller (p < 0,05). Datapunkter representerer den gjennomsnittlige mitokondrieverdien for hver enkelt celle, og feilfelt representerer gjennomsnittet ± SEM. Viste data representerer n = 3, minst 24 celler per replikat; totalt 266 bilder ble analysert; * indikerer p < 0,05, ** indikerer p < 0,01.
For å ytterligere karakterisere hvordan mitokondriedynamikk reagerer på PPA, farget vi mitokondrier med tetrametylrhodaminetylester (TMRE) og brukte time-lapse-mikroskopi og MEL-analyse for å lokalisere og kvantifisere mitokondrier etter 24 timer ved 3 og 5 mM PPA. Behandling av fisjons- og fusjonshendelser. (Fig. 2a). Etter MEL-analyse ble mitokondriene videre analysert for å kvantifisere antall mitokondrielle strukturer og deres gjennomsnittlige volum. Vi observerte en liten, men signifikant økning i antall fisjonshendelser som forekom ved 3 mM [4,9 ± 0,3 (p < 0,05)] sammenlignet med fisjons- [5,6 ± 0,3 (p < 0,05))] og fusjons- [5,4 ± 0,5 (p < 0,05)] og fusjons- [5,4 ± 0,5 (p < 0,05)] 0,05)] <0,05)] var signifikant økt ved 5 mM sammenlignet med kontroll (Fig. 3b). Antallet mitokondrier økte signifikant ved både 3 [32,6 ± 2,1 (p < 0,05)] og 5 mM [34,1 ± 2,2 (p < 0,05)] (fig. 3c), mens gjennomsnittsvolumet av hver mitokondrielle struktur forble uendret (fig. 3c). 3d). Samlet sett tyder dette på at ombygging av mitokondriedynamikk fungerer som en kompenserende respons som opprettholder integriteten til det mitokondrielle nettverket. Økningen i antall fisjonshendelser ved 3 mM PPA antyder at økningen i mitokondrieantall delvis skyldes mitokondriell fisjon, men gitt at det gjennomsnittlige mitokondrievolumet forblir i hovedsak uendret, kan ikke biogenese utelukkes som en ytterligere kompenserende respons. Imidlertid er disse dataene i samsvar med de mindre, runde mitokondriestrukturene observert av TEM, og viser også signifikante endringer i mitokondriedynamikk indusert av PPA.
Propionsyre (PPA) induserer dynamisk mitokondriell ombygging for å opprettholde nettverkets integritet. SH-SY5Y-celler ble dyrket, behandlet med 3 og 5 mM PPA i 24 timer og farget med TMRE og Hoechst 33342 etterfulgt av MEL-analyse. (a) Representative time-lapse-mikroskopibilder som viser farge og binære maksimalintensitetsprojeksjoner ved tid 2 (t2) for hver tilstand. Utvalgte regioner angitt i hvert binære bilde er forbedret og vist i 3D ved tre forskjellige tidsrammer (t1-t3) for å illustrere dynamikken over tid; fusjonshendelser er uthevet i grønt; fisjonshendelser er uthevet i grønt. Vist i rødt. (b) Gjennomsnittlig antall dynamiske hendelser per tilstand. (c) Gjennomsnittlig antall mitokondrielle strukturer per celle. (d) Gjennomsnittlig volum (µm3) av hver mitokondriell struktur per celle. Dataene som vises er representative for n = 15 celler per behandlingsgruppe. Feilfeltene som vises representerer gjennomsnitt ± SEM, skala = 10 μm, * p < 0,05.
Propionsyre (PPA) forårsaker transkripsjonssuppresjon av gener assosiert med mitokondriedynamikk. SH-SY5Y-celler ble behandlet med 3 og 5 mM PPA i 24 timer. Relativ genkvantifisering ble utført ved bruk av RT-qPCR og normalisert til B2M. Mitokondrielle biogenesegener (a) cMYC, (b) TFAM, (c) NRF1 og (d) NFE2L2. Mitokondrielle fusjons- og fisjonsgener (e) STOML2, (f) OPA1, (g) MFN1, (h) MFN2 og (i) DRP1. Signifikante forskjeller (p < 0,05) ble testet ved bruk av enveis ANOVA (kontroll vs. behandling) og Dunnetts multiple sammenligningstest: * indikerer p < 0,05, ** indikerer p < 0,01, og **** indikerer p < 0,0001. Søyler representerer gjennomsnittlig uttrykk ± SEM. Dataene som vises representerer biologiske replikater av n = 3 (STOML2, OPA1, TFAM), n = 4 (cMYC, NRF1, NFE2L2) og n = 5 (MFN1, MFN2, DRP1).
Data fra TEM- og MEL-analyser indikerer samlet sett at PPA endrer mitokondriell morfologi og dynamikk. Disse avbildningsteknikkene gir imidlertid ikke innsikt i de underliggende mekanismene som driver disse prosessene. Vi undersøkte derfor mRNA-ekspresjonen til ni nøkkelregulatorer av mitokondriell dynamikk, biogenese og mitose som respons på PPA-behandling. Vi kvantifiserte cellemyelomonkogen (cMYC), nukleær respiratorisk faktor (NRF1), mitokondriell transkripsjonsfaktor 1 (TFAM), NFE2-lignende transkripsjonsfaktor BZIP (NFE2L2), gastrinlignende protein 2 (STOML2), synsnerveatrofi 1 (OPA1), Mitofusin 1 (MFN1), Mitofusin 2 (MFN2) og dynaminrelatert protein 1 (DRP1) etter 24 timers behandling med 3 mM og 5 mM PPA. Vi observerte 3 mM (p = 0,0053, p = 0,0415 og p < 0,0001, henholdsvis) og 5 mM (p = 0,0031, p = 0,0233, p < 0,0001) PPA-behandling. (Fig. 3a–c). Nedgangen i mRNA-ekspresjon var doseavhengig: ekspresjonen av cMYC, NRF1 og TFAM minket med henholdsvis 5,7, 2,6 og 1,9 ganger ved 3 mM, og med 11,2, 3 og 2,2 ganger ved 5 mM. I motsetning til dette ble ikke det sentrale redoksbiogenesegenet NFE2L2 endret ved noen konsentrasjon av PPA, selv om en lignende doseavhengig trend med redusert ekspresjon ble observert (Fig. 3d).
Vi undersøkte også uttrykket av klassiske gener involvert i reguleringen av fisjon og fusjon. STOML2 antas å være involvert i fusjon, mitofagi og biogenese, og uttrykket ble betydelig redusert (p < 0,0001) med 3 mM (2,4-ganger endring) og 5 mM (2,8-ganger endring) PPA (fig. 1). 3d). Tilsvarende ble OPA1-fusjonsgenuttrykk redusert ved 3 mM (1,6-ganger endring) og 5 mM (1,9-ganger endring) PPA (p = 0,006 og p = 0,0024, henholdsvis) (fig. 3f). Vi fant imidlertid ingen signifikante forskjeller i uttrykket av fusjonsgenene MFN1, MFN2 eller fisjonsgenet DRP1 under 24-timers PPA-stress (fig. 3g–i). I tillegg fant vi at nivåene av fire fusjons- og fisjonsproteiner (OPA1, MFN1, MFN2 og DRP1) ikke endret seg under de samme forholdene (fig. 4a–d). Det er viktig å merke seg at disse dataene gjenspeiler et enkelt tidspunkt og kanskje ikke gjenspeiler endringer i proteinuttrykk eller aktivitetsnivåer i de tidlige stadiene av PPA-stress. Imidlertid indikerer signifikante reduksjoner i uttrykket av cMYC, NRF1, TFAM, STOML2 og OPA1 betydelig transkripsjonell dysregulering av mitokondriell metabolisme, biogenese og dynamikk. I tillegg fremhever disse dataene nytten av avbildningsteknikker for å direkte studere endringer i slutttilstanden i mitokondriefunksjonen.
Fusjons- og fisjonsfaktorproteinnivåene endret seg ikke etter behandling med propionsyre (PPA). SH-SY5Y-celler ble behandlet med 3 og 5 mM PPA i 24 timer. Proteinnivåene ble kvantifisert ved Western blot-analyse, og ekspresjonsnivåene ble normalisert til totalt protein. Gjennomsnittlig proteinuttrykk og representative Western blots av mål- og totalt protein er vist. a – OPA1, b – MFN1, c – MFN2, d – DRP1. Stolpene representerer gjennomsnitt ± SEM, og dataene som vises er representative for n = 3 biologiske replikater. Multiple sammenligninger (p < 0,05) ble utført ved hjelp av enveis variansanalyse og Dunnetts test. Den originale gelen og blottet er vist i figur S1.
Mitokondriell dysfunksjon er assosiert med multisystemsykdommer som spenner fra metabolske, kardiovaskulære og muskulære sykdommer til nevrologiske sykdommer1,10. Mange nevrodegenerative og nevrodegenerative sykdommer er assosiert med mitokondriell dysfunksjon, noe som fremhever viktigheten av disse organellene gjennom hele hjernens levetid. Disse sykdommene inkluderer Parkinsons sykdom, Alzheimers sykdom og ASD3,4,18. Imidlertid er tilgang til hjernevev for å studere disse sykdommene vanskelig, spesielt på det mekanistiske nivået, noe som gjør cellulære modellsystemer til et nødvendig alternativ. I denne studien bruker vi et cellulært modellsystem som bruker PPA-behandlede SH-SY5Y-celler for å rekapitulere den mitokondrielle dysfunksjonen observert i nevronale sykdommer, spesielt autismespekterforstyrrelser. Bruk av denne PPA-modellen for å studere mitokondriell dynamikk i nevroner kan gi innsikt i etiologien til ASD.
Vi utforsket muligheten for å bruke TEM for å se endringer i mitokondriell morfologi. Det er viktig å merke seg at TEM må brukes riktig for å maksimere effektiviteten. Forberedelse av kryoprøver muliggjør bedre bevaring av nevrale strukturer ved samtidig å fiksere cellulære komponenter og redusere dannelsen av artefakter34. I samsvar med dette observerte vi at nevronlignende SH-SY5Y-celler hadde intakte subcellulære organeller og forlengede mitokondrier (fig. 1a). Dette fremhever nytten av kryogene forberedelsesteknikker for å studere mitokondriell morfologi i nevroncellemodeller. Selv om kvantitative målinger er kritiske for objektiv analyse av TEM-data, er det fortsatt ingen enighet om hvilke spesifikke parametere som bør måles for å bekrefte mitokondrielle morfologiske endringer. Basert på et stort antall studier som kvantitativt har undersøkt mitokondriell morfologi17,31,32, utviklet vi en automatisert mitokondriell bildeanalysepipeline som måler åtte morfologiske parametere, nemlig: areal, areal2, sideforhold, omkrets, sirkularitet, grad, feretdiameter og rundhet.
Blant dem reduserte PPA betydelig areal 2, areal, omkrets og Feret-diameter (fig. 1b–e). Dette viste at mitokondriene ble mindre og mer avrundede, noe som stemmer overens med tidligere studier som viste en reduksjon i mitokondrieareal etter 72 timer med PPA30-indusert mitokondriestress. Disse morfologiske trekkene kan indikere mitokondriell fisjon, en nødvendig prosess for å sekvestrere skadede komponenter fra mitokondrienettverket for å fremme deres nedbrytning gjennom mitofagi35,36,37. På den annen side kan reduksjonen i gjennomsnittlig mitokondriestørrelse være assosiert med økt biogenese, noe som resulterer i dannelsen av små gryende mitokondrier. Økt fisjon eller biogenese representerer en kompenserende respons for å opprettholde mitose mot mitokondriestress. Imidlertid kan redusert mitokondrievekst, svekket fusjon eller andre forhold ikke utelukkes.
Selv om høyoppløselige bilder laget av TEM tillater bestemmelse av morfologiske egenskaper på nivået av individuelle mitokondrier, produserer denne metoden todimensjonale øyeblikksbilder på et enkelt tidspunkt. For å studere dynamiske responser på metabolsk stress, farget vi mitokondrier med TMRE og brukte time-lapse-mikroskopi med MEL-analyse, som tillater 3D-visualisering med høy gjennomstrømning av endringer i det mitokondrielle nettverket over tid33,38. Vi observerte subtile, men signifikante endringer i mitokondriedynamikk under PPA-stress (fig. 2). Ved 3 mM økte antallet fisjonshendelser betydelig, mens fusjonshendelser forble det samme som i kontrollen. En økning i antallet både fisjons- og fusjonshendelser ble observert ved 5 mM PPA, men disse endringene var omtrent proporsjonale, noe som tyder på at fisjons- og fusjonskinetikken når likevekt ved høyere konsentrasjoner (fig. 2b). Det gjennomsnittlige mitokondrievolumet forble uendret ved både 3 og 5 mM PPA, noe som indikerer at integriteten til det mitokondrielle nettverket ble bevart (fig. 2d). Dette gjenspeiler evnen til dynamiske mitokondrielle nettverk til å reagere på mild metabolsk stress for å effektivt opprettholde homeostase uten å forårsake nettverksfragmentering. Ved 3 mM PPA er økningen i fisjon tilstrekkelig til å fremme overgangen til en ny likevekt, men mer dyptgående kinetisk ombygging er nødvendig som respons på stress indusert av høyere konsentrasjoner av PPA.
Antallet mitokondrier økte ved begge PPA-stresskonsentrasjonene, men det gjennomsnittlige mitokondrievolumet endret seg ikke signifikant (fig. 2c). Dette kan skyldes økt biogenese eller økt deling. I fravær av en signifikant reduksjon i gjennomsnittlig mitokondrievolum er det imidlertid mer sannsynlig at biosyntesen øker. Dataene i figur 2 støtter imidlertid eksistensen av to kompenserende mekanismer: en økning i antall fisjonshendelser, i samsvar med oppregulering av mitokondriell fisjon, og en økning i antall hendelser, i samsvar med mitokondriell biogenese. Til syvende og sist kan dynamisk kompensasjon for mild stress bestå av samtidige prosesser som involverer fisjon, fusjon, biogenese og mitofagi. Selv om tidligere forfattere har vist at PPA forsterker mitose30,39 og mitofagi29, gir vi bevis for ombygging av mitokondriell fisjons- og fusjonsdynamikk som respons på PPA. Disse dataene bekrefter de morfologiske endringene observert av TEM og gir ytterligere innsikt i mekanismene assosiert med PPA-indusert mitokondriell dysfunksjon.
Fordi verken TEM- eller MEL-analyse ga direkte bevis på genreguleringsmekanismene som ligger til grunn for de observerte morfologiske endringene, undersøkte vi RNA-ekspresjonen til gener involvert i mitokondriell metabolisme, biogenese og dynamikk. cMYC-proto-onkogenet er en transkripsjonsfaktor involvert i reguleringen av mitokondrier, glykolyse, aminosyre- og fettsyremetabolisme40. I tillegg er cMYC kjent for å regulere ekspresjonen av nesten 600 mitokondrielle gener involvert i mitokondriell transkripsjon, translasjon og kompleks montering, inkludert NRF1 og TFAM41. NRF1 og TFAM er to sentrale regulatorer av mitose, som virker nedstrøms for PGC-1α for å aktivere mtDNA-replikasjon. Denne signalveien aktiveres av cAMP- og AMPK-signalering og er følsom for energiforbruk og metabolsk stress. Vi undersøkte også NFE2L2, en redoksregulator av mitokondriell biogenese, for å avgjøre om effektene av PPA kan være mediert av oksidativt stress.
Selv om NFE2L2-ekspresjon forble uendret, fant vi en konsistent doseavhengig reduksjon i ekspresjonen av cMYC, NRF1 og TFAM etter 24 timers behandling med 3 mM og 5 mM PPA (fig. 3a–c). Nedregulering av cMYC-ekspresjon har tidligere blitt rapportert som en respons på mitokondrienestress42, og omvendt kan nedregulering av cMYC-ekspresjon forårsake mitokondrienesdysfunksjon ved å ombygge mitokondriemetabolisme, nettverkstilkobling og membranpolarisering43. Interessant nok er cMYC også involvert i reguleringen av mitokondriefisjon og fusjon42,43 og er kjent for å øke DRP1-fosforylering og mitokondrielokalisering under celledeling44, samt mediere mitokondrienes morfologiske ombygging i nevrale stamceller45. Faktisk viser cMYC-defekte fibroblaster redusert mitokondriestørrelse, i samsvar med endringer indusert av PPA43-stress. Disse dataene illustrerer et interessant, men foreløpig uklart forhold mellom cMYC og mitokondriedynamikk, og gir et interessant mål for fremtidige studier av PPA-stressindusert ombygging.
Reduksjonen av NRF1 og TFAM er i samsvar med cMYCs rolle som en viktig transkripsjonsaktivator. Disse dataene er også i samsvar med tidligere studier i humane tykktarmskreftceller som viser at PPA reduserte NRF1 mRNA-ekspresjon etter 22 timer, noe som var assosiert med ATP-uttømming og økt ROS46. Disse forfatterne rapporterte også at TFAM-ekspresjon økte etter 8,5 timer, men returnerte til baseline-nivåer etter 22 timer. I motsetning til dette viste Kim et al. (2019) at TFAM mRNA-ekspresjon var betydelig redusert etter 4 timer med PPA-stress i SH-SY5Y-celler. Etter 72 timer var imidlertid TFAM-proteinekspresjon betydelig økt, og mtDNA-kopitallet var betydelig økt. Dermed utelukker ikke reduksjonen i antall mitokondrielle biogenesegener som vi observerte etter 24 timer, muligheten for at økningen i antall mitokondrier er assosiert med aktivering av biogenese på tidligere tidspunkter. Tidligere studier har vist at PPA signifikant oppregulerer PGC-1α mRNA og protein i SH-SY5Y-celler etter 4 timer og 30 minutter, mens propionsyre forbedrer mitokondriell biogenese i kalvehepatocytter via PGC-1α etter 12 timer og 39 minutter. Interessant nok er PGC-1α ikke bare en direkte transkripsjonsregulator av NRF1 og TFAM, men har også vist seg å regulere aktiviteten til MFN2 og DRP1 ved å regulere fisjon og fusjon47. Samlet sett fremhever dette den nære koblingen mellom mekanismer som regulerer mitokondrielle kompensasjonsresponser indusert av PPA. Dessuten gjenspeiler dataene våre betydelig dysregulering av transkripsjonsregulering av biogenese og metabolisme under PPA-stress.
STOML2-, OPA1-, MFN1-, MFN2- og DRP1-genene er blant de sentrale regulatorene av mitokondriell fisjon, fusjon og dynamikk37,48,49. Det er mange andre gener involvert i mitokondriell dynamikk, men STOML2, OPA1 og MFN2 har tidligere blitt funnet å være differensielt metylerte i ASD-kohorter,16 og flere uavhengige studier har rapportert endringer i disse transkripsjonsfaktorene som respons på mitokondriell stress50,51.52. Ekspresjonen av både OPA1 og STOML2 ble betydelig redusert ved 3 mM og 5 mM PPA-behandling (fig. 3e, f). OPA1 er en av de klassiske regulatorene av mitokondriell fusjon gjennom direkte interaksjon med MFN1 og 2 og spiller en rolle i cristae-ombygging og mitokondriell morfologi53. Den nøyaktige rollen til STOML2 i mitokondriell dynamikk er fortsatt uklar, men bevis tyder på at det spiller en rolle i mitokondriell fusjon, biogenese og mitofagi.
STOML2 er involvert i å opprettholde mitokondriell respirasjonskobling og dannelse av respirasjonskjedekomplekser54,55 og har vist seg å endre de metabolske egenskapene til kreftceller i stor grad56. Studier har vist at STOML2 fremmer mitokondrielt membranpotensial og biogenese gjennom interaksjon med BAN og kardiolipin55, 57, 58. I tillegg har uavhengige studier vist at interaksjonen mellom STOML2 og PINK1 regulerer mitofagi59,60. Det er verdt å merke seg at STOML2 har blitt rapportert å interagere direkte med og stabilisere MFN2, og spiller også en viktig rolle i å stabilisere lange OPA1-isoformer ved å hemme proteasen som er ansvarlig for OPA1-nedbrytning53,61,62. Reduksjonen i STOML2-ekspresjon observert i PPA-reaksjoner kan gjøre disse fusjonsproteinene mer utsatt for nedbrytning gjennom ubiquitin- og proteasomavhengige veier48. Selv om den nøyaktige rollen til STOML2 og OPA1 i den dynamiske responsen på PPA er uklar, kan redusert uttrykk av disse fusjonsgenene (figur 3) forstyrre balansen mellom fisjon og fusjon og føre til redusert mitokondriestørrelse (figur 3).1).
På den annen side forble OPA1-proteinuttrykket uendret etter 24 timer, mens mRNA- og proteinnivåene til MFN1, MFN2 eller DRP1 ikke endret seg signifikant etter PPA-behandling (fig. 3g-i, fig. 4). Dette kan indikere at det ikke er noen endringer i reguleringen av disse faktorene involvert i mitokondriell fusjon og fisjon. Det er imidlertid verdt å merke seg at hvert av disse fire genene også er regulert av posttranskripsjonelle modifikasjoner (PTM-er) som kontrollerer proteinaktivitet. OPA1 har åtte alternative spleisningsvarianter som proteolytisk spaltes i mitokondrier for å produsere to distinkte isoformer 63. Balansen mellom lange og korte isoformer bestemmer til slutt rollen til OPA1 i mitokondriell fusjon og vedlikehold av mitokondrienettverket 64. DRP1-aktivitet reguleres av kalsium/kalmodulinavhengig proteinkinase II (CaMKII) fosforylering, mens DRP1-nedbrytning reguleres av ubiquitinering og SUMOylering 65. Til slutt er både DRP1 og MFN1/2 GTPaser, så aktiviteten kan påvirkes av hastigheten på GTP-produksjon i mitokondrier 66. Selv om uttrykket av disse proteinene forblir konstant, kan dette derfor ikke gjenspeile uendret proteinaktivitet eller lokalisering 67,68. Faktisk fungerer eksisterende PTM-proteinrepertoarer ofte som den første forsvarslinjen som er ansvarlig for å mediere akutte stressresponser. I nærvær av moderat metabolsk stress i vår modell er det sannsynlig at PTM fremmer økt aktivitet av fusjons- og fisjonsproteiner for å gjenopprette mitokondrieintegriteten tilstrekkelig uten å kreve ytterligere aktivering av disse genene på mRNA- eller proteinnivå.
Samlet sett fremhever dataene ovenfor den komplekse og tidsavhengige reguleringen av mitokondriemorfologi og utfordringene med å belyse disse mekanismene. For å studere genuttrykk er det først nødvendig å identifisere spesifikke målgener i signalveien. Våre data viser imidlertid at gener i samme signalvei ikke reagerer på samme måte på samme stress. Faktisk har tidligere studier vist at forskjellige gener i samme signalvei kan vise forskjellige tidsmessige responsprofiler30,46. I tillegg finnes det komplekse posttranskripsjonelle mekanismer som forstyrrer forholdet mellom transkripsjon og genfunksjon. Proteomiske studier kan gi innsikt i virkningen av PTM-er og proteinfunksjon, men de byr også på utfordringer, inkludert metoder med lav gjennomstrømning, høye signal-til-støy-forhold og dårlig oppløsning.
I denne sammenhengen har studier av mitokondriemorfologi ved hjelp av TEM og MEL et stort potensial til å adressere grunnleggende spørsmål om forholdet mellom mitokondriedynamikk og -funksjon, og hvordan dette påvirker sykdom. Viktigst av alt, TEM gir en direkte metode for å måle mitokondriemorfologi som et konvergent endepunkt for mitokondriedysfunksjon og dynamikk51. MEL gir også en direkte metode for å visualisere fisjons- og fusjonshendelser i et tredimensjonalt cellulært miljø, noe som tillater kvantifisering av dynamisk mitokondrieombygging selv i fravær av endringer i genuttrykk33. Her fremhever vi nytten av mitokondrieavbildningsteknikker ved sekundære mitokondriesykdommer. Disse sykdommene er vanligvis preget av kronisk mildt metabolsk stress karakterisert ved subtil ombygging av mitokondrienettverk snarere enn akutt mitokondrieskade. Imidlertid har den mitokondriekompensasjonen som kreves for å opprettholde mitose under kronisk stress, betydelige funksjonelle konsekvenser. I nevrovitenskapens sammenheng kan en bedre forståelse av disse kompensasjonsmekanismene gi viktig informasjon om den pleiotropiske nevropatologien assosiert med mitokondriedysfunksjon.
Til syvende og sist fremhever dataene våre nytten av avbildningsteknikker for å forstå de funksjonelle konsekvensene av de komplekse interaksjonene mellom genuttrykk, proteinmodifikasjoner og proteinaktivitet som kontrollerer neuronal mitokondriedynamikk. Vi brukte PPA til å modellere mitokondriell dysfunksjon i en neuronal cellemodell for å få innsikt i den mitokondrielle komponenten av ASD. SH-SY5Y-celler behandlet med PPA viste endringer i mitokondriemorfologi: mitokondrier ble små og runde, og cristae var dårlig definert når de ble observert med TEM. MEL-analyse viser at disse endringene skjer samtidig med en økning i fisjons- og fusjonshendelser for å opprettholde det mitokondrielle nettverket som respons på mild metabolsk stress. Dessuten forstyrrer PPA betydelig den transkripsjonelle reguleringen av mitokondriemetabolisme og homeostase. Vi identifiserte cMYC, NRF1, TFAM, STOML2 og OPA1 som viktige mitokondrieregulatorer forstyrret av PPA-stress og kan spille en rolle i å formidle PPA-induserte endringer i mitokondriemorfologi og -funksjon. Fremtidige studier er nødvendige for å bedre karakterisere PPA-induserte tidsmessige endringer i genuttrykk og proteinaktivitet, lokalisering og posttranslasjonelle modifikasjoner. Våre data fremhever kompleksiteten og gjensidig avhengigheten til regulatoriske mekanismer som medierer den mitokondrielle stressresponsen, og demonstrerer nytten av TEM og andre avbildningsteknikker for mer målrettede mekanistiske studier.
SH-SY5Y-cellelinjen (ECACC, 94030304-1VL) ble kjøpt fra Sigma-Aldrich. SH-SY5Y-celler ble dyrket i Dulbeccos modifiserte Eagle-medium/F-12-næringsblanding (DMEM/F-12) og L-glutamin (SC09411, ScienCell) i 25 cm²-kolber tilsatt 20 % føtalt bovint serum (FBS) (10493106, ThermoFisher Scientific) og 1 % penicillin-streptomycin (P4333-20ML, Sigma-Aldrich) ved 37 °C, 5 % CO². Cellene ble subdyrket til 80 % konfluens ved bruk av 0,05 % trypsin-EDTA (15400054, ThermoFisher Scientific), sentrifugert ved 300 g og platet ut med en tetthet på omtrent 7 × 105 celler/ml. Alle eksperimentene ble utført på udifferensierte SH-SY5Y-celler mellom passasjene 19–22. PPA administreres som NaP. Løs opp NaP-pulver (CAS-nr. 137-40-6, kjemisk formel C3H5NaO2, P5436-100G, Sigma-Aldrich) i varmt MilliQ-vann til en konsentrasjon på 1 M og oppbevar ved 4 °C. På behandlingsdagen, fortynn denne løsningen med 1 M PPA til 3 mM og 5 mM PPA i serumfritt medium (DMEM/F-12 med L-glutamin). Behandlingskonsentrasjonene for alle eksperimentene var ingen PPA (0 mM, kontroll), 3 mM og 5 mM PPA. Eksperimentene ble utført i minst tre biologiske replikat.
SH-SY5Y-celler ble sådd i 25 cm³-kolber med en hastighet på 5,5 × 10³ celler/ml og dyrket i 24 timer. PPA-behandlingen ble tilsatt kolben før 24 timers inkubasjon. Samle cellepellets i henhold til normale subkulturprotokoller for pattedyrvev (beskrevet ovenfor). Resuspender cellepelleten i 100 µl 2,5 % glutaraldehyd, 1 × PBS og oppbevar ved 4 °C inntil prosessering. SH-SY5Y-celler ble sentrifugert kort for å pelletere cellene og fjerne 2,5 % glutaraldehyd, 1 × PBS-løsning. Resuspender sedimentet i en 4 % agarosegel fremstilt i destillert vann (forholdet mellom agarose og sedimentvolum er 1:1). Agarosebitene ble plassert på rister på flate plater og belagt med 1-heksadecen før høytrykksfrysing. Prøvene ble frosset i 100 % tørr aceton ved -90 °C i 24 timer. Temperaturen ble deretter hevet til -80 °C, og en løsning av 1 % osmiumtetroksid og 0,1 % glutaraldehyd ble tilsatt. Prøvene ble lagret ved -80 °C i 24 timer. Deretter ble temperaturen gradvis økt til romtemperatur over flere dager: fra –80 °C til –50 °C i 24 timer, til –30 °C i 24 timer, til –10 °C i 24 timer og til slutt til romtemperatur.
Etter kryogen preparering ble prøvene impregnert med harpiks, og ultratynne snitt (∼100 nm) ble laget ved hjelp av en Leica Reichert UltracutS ultramikrotom (Leica Microsystems). Snittene ble farget med 2 % uranylacetat og blycitrat. Prøvene ble observert ved hjelp av et FEI Tecnai 20 transmisjonselektronmikroskop (ThermoFisher (tidligere FEI), Eindhoven, Nederland) som opererte ved 200 kV (Lab6-sender) og et Gatan CCD-kamera (Gatan, Storbritannia) utstyrt med et Tridiem-energifilter.
I hvert tekniske replikat ble det tatt minst 24 enkeltcellebilder, totalt 266 bilder. Alle bildene ble analysert ved hjelp av Region of Interest (ROI)-makroen og Mitochondria-makroen. Mitokondriellmakroen er basert på publiserte metoder17,31,32 og tillater semi-automatisert batchbehandling av TEM-bilder i Fiji/ImageJ69. Kort sagt: bildet inverteres og speilvendes ved hjelp av rullende ballbakgrunnssubtraksjon (60 pikslers radius) og et FFT-båndpassfilter (ved bruk av henholdsvis 60 og 8 pikslers øvre og nedre grenser) og vertikal linjeundertrykkelse med en orienteringstoleranse på 5 %. Det behandlede bildet terskelbehandles automatisk ved hjelp av en maksimal entropialgoritme, og en binær maske genereres. Bildeområder assosiert med manuelt valgte ROI-er i rå TEM-bilder ble ekstrahert, med karakterisering av mitokondrier og ekskludering av plasmamembranen og andre områder med høy kontrast. For hvert ekstraherte ROI ble binære partikler større enn 600 piksler analysert, og partikkelareal, omkrets, hoved- og sideakser, Feret-diameter, rundhet og sirkularitet ble målt ved hjelp av de innebygde målefunksjonene i Fiji/ImageJ. I henhold til Merrill, Flippo og Strack (2017) ble areal 2, partikkelaspektforhold (forhold mellom hoved- og sideakse) og formfaktor (FF) beregnet fra disse dataene, hvor FF = omkrets 2/4pi x areal. Definisjonen av den parametriske formelen finnes i Merrill, Flippo og Strack (2017). Makroene som er nevnt er tilgjengelige på GitHub (se Data Availability Statement). I gjennomsnitt ble omtrent 5600 partikler analysert per PPA-behandling, totalt omtrent 17 000 partikler (data ikke vist).
SH-SH5Y-celler ble plassert i 8-kammer kulturskåler (ThermoFisher, #155411) for å tillate adhesjon over natten og deretter inkubert med TMRE 1:1000 (ThermoFisher, #T669) og Hoechst 33342 1:200 (Sigma-Aldrich, H6024). Farging. Bilder ble tatt ved bruk av 405 nm og 561 nm lasere over et 10-minutters miljø, og råbilder ble tatt som z-stabler som inneholdt 10 bildemikrografer med az-trinn på 0,2 μm mellom bilderammer ved 12 påfølgende tidspunkter. Bildene ble samlet inn ved hjelp av en Carl Zeiss LSM780 ELYRA PS.1 superoppløsningsplattform (Carl Zeiss, Oberkochen, Tyskland) med en LCI Plan Apochromate 100x/1.4 Oil DIC M27-linse. Bildene ble analysert i ImageJ ved hjelp av en tidligere beskrevet pipeline og ImageJ-pluginen for å måle fusjons- og fisjonshendelser, gjennomsnittlig antall mitokondrielle strukturer og gjennomsnittlig mitokondrievolum per celle33. MEL-makroer er tilgjengelige på GitHub (se Data Availability Statement).
SH-SY5Y-celler ble dyrket i seksbrønnsplater med en tetthet på 0,3 × 106 celler/ml i 24 timer før behandling. RNA ble ekstrahert ved hjelp av Quick-RNA™ Miniprep-protokollen (ZR R1055, Zymo Research) med små modifikasjoner: tilsett 300 μl RNA-lysebuffer til hver brønn før fjerning, og lyser hver prøve som et siste trinn med 30 μl DNase/RNase-elueringsfritt vann. Alle prøver ble kontrollert for kvantitet og kvalitet ved hjelp av et NanoDrop ND-1000 UV-Vis-spektrofotometer. Totalt protein fra cellelysater ble oppnådd ved hjelp av 200 μl RIPA-lysebuffer, og proteinkonsentrasjonen ble kvantifisert ved hjelp av Bradford-proteinanalysen70.
cDNA-syntese ble utført ved bruk av Tetro™ cDNA Synthesis Kit (BIO-65043, Meridian Bioscience) i henhold til produsentens instruksjoner med noen modifikasjoner. cDNA ble syntetisert i 20 μl reaksjoner ved bruk av 0,7 til 1 μg totalt RNA. Primere ble valgt fra tidligere publiserte artikler 42, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78 (tabell S1), og tilhørende prober ble designet ved bruk av PrimerQuest-verktøyet fra Integrated DNA Technologies. Alle gener av interesse ble normalisert til det nukleære B2M-genet. Genuttrykket til STOML2, NRF1, NFE2L2, TFAM, cMYC og OPA1 ble målt ved RT-qPCR. Masterblandingen inkluderte LUNA Taq-polymerase (M3003L, New England Biolabs), 10 μM forover- og reversprimere, cDNA og vann av PCR-kvalitet for å gi et sluttvolum på 10 μL for hver reaksjon. Ekspresjon av delings- og fisjonsgener (DRP1, MFN1/2) ble målt ved hjelp av TaqMan-multipleksanalyser. Luna Universal Probe qPCR Master Mix (M3004S, New England Biolabs) ble brukt i henhold til produsentens instruksjoner med mindre modifikasjoner. Multipleks RT-qPCR-masterblandingen inkluderer 1X LUNA Taq-polymerase, 10 μM forover- og reversprimere, 10 μM probe, cDNA og vann av PCR-kvalitet, noe som resulterte i et sluttvolum på 20 μL for hver reaksjon. RT-qPCR ble utført ved hjelp av Rotor-Gene Q 6-plex (QIAGEN RG – serienummer: R0618110). Syklusforholdene er vist i tabell S1. Alle cDNA-prøver ble amplifisert i triplikat, og en standardkurve ble generert ved hjelp av en serie med tifoldige fortynninger. Uteliggere i triplikatprøver med standardavvik for syklusterskel (Ct) > 0,5 ble fjernet fra analysen for å sikre datareproduserbarhet30,72. Relativ genuttrykk ble beregnet ved hjelp av 2-ΔΔCt79-metoden.
Proteinprøver (60 μg) ble blandet med Laemmli-lastebuffer i forholdet 2:1 og kjørt på en 12 % fargeløs proteingel (Bio-Rad #1610184). Proteinene ble overført til en PVDF (polyvinylidenfluorid)-membran (#170-84156, Bio-Rad) ved bruk av Trans-Blot Turbo-systemet (#170-4155, Bio-Rad). Membranen ble blokkert og inkubert med passende primære antistoffer (OPA1, MFN1, MFN2 og DRP1) (fortynnet 1:1000) i 48 timer, etterfulgt av inkubasjon med sekundære antistoffer (1:10 000) i 1 time. Membranene ble deretter avbildet ved bruk av Clarity Western ECL Substrate (#170-5061, Bio-Rad) og registrert ved bruk av et Bio-Rad ChemiDoc MP-system. ImageLab versjon 6.1 ble brukt til Western blot-analyse. Den originale gelen og blottet er vist i figur S1. Antistoffinformasjon er gitt i tabell S2.
Datasettene presenteres som gjennomsnitt og standardfeil for gjennomsnittet (SEM) av minst tre uavhengige utvalg. Datasettene ble testet for normalitet ved hjelp av Shapiro-Wilks-testen (med mindre annet er angitt) før man antok en Gaussisk fordeling og like standardavvik og fortsatte med analysene. I tillegg ble datasettet analysert ved hjelp av Fishers MEL LSD (p < 0,05), enveis ANOVA (behandling vs. kontrollgjennomsnitt) og Dunnetts multiple sammenligningstest for å bestemme signifikans (p < 0,05). Signifikante p-verdier vises i grafen som *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001. Alle statistiske analyser og grafer ble utført og generert ved hjelp av GraphPad Prism 9.4.0.
Fiji/ImageJ-makroer for TEM-bildeanalyse er offentlig tilgjengelige på GitHub: https://github.com/caaja/TEMMitoMacro. Makroen Mitochondrial Event Locator (MEL) er offentlig tilgjengelig på GitHub: https://github.com/rensutheart/MEL-Fiji-Plugin.
Meiliana A., Devi NM og Vijaya A. Mitokondrier: mesterregulatorer av metabolisme, homeostase, stress, aldring og epigenetikk. Indonesian. Biomedical Science. J. 13, 221–241 (2021).
Ben-Shachar, D. Multifasettert mitokondriell dysfunksjon ved schizofreni, kompleks I som et mulig patologisk mål. Schizophrenia. resource. 187, 3–10 (2017).
Bose, A. og Beal, MF Mitokondriell dysfunksjon ved Parkinsons sykdom. J. Neurochemistry. 139, 216–231 (2016).
Sharma VK, Singh TG og Mehta V. Stressede mitokondrier: mål for invasjon ved Alzheimers sykdom. Mitochondria 59, 48–57 (2021).
Belenguer P., Duarte JMN, Shook PF og Ferreira GK Mitokondrier og hjernen: bioenergetikk og mer. Nevrotoksiner. ressurs. 36, 219–238 (2019).
Rangaraju, V. et al. Pleiotropiske mitokondrier: mitokondrienes innvirkning på nevronutvikling og sykdom. J. Neuroscience. 39, 8200–8208 (2019).
Cardaño-Ramos, C. og Morais, VA Mitokondriell biogenese i nevroner: hvordan og hvor. internasjonalitet. J. Mohr. vitenskapen. 22, 13059 (2021).
Yu, R., Lendahl, U., Nister, M. og Zhao, J. Regulering av mitokondriedynamikk hos pattedyr: muligheter og utfordringer. front. endokrin. (Lausanne) 11, 374 (2020).
Khacho, M. og Slack, RS Mitokondriell dynamikk i reguleringen av nevrogenese: fra den utviklende til den voksne hjernen. utvikling. dynamikk. 247, 47–53 (2018).