Takk for at du besøker Nature.com. Nettleserversjonen du bruker har begrenset støtte for CSS. For best mulig opplevelse anbefaler vi at du bruker en oppdatert nettleser (eller slår av kompatibilitetsmodus i Internet Explorer). I mellomtiden, for å sikre fortsatt støtte, vil vi vise nettstedet uten stiler og JavaScript.
Insulin-nanopartikler (NP) med høyt belastningsinnhold har funnet forskjellige bruksområder i forskjellige doseringsformer. Dette arbeidet tar sikte på å evaluere effekten av frysetørking og spraytørking på strukturen til insulinbelastede kitosan-nanopartikler, med eller uten mannitol som kryobeskyttelsesmiddel. Vi vurderte også kvaliteten på disse nanopartiklene ved å løse dem opp igjen. Før dehydrering ble partikkelstørrelsen til de kitosan/natriumtripolyfosfat/insulin-tverrbundne nanopartiklene optimalisert til å være 318 nm, PDI var 0,18, innkapslingseffektiviteten var 99,4 % og belastningen var 25,01 %. Etter rekonstituering beholdt alle nanopartikler, unntatt de som ble produsert ved en frysetørkingsmetode uten bruk av mannitol, sin sfæriske partikkelstruktur. Sammenlignet med mannitolholdige nanopartikler dehydrert ved enten spray, viste mannitolfrie spraytørkede nanopartikler også den minste gjennomsnittlige partikkelstørrelsen (376 nm) og det høyeste belastningsinnholdet. (25,02 %) med lignende innkapslingsrate (98,7 %) og PDI (0,20) ved tørke- eller frysetørkingsteknikker. De tørkede nanopartikler ved spraytørking uten mannitol resulterte også i den raskeste frigjøringen av insulin og den høyeste effektiviteten av cellulært opptak. Dette arbeidet viser at spraytørking kan dehydrere insulin-nanopartikler uten behov for kryobeskyttelsesmidler sammenlignet med konvensjonelle frysetørkingsmetoder, noe som skaper større lastekapasitet, lavere tilsetningsstoffbehov og en betydelig fordel i driftskostnader.
Siden oppdagelsen i 19221,2,3 har insulin og dets farmasøytiske preparater reddet livene til pasienter med type 1 diabetes (T1DM) og type 2 diabetes (T1DM). På grunn av egenskapene som et protein med høy molekylvekt, aggregeres insulin imidlertid lett, brytes ned av proteolytiske enzymer og elimineres via førstepassasjeeffekten. Personer som får diagnosen type 1 diabetes trenger insulininjeksjoner resten av livet. Mange pasienter som først får diagnosen type 2 diabetes trenger også langvarige insulininjeksjoner. Daglige insulininjeksjoner er en alvorlig kilde til daglig smerte og ubehag for disse personene, med negative effekter på mental helse. Som et resultat studeres andre former for insulinadministrasjon som forårsaker mindre ubehag, som oral insulinadministrasjon, grundig5, da de har potensial til å gjenopprette livskvaliteten til omtrent 5 milliarder mennesker med diabetes over hele verden.
Nanopartikkelteknologi har gitt et betydelig fremskritt i forsøk på å ta oral insulin4,6,7. En teknologi som effektivt innkapsler og beskytter insulin mot nedbrytning for målrettet levering til spesifikke kroppsområder. Bruken av nanopartikkelformuleringer har imidlertid flere begrensninger, hovedsakelig på grunn av stabilitetsproblemer i partikkelsuspensjoner. Noe aggregering kan forekomme under lagring, noe som reduserer biotilgjengeligheten av insulinbelastede nanopartikler8. I tillegg må den kjemiske stabiliteten til polymermatrisen av nanopartikler og insulin også vurderes for å sikre stabiliteten til insulin-nanopartikler (NP-er). For tiden er frysetørkingsteknologi gullstandarden for å lage stabile NP-er samtidig som uønskede endringer under lagring forhindres9.
Frysetørking krever imidlertid tilsetning av kryobeskyttelsesmidler for å forhindre at den sfæriske strukturen til nanopartikler påvirkes av den mekaniske belastningen fra iskrystaller. Dette reduserer mengden insulin-nanopartikler betydelig etter frysetørking, ettersom kryobeskyttelsesmidlet opptar mesteparten av vektforholdet. Derfor viser det seg at de produserte insulin-nanopartiklerne ofte er uegnet for fremstilling av tørre pulverformuleringer, som orale tabletter og orale filmer, på grunn av behovet for store mengder tørre nanopartikler for å oppnå insulinets terapeutiske vindu.
Spraytørking er en velkjent og rimelig prosess i industriell skala for å produsere tørre pulver fra flytende faser i farmasøytisk industri10,11. Kontroll over partikkeldannelsesprosessen muliggjør riktig innkapsling av flere bioaktive forbindelser12, 13. Videre har det blitt en effektiv teknikk for fremstilling av innkapslede proteiner for oral administrering. Under spraytørking fordamper vann veldig raskt, noe som bidrar til å holde temperaturen i partikkelkjernen lav11,14, noe som muliggjør bruk for å innkapsle varmefølsomme komponenter. Før spraytørking bør beleggmaterialet homogeniseres grundig med løsningen som inneholder de innkapslede ingrediensene11,14. I motsetning til frysetørking forbedrer homogenisering før innkapsling i spraytørking innkapslingseffektiviteten under dehydrering. Siden spraytørkingsinnkapslingsprosessen ikke krever kryobeskyttelsesmidler, kan spraytørking brukes til å produsere tørkede NP-er med høyt innhold av stoffer.
Denne studien rapporterer produksjonen av insulinbelastede nanopartikler ved tverrbinding av kitosan og natriumtripolyfosfat ved bruk av en ionegelmetode. Ionegelering er en fremstillingsmetode som tillater produksjon av nanopartikler gjennom elektrostatiske interaksjoner mellom to eller flere ioniske arter under visse forhold. Både frysetørkings- og spraytørkingsteknikker ble brukt til å dehydrere de optimaliserte kitosan/natriumtripolyfosfat/insulin-tverrbundne nanopartikler. Etter dehydrering ble morfologien deres analysert ved SEM. Rekombinasjonsevnen deres ble evaluert ved å måle størrelsesfordeling, overflateladning, PDI, innkapslingseffektivitet og lasteinnhold. Kvaliteten på resolubiliserte nanopartikler produsert ved forskjellige dehydreringsmetoder ble også evaluert ved å sammenligne deres insulinbeskyttelse, frigjøringsatferd og cellulære opptakseffektivitet.
PH-en i den blandede løsningen og forholdet mellom kitosan og insulin er to nøkkelfaktorer som påvirker partikkelstørrelsen og innkapslingseffektiviteten (EE) til de endelige nanopartikler, ettersom de direkte påvirker den ionotrope geleringsprosessen. PH-en i den blandede løsningen viste seg å være sterkt korrelert med partikkelstørrelse og innkapslingseffektivitet (fig. 1a). Som vist i fig. 1a, reduserte den gjennomsnittlige partikkelstørrelsen (nm) og EE økte betydelig når pH-en økte fra 4,0 til 6,0, mens den gjennomsnittlige partikkelstørrelsen begynte å øke og EE forble uendret når pH-en økte til 6,5. Etter hvert som forholdet mellom kitosan og insulin øker, øker også den gjennomsnittlige partikkelstørrelsen. Videre ble det ikke observert noen endring i EE når nanopartikler ble fremstilt med et masseforhold mellom kitosan/insulin høyere enn 2,5:1 (v/v) (fig. 1b). Derfor ble de optimale fremstillingsbetingelsene i denne studien (pH 6,0, kitosan/insulin masseforhold på 2,5:1) brukt. for å fremstille insulinbelastede nanopartikler for videre studier. Under disse fremstillingsbetingelsene ble den gjennomsnittlige partikkelstørrelsen til insulin-nanopartiklene optimalisert til å være 318 nm (fig. 1c), PDI var 0,18, innebyggingseffektiviteten var 99,4 %, zeta-potensialet var 9,8 mV, og insulinmengden var 25,01 % (m/m). Basert på resultater fra transmisjonselektronmikroskopi (TEM) var de optimaliserte nanopartiklene omtrent sfæriske og diskrete med relativt jevn størrelse (fig. 1d).
Parameteroptimalisering av insulin-nanopartikler: (a) effekten av pH på gjennomsnittlig diameter og innkapslingseffektivitet (EE) av insulin-nanopartikler (fremstilt med et masseforhold på 5:1 mellom kitosan og insulin); (b) kitosan og påvirkning av masseforholdet mellom insulin på gjennomsnittlig diameter og innkapslingseffektivitet (EE) av insulin-nanopartikler (fremstilt ved pH 6); (c) partikkelstørrelsesfordeling av optimaliserte insulin-nanopartikler; (d) TEM-mikrografi av optimaliserte insulin-nanopartikler.
Det er velkjent at kitosan er en svak polyelektrolytt med en pKa på 6,5. Den er positivt ladet i sure medier fordi dens viktigste aminogruppe protoneres av hydrogenioner15. Derfor brukes den ofte som bærer for å innkapsle negativt ladede makromolekyler. I denne studien ble kitosan brukt til å innkapsle insulin med et isoelektrisk punkt på 5,3. Siden kitosan brukes som beleggmateriale, øker tykkelsen på det ytre laget av nanopartiklene tilsvarende med økningen av andelen, noe som resulterer i en større gjennomsnittlig partikkelstørrelse. I tillegg kan høyere nivåer av kitosan innkapsle mer insulin. I vårt tilfelle var EE høyest når forholdet mellom kitosan og insulin nådde 2,5:1, og det var ingen signifikant endring i EE når forholdet fortsatte å øke.
Foruten forholdet mellom kitosan og insulin, spilte pH også en avgjørende rolle i fremstillingen av NP-er. Gan et al. 17 studerte effekten av pH på partikkelstørrelsen til kitosan-nanopartikler. De fant en kontinuerlig reduksjon i partikkelstørrelse inntil pH nådde 6,0, og en betydelig økning i partikkelstørrelse ble observert ved pH > 6,0, noe som er i samsvar med våre observasjoner. Dette fenomenet skyldes det faktum at med økende pH får insulinmolekylet en negativ overflateladning, og dermed favoriserer elektrostatiske interaksjoner med kitosan/natriumtripolyfosfat (TPP)-komplekset, noe som resulterer i liten partikkelstørrelse og høy EE. Men når pH ble justert til 6,5, ble aminogruppene på kitosan deprotonert, noe som resulterte i kitosanfolding. Dermed resulterer høy pH i mindre eksponering av aminoioner for TPP og insulin, noe som resulterer i lavere tverrbinding, større endelig gjennomsnittlig partikkelstørrelse og lavere EE.
Analyse av de morfologiske egenskapene til frysetørkede og spraytørkede nanopartikler kan veilede valget av bedre dehydrerings- og pulverdannelsesteknikker. Den foretrukne metoden bør gi medikamentstabilitet, ensartet partikkelform, høy medikamentmengde og god løselighet i den opprinnelige løsningen. I denne studien, for å bedre sammenligne de to teknikkene, ble insulin-nanopartikler med eller uten 1 % mannitol brukt under dehydrering. Mannitol brukes som et fyllstoff eller kryobeskyttelsesmiddel i forskjellige tørre pulverformuleringer for frysetørking og spraytørking. For de frysetørkede insulin-nanopartikler uten mannitol, som vist i figur 2a, ble en svært porøs pulverstruktur med store, uregelmessige og ru overflater observert under skanningselektronmikroskopi (SEM). Få separate partikler ble oppdaget i pulveret etter dehydrering (figur 2e). Disse resultatene indikerte at de fleste nanopartikler ble dekomponert under frysetørking uten kryobeskyttelsesmiddel. For frysetørkede og spraytørkede insulin-nanopartikler som inneholdt 1 % mannitol, ble sfæriske nanopartikler med glatte overflater observert (figur 2b, d, f, h). Insulin Nanopartikler spraytørket uten mannitol forble sfæriske, men rynkete på overflaten (fig. 2c). Sfæriske og rynkete overflater diskuteres videre i testene for frigjøringsatferd og cellulære opptak nedenfor. Basert på det synlige utseendet til de tørkede nanopartikler, ga både spraytørkede nanopartikler uten mannitol og NP-er frysetørket og spraytørket med mannitol fine NP-pulver (fig. 2f, g, h). Jo større overflatearealet mellom partikkeloverflatene er, desto høyere er løseligheten og dermed desto høyere er frigjøringshastigheten.
Morfologi av forskjellige dehydrerte insulin-NP-er: (a) SEM-bilde av frysetørkede insulin-NP-er uten mannitol; (b) SEM-bilde av frysetørkede insulin-NP-er med mannitol; (c) spraytørkede insulin-NP-er uten mannitol SEM-bilde av; (d) SEM-bilde av insulin-NP-er spraytørket med mannitol; (e) bilde av frysetørkede insulin-NP-pulver uten mannitol; (f) bilde av frysetørkede insulin-NP-pulver med mannitol; (g) bilde av spraytørkede insulin-NP-pulver uten mannitol; (h) bilde av spraytørkede insulin-NP-pulver med mannitol.
Under frysetørking fungerer mannitol som et kryobeskyttende middel, som holder NP-ene i en amorf form og forhindrer skade fra iskrystaller19. I motsetning til dette er det ikke noe frysetrinn under spraytørking. Derfor er ikke mannitol nødvendig i denne metoden. Faktisk ga spraytørkede NP-er uten mannitol finere NP-er som tidligere beskrevet. Mannitol kan imidlertid fortsatt fungere som et fyllstoff i spraytørkingsprosessen for å gi NP-ene en mer sfærisk struktur20 (fig. 2d), noe som bidrar til å oppnå ensartet frigjøringsatferd for slike innkapslede NP-er. I tillegg er det tydelig at noen store partikler kan detekteres i både frysetørkede og spraytørkede insulin-NP-er som inneholder mannitol (fig. 2b, d), noe som kan skyldes akkumulering av mannitol i partikkelkjernen sammen med det innkapslede insulinet. Til. Kitosanlaget. Det er verdt å merke seg at i denne studien, for å sikre at den sfæriske strukturen forblir intakt etter dehydrering, holdes forholdet mellom mannitol og kitosan på 5:1, slik at en stor mengde fyllstoff også kan forstørre partikkelstørrelsen til de tørkede nanopartikler.
Fourier-transform infrarød dempet totalrefleksjon (FTIR-ATR) spektroskopi karakteriserte den fysiske blandingen av fritt insulin, kitosan, kitosan, TPP og insulin. Alle dehydrerte NP-er ble karakterisert ved bruk av FTIR-ATR-spektroskopi. Det er verdt å merke seg at båndintensiteter på 1641, 1543 og 1412 cm⁻¹ ble observert i innkapslede NP-er frysetørket med mannitol og i NP-er spraytørket med og uten mannitol (fig. 3). Som tidligere rapportert var disse økningene i styrke assosiert med tverrbinding mellom kitosan, TPP og insulin. Undersøkelse av interaksjonen mellom kitosan og insulin viste at i FTIR-spektrene til insulinbelastede kitosan-nanopartikler overlappet kitosanbåndet med insulinets, noe som økte karbonylintensitets- (1641 cm⁻¹) og amin- (1543 cm⁻¹) beltet. Tripolyfosfatgruppene i TPP er knyttet til ammoniumgrupper i kitosan, og danner et bånd ved 1412 cm⁻¹.
FTIR-ATR-spektre av fritt insulin, kitosan, fysiske blandinger av kitosan/TPP/insulin og NP-er dehydrert ved forskjellige metoder.
Videre er disse resultatene konsistente med de som er vist i SEM, som viste at de innkapslede NP-ene forble intakte både når de ble sprayet og frysetørket med mannitol, men i fravær av mannitol produserte kun spraytørking innkapslede partikler. I motsetning til dette var FTIR-ATR-spektrale resultater av NP-er frysetørket uten mannitol svært like den fysiske blandingen av kitosan, TPP og insulin. Dette resultatet indikerer at tverrbindingene mellom kitosan, TPP og insulin ikke lenger er tilstede i NP-er frysetørket uten mannitol. NP-strukturen ble ødelagt under frysetørking uten kryobeskyttelsesmiddel, noe som kan sees i SEM-resultatene (fig. 2a). Basert på morfologien og FTIR-resultatene av dehydrerte insulin-NP-er, ble kun frysetørkede, spraytørkede og mannitolfrie NP-er brukt til rekonstitusjonsforsøk, og mannitolfrie NP-er på grunn av nedbrytning av mannitolfrie NP-er under dehydrering. diskutere.
Dehydrering brukes til langtidslagring og reprosessering til andre formuleringer. Evnen til tørre NP-er til å rekonstituere etter lagring er kritisk for deres bruk i forskjellige formuleringer som tabletter og filmer. Vi la merke til at den gjennomsnittlige partikkelstørrelsen til de spraytørkede insulin-NP-ene i fravær av mannitol bare økte litt etter rekonstituering. På den annen side økte partikkelstørrelsen til de spraytørkede og frysetørkede insulin-nanopartiklene med mannitol betydelig (tabell 1). PDI og EE ble ikke signifikant endret (p > 0,05) etter rekombinasjon av alle NP-ene i denne studien (tabell 1). Dette resultatet indikerer at de fleste partiklene forble intakte etter oppløsning. Tilsetning av mannitol resulterte imidlertid i en sterkt redusert insulinmengde i frysetørkede og spraytørkede mannitol-nanopartikler (tabell 1). I motsetning til dette forble insulinmengden i NP-er spraytørket uten mannitol det samme som før (tabell 1).
Det er velkjent at mengden nanopartikler er kritisk når de brukes til medikamentlevering. For NP-er med lave mengder kreves det svært store mengder materiale for å nå den terapeutiske terskelen. Imidlertid fører den høye viskositeten til slike høye NP-konsentrasjoner til ulemper og vanskeligheter ved henholdsvis oral administrering og injiserbare formuleringer 22. I tillegg kan insulin-NP-er også brukes til å lage tabletter og viskøse biofilmer 23, 24, noe som krever bruk av store mengder NP-er ved lave mengdenivåer, noe som resulterer i store tabletter og tykke biofilmer som ikke er egnet for oral bruk. Derfor er dehydrerte NP-er med høy insulinmengde svært ønskelig. Resultatene våre tyder på at den høye insulinmengden til mannitolfrie spraytørkede NP-er kan gi mange attraktive fordeler for disse alternative leveringsmetodene.
Alle dehydrerte NP-er ble oppbevart i kjøleskapet i tre måneder. SEM-resultater viste at morfologien til alle dehydrerte NP-er ikke endret seg vesentlig i løpet av den tre måneder lange lagringen (fig. 4). Etter rekonstituering i vann viste alle NP-er en liten reduksjon i EE og frigjorde omtrent en liten mengde (~5 %) insulin i løpet av den tre måneder lange lagringsperioden (tabell 2). Imidlertid økte den gjennomsnittlige partikkelstørrelsen til alle nanopartikler. Partikkelstørrelsen til NP-er spraytørket uten mannitol økte til 525 nm, mens størrelsen på spraytørkede og frysetørkede NP-er med mannitol økte til henholdsvis 872 og 921 nm (tabell 2).
Morfologi av forskjellige dehydrerte insulin-nanopartikler lagret i tre måneder: (a) SEM-bilde av frysetørkede insulin-nanopartikler med mannitol; (b) SEM-bilde av spraytørkede insulin-nanopartikler uten mannitol; (c) SEM-bilder av spraytørkede insulin-nanopartikler uten mannitol.
Videre ble det observert utfellinger i de rekonstituerte insulin-nanopartikler som ble spraytørket med mannitol og frysetørket (fig. S2). Dette kan skyldes at store partikler ikke suspenderte ordentlig i vannet. Alle resultatene ovenfor viser at spraytørkingsteknikken kan beskytte insulin-nanopartikler mot dehydrering, og at høye mengder insulin-nanopartikler kan oppnås uten fyllstoffer eller kryobeskyttelsesmidler.
Insulinretensjon ble testet i pH = 2,5 medium med pepsin, trypsin og α-kymotrypsin for å demonstrere den beskyttende evnen til NP-er mot enzymatisk fordøyelse etter dehydrering. Insulinretensjonen til dehydrerte NP-er ble sammenlignet med den til ferskt tilberedte NP-er, og fritt insulin ble brukt som negativ kontroll. I denne studien viste fritt insulin rask insulineliminering innen 4 timer i alle tre enzymatiske behandlinger (fig. 5a–c). I motsetning til dette viste insulinelimineringstesting av NP-er frysetørket med mannitol og NP-er spraytørket med eller uten mannitol betydelig høyere beskyttelse av disse NP-ene mot enzymatisk fordøyelse, noe som var likt den for ferskt tilberedte insulin-NP-er (figur 1). 5a–c). Ved hjelp av nanopartikler i pepsin, trypsin og α-kymotrypsin kunne mer enn 50 %, 60 % og 75 % av insulinet beskyttes innen henholdsvis 4 timer (fig. 5a–c). Denne insulinbeskyttende evnen kan øke sjansen for høyere insulinabsorpsjon. inn i blodet25. Disse resultatene tyder på at spraytørking med eller uten mannitol og frysetørking med mannitol kan bevare den insulinbeskyttende evnen til NP-er etter dehydrering.
Beskyttelse og frigjøringsatferd av dehydrerte insulin-nanopartikler: (a) beskyttelse av insulin i pepsinløsning; (b) beskyttelse av insulin i trypsinløsning; (c) beskyttelse av insulin med α-kymotrypsinløsning; (d) Frigjøringsatferden til dehydrerte nanopartips i en løsning med pH 2,5; (e) frigjøringsatferden til dehydrerte nanopartips i en løsning med pH 6,6; (f) frigjøringsatferden til dehydrerte nanopartips i en løsning med pH 7,0.
Ferskt tilberedte og rekonstituerte tørre insulin-nanopartikler ble inkubert i forskjellige buffere (pH = 2,5, 6,6, 7,0) ved 37 °C, som simulerte pH-miljøet i magesekken, tolvfingertarmen og øvre tynntarm, for å undersøke effekten av insulin på insulinresistens. Frigjøringsatferd i forskjellige miljøer. Fragment av mage-tarmkanalen. Ved pH = 2,5 viste insulinbelastede NP-er og resolubiliserte tørre insulin-NP-er en initial utbruddsfrigjøring innen den første timen, etterfulgt av en langsom frigjøring over de neste 5 timene (fig. 5d). Denne raske frigjøringen i begynnelsen er mest sannsynlig et resultat av rask overflatedesorpsjon av proteinmolekyler som ikke er fullstendig immobilisert i partikkelens indre struktur. Ved pH = 6,5 viste insulinbelastede NP-er og rekonstituerte tørre insulin-NP-er en jevn og langsom frigjøring over 6 timer, ettersom pH-en i testløsningen var lik den i den NP-fremstilte løsningen (fig. 5e). Ved pH = 7 var NP-ene ustabile og nesten fullstendig dekomponert innen de første to timene (fig. 5f). Dette skyldes at deprotonering av kitosan skjer ved høyere pH, noe som resulterer i et mindre kompakt polymernettverk og frigjøring av ladet insulin.
Videre viste insulin-NP-ene som ble spraytørket uten mannitol en raskere frigjøringsprofil enn de andre dehydrerte NP-ene (fig. 5d–f). Som tidligere beskrevet viste de rekonstituerte insulin-NP-ene som ble tørket uten mannitol den minste partikkelstørrelsen. Små partikler gir et større overflateareal, slik at mesteparten av det relevante legemidlet vil være på eller nær partikkeloverflaten, noe som resulterer i rask legemiddelfrigjøring26.
Cytotoksisiteten til NP-er ble undersøkt ved MTT-analyse. Som vist i figur S4, ble det funnet at alle dehydrerte NP-er ikke hadde noen signifikant effekt på cellelevedyktighet ved konsentrasjoner på 50–500 μg/ml, noe som tyder på at alle dehydrerte NP-er trygt kan brukes til å nå det terapeutiske vinduet.
Leveren er hovedorganet som insulin utøver sine fysiologiske funksjoner gjennom. HepG2-celler er en human hepatomcellelinje som ofte brukes som en in vitro hepatocyttopptaksmodell. Her ble HepG2-celler brukt til å vurdere cellulært opptak av dehydrerte NP-er ved hjelp av frysetørking og spraytørking. Cellulært opptak ved konfokal laserskanning ved hjelp av flowcytometri og syn etter flere timers inkubasjon med fritt FITC-insulin i en konsentrasjon på 25 μg/ml, ferskt tilberedte FITC-insulinbelastede NP-er og dehydrerte FITC-insulinbelastede NP-er ved like insulinkonsentrasjoner. Kvantitative mikroskopiobservasjoner (CLSM) ble utført. Lyofiliserte NP-er uten mannitol ble ødelagt under dehydrering og ble ikke evaluert i denne testen. De intracellulære fluorescensintensitetene til ferskt tilberedte insulinbelastede NP-er, frysetørkede NP-er med mannitol og spraytørkede NP-er med og uten mannitol (fig. 6a) var 4,3, 2,6, 2,4 og 4,1 ganger høyere enn de frie. FITC-insulin henholdsvis gruppe (fig. 6b). Disse resultatene tyder på at innkapslet insulin har mer potent cellulært opptak enn fritt insulin, hovedsakelig på grunn av den mindre størrelsen på de insulinbelastede nanopartiklene som ble produsert i studien.
HepG2-celleopptak etter 4 timers inkubasjon med ferskt tilberedte NP-er og dehydrerte NP-er: (a) Fordeling av FITC-insulinopptak av HepG2-celler. (b) Geometrisk gjennomsnitt av fluorescensintensiteter analysert ved flowcytometri (n = 3), *P < 0,05 sammenlignet med fritt insulin.
På samme måte viste CLSM-bildene at FITC-fluorescensintensitetene til ferskt tilberedte FITC-insulinlastede NP-er og FITC-insulinlastede spraytørkede NP-er (uten mannitol) var mye sterkere enn for de andre prøvene (fig. 6a). Videre, med tilsetning av mannitol, økte den høyere viskositeten til løsningen motstanden mot cellulært opptak, noe som resulterte i redusert insulinproliferasjon. Disse resultatene antyder at mannitolfrie spraytørkede NP-er viste den høyeste cellulære opptakseffektiviteten fordi partikkelstørrelsen deres var mindre enn for frysetørkede NP-er etter gjenoppløsning.
Kitosan (gjennomsnittlig molekylvekt 100 kDa, 75–85 % deacetylert) ble kjøpt fra Sigma-Aldrich (Oakville, Ontario, Canada). Natriumtripolyfosfat (TPP) ble kjøpt fra VWR (Radnor, Pennsylvania, USA). Rekombinant humant insulin som ble brukt i denne studien var fra Fisher Scientific (Waltham, MA, USA). Fluorescein-isotiocyanat (FITC)-merket humant insulin og 4′,6-diamidino-2-fenylindoldihydroklorid (DAPI) ble kjøpt fra Sigma-Aldrich (Oakville, Ontario, Canada). HepG2-cellelinjen ble hentet fra ATCC (Manassas, Virginia, USA). Alle andre reagenser var av analytisk eller kromatografisk kvalitet.
Lag en 1 mg/ml CS-løsning ved å løse den opp i dobbeltdestillert vann (DD-vann) som inneholder 0,1 % eddiksyre. Lag 1 mg/ml løsninger av TPP og insulin ved å løse dem opp i henholdsvis DD-vann og 0,1 % eddiksyre. Preemulsjonen ble fremstilt med en polytron PCU-2-110 høyhastighetshomogenisator (Brinkmann Ind. Westbury, NY, USA). Tilberedningsprosessen er som følger: først tilsettes 2 ml TPP-løsning til 4 ml insulinløsning, og blandingen omrøres i 30 minutter og blandes fullstendig. Deretter ble den blandede løsningen dråpevis tilsatt CS-løsningen gjennom en sprøyte under høyhastighetsomrøring (10 000 o/min). Blandingene ble holdt under høyhastighetsomrøring (15 000 o/min) i et isbad i 30 minutter, og de ble justert til en viss pH for å oppnå tverrbundne insulin-NP-er. For å homogenisere og redusere partikkelstørrelsen til insulin-NP-ene ytterligere ble de sonikert i en ytterligere 30 minutter i et isbad ved bruk av en sonikator av probetypen (UP 200ST, Hielscher Ultrasonics, Teltow, Tyskland).
Insulin-NPS ble testet for Z-gjennomsnittlig diameter, polydispersitetsindeks (PDI) og zeta-potensial ved bruk av dynamisk lysspredning (DLS)-målinger med en Litesizer 500 (Anton Paar, Graz, Østerrike) ved å fortynne dem i DD-vann ved 25 °C. Morfologi og størrelsesfordeling ble karakterisert med et Hitachi H7600 transmisjonselektronmikroskop (TEM) (Hitachi, Tokyo, Japan), og bildene ble deretter analysert ved hjelp av Hitachi-bildebehandlingsprogramvare (Hitachi, Tokyo, Japan). For å vurdere innkapslingseffektiviteten (EE) og lastekapasiteten (LC) til insulin-NP-er ble NP-ene pipettert inn i ultrafiltreringsrør med en molekylvektsgrense på 100 kDa og sentrifugert ved 500 xg i 30 minutter. Uinnkapslet insulin i filtratet ble kvantifisert ved bruk av et Agilent 1100-serie HPLC-system (Agilent, Santa Clara, California, USA) bestående av en kvaternær pumpe, autosampler, kolonnevarmer og DAD. detektor. Insulin ble analysert med en C18-kolonne (Zorbax, 3,5 μm, 4,6 mm × 150 mm, Agilent, USA) og detektert ved 214 nm. Den mobile fasen var acetonitril og vann, som inneholdt 0,1 % TFA, gradientforhold fra 10/90 til 100/0, og ble kjørt i 10 minutter. Den mobile fasen ble pumpet med en strømningshastighet på 1,0 ml/min. Kolonnetemperaturen ble satt til 20 °C. Beregn prosentandelene av EE og LC ved hjelp av ligningene (1) og ligning (2).
Ulike CS/insulin-forhold fra 2,0 til 4,0 ble testet for å optimalisere insulin NP. Ulike mengder CS-løsning ble tilsatt under fremstillingen, mens insulin/TPP-blandingen ble holdt konstant. Insulin NP-er ble fremstilt i pH-området 4,0 til 6,5 ved å nøye kontrollere pH-verdien i blandingen etter tilsetning av alle løsninger (insulin, TPP og CS). EE og partikkelstørrelsen til insulin-nanopartiklene ble evaluert ved forskjellige pH-verdier og CS/insulin-masseforhold for å optimalisere dannelsen av insulin NP-er.
De optimaliserte insulin-NP-ene ble plassert på aluminiumsbeholderen og dekket med papir og strammet til med litt tape. Deretter ble de skrudde beholderne plassert i en Labconco FreeZone frysetørker (Labconco, Kansas City, MO, USA) utstyrt med en bretttørker. Temperaturen og vakuumtrykket ble satt til -10 °C, 0,350 Torr de første 2 timene, og 0 °C og 0,120 Torr de resterende 22 timene av de 24 timene for å oppnå tørre insulin-NP-er.
Buchi Mini Spray Dryer B-290 (BÜCHI, Flawil, Sveits) ble brukt til å generere innkapslet insulin. De valgte tørkeparametrene var: temperatur 100 °C, tilførselsstrøm 3 L/min og gassstrøm 4 L/min.
Insulin-nanopartikler før og etter dehydrering ble karakterisert ved hjelp av FTIR-ATR-spektroskopi. Dehydrerte nanopartikler samt fritt insulin og kitosan ble analysert ved hjelp av et Spectrum 100 FTIR-spektrofotometer (PerkinElmer, Waltham, Massachusetts, USA) utstyrt med et universelt ATR-prøvetakingstilbehør (PerkinElmer, Waltham, Massachusetts, USA). Signalgjennomsnitt ble oppnådd fra 16 skanninger med en oppløsning på 4 cm2 i frekvensområdet 4000–600 cm2.
Morfologien til tørre insulin-nanopartikler ble vurdert ved hjelp av SEM-bilder av frysetørkede og spraytørkede insulin-nanopartikler tatt med et Helios NanoLab 650 Focused Ion Beam-Scanning Electron Microscope (FIB-SEM) (FEI, Hillsboro, Oregon, USA). Hovedparameteren som ble brukt var spenning 5 keV og strøm 30 mA.
Alle dehydrerte insulin-NP-er ble løst opp på nytt i dehydrert vann. Partikkelstørrelse, PDI, EE og LC ble testet igjen med samme metode som nevnt tidligere for å vurdere kvaliteten etter dehydrering. Stabiliteten til anhydroinsulin-NP-er ble også målt ved å teste egenskapene til NP-ene etter langvarig lagring. I denne studien ble alle NP-ene etter dehydrering lagret i kjøleskapet i tre måneder. Etter tre måneders lagring ble NP-ene testet for morfologisk partikkelstørrelse, PDI, EE og LC.
Løs opp 5 ml rekonstituerte NP-er i 45 ml som inneholder simulert magevæske (pH 1,2, inneholdende 1 % pepsin), tarmvæske (pH 6,8, inneholdende 1 % trypsin) eller kymotrypsinløsning (100 g/ml, i fosfatbuffer, pH 7,8) for å evaluere insulinets effekt i å beskytte NP-er etter dehydrering. De ble inkubert ved 37 °C med en omrøringshastighet på 100 rpm. 500 μl av løsningen ble samlet opp på forskjellige tidspunkter, og insulinkonsentrasjonen ble bestemt ved HPLC.
In vitro-frigjøringsatferden til ferskt tilberedte og dehydrerte insulin-nanopartiklene ble testet med dialyseposemetoden (molekylvektsgrense 100 kDa, Spectra Por Inc.). Ferskt tilberedte og rekonstituerte tørre nanopartiklene ble dialysert i væsker ved pH 2,5, pH 6,6 og pH 7,0 (0,1 M fosfatbufret saltvann, PBS) for å simulere pH-miljøet i henholdsvis magesekken, tolvfingertarmen og øvre tynntarm. Alle prøver ble inkubert ved 37 °C med kontinuerlig risting ved 200 rpm. Aspirer væsken utenfor 5 ml dialyseposen på følgende tidspunkter: 0,5, 1, 2, 3, 4 og 6 timer, og etterfyll umiddelbart volumet med ferskt dialysat. Insulinforurensning i væsken ble analysert ved HPLC, og hastigheten på insulinfrigjøring fra nanopartiklene ble beregnet ut fra forholdet mellom fritt insulin frigjort og totalt insulin innkapslet i nanopartiklene (ligning 3).
Humane hepatocellulært karsinomcellelinje HepG2-celler ble dyrket i skåler med 60 mm diameter ved bruk av Dulbeccos modifiserte Eagle-medium (DMEM) som inneholdt 10 % føtalt bovint serum, 100 IE/ml penicillin og 100 μg/ml streptomycin29. Kulturene ble opprettholdt ved 37 °C, 95 % relativ fuktighet og 5 % CO2. For opptaksanalyser ble HepG2-celler sådd med 1 × 105 celler/ml på et 8-brønns Nunc Lab-Tek kammerslide-system (Thermo Fisher, NY, USA). For cytotoksisitetsanalyser ble de sådd i 96-brønnsplater (Corning, NY, USA) med en tetthet på 5 × 104 celler/ml.
MTT-analysen ble brukt til å evaluere cytotoksisiteten til ferskt fremstilte og dehydrerte insulin-NP-er30. HepG2-celler ble sådd i 96-brønnsplater med en tetthet på 5 × 104 celler/ml og dyrket i 7 dager før testing. Insulin-NP-er ble fortynnet til forskjellige konsentrasjoner (50 til 500 μg/ml) i kulturmedium og deretter administrert til cellene. Etter 24 timers inkubasjon ble cellene vasket 3 ganger med PBS og inkubert med medium som inneholdt 0,5 mg/ml MTT i ytterligere 4 timer. Cytotoksisitet ble vurdert ved å måle den enzymatiske reduksjonen av gul tetrazolium-MTT til lilla formazan ved 570 nm ved bruk av en Tecan infinite M200 pro spektrofotometerplateleser (Tecan, Männedorf, Sveits).
Den cellulære opptakseffektiviteten til NP-er ble testet ved konfokal laserskanningsmikroskopi og flowcytometrianalyse. Hver brønn i Nunc Lab-Tek kammerslide-systemet ble behandlet med fritt FITC-insulin, FITC-insulinlastede NP-er, og rekonstituert 25 μg/ml dehydrerte FITC-insulin NP-er ved samme konsentrasjon og inkubert i 4 timer. Cellene ble vasket 3 ganger med PBS og fiksert med 4% paraformaldehyd. Kjerner ble farget med 4',6-diamidino-2-fenylindol (DAPI). Insulinlokalisering ble observert ved bruk av et Olympus FV1000 laserskannings-/tofoton-konfokalmikroskop (Olympus, Shinjuku City, Tokyo, Japan). For flowcytometrianalyse ble de samme konsentrasjonene av 10 μg/ml fritt FITC-insulin, FITC-insulinlastede NP-er og resolubiliserte dehydrerte FITC-insulin NP-er tilsatt til 96-brønnsplater sådd med HepG2-celler og inkubert i 4 timer. Etter 4 timers inkubasjon ble cellene fjernet og vasket 3 ganger med FBS. 5 × 104 celler per prøve ble analysert med et BD LSR II flowcytometer (BD, Franklin Lakes, New Jersey, USA).
Alle verdier er uttrykt som gjennomsnitt ± standardavvik. Sammenligninger mellom alle gruppene ble vurdert ved hjelp av enveis ANOVA eller t-test med IBM SPSS Statistics 26 for Mac (IBM, Endicott, New York, USA), og p < 0,05 ble ansett som statistisk signifikant.
Denne studien demonstrerer fleksibiliteten og evnen til spraytørking til å dehydrere tverrbundne kitosan/TPP/insulin-nanopartikler med bedre rekonstituering sammenlignet med standard frysetørkingsmetoder som bruker bulkmidler eller kryobeskyttelsesmidler med høyere lastekapasitet. De optimaliserte insulin-nanopartiklene ga en gjennomsnittlig partikkelstørrelse på 318 nm og en innkapslingseffektivitet på 99,4 %. SEM- og FTIR-resultater etter dehydrering viste at den sfæriske strukturen bare ble opprettholdt i spraytørkede NP-er med og uten mannitol og frysetørket med mannitol, men frysetørkede NP-er uten mannitol ble dekomponert under dehydrering. I rekonstitusjonstesten viste insulin-nanopartikler spraytørket uten mannitol den minste gjennomsnittlige partikkelstørrelsen og den høyeste belastningen ved rekonstituering. Frigjøringsatferden til alle disse dehydrerte NP-ene viste at de ble raskt frigjort i løsninger med pH = 2,5 og pH = 7, og svært stabile i løsninger med pH = 6,5. Sammenlignet med andre gjenoppløste dehydrerte NP-er, var NP-ene Spraytørket uten mannitol viste den raskeste frigjøringen. Dette resultatet er i samsvar med det som ble observert i den cellulære opptaksanalysen, ettersom spraytørkede NP-er i fravær av mannitol nesten fullstendig opprettholdt den cellulære opptakseffektiviteten til ferskt fremstilte NP-er. Disse resultatene antyder at tørre insulin-nanopartikler fremstilt ved mannitolfri spraytørking er mest egnet for videre bearbeiding til andre vannfrie doseringsformer, for eksempel orale tabletter eller bioadhesive filmer.
På grunn av problemer med immaterielle rettigheter er datasettene som ble generert og/eller analysert i løpet av den nåværende studien ikke offentlig tilgjengelige, men er tilgjengelige fra de respektive forfatterne på rimelig forespørsel.
Kagan, A. Type 2 diabetes: sosiale og vitenskapelige opphav, medisinske komplikasjoner og implikasjoner for pasienter og andre. (McFarlane, 2009).
Singh, AP, Guo, Y., Singh, A., Xie, W. og Jiang, P. Utviklingen av insulininnkapsling: er oral administrering nå mulig? J. Pharmacy.bio-pharmacy.reservoir.1, 74–92 (2019).
Wong, CY, Al-Salami, H. & Dass, CR Nylige fremskritt innen orale insulinbelastede liposomalleveringssystemer for behandling av diabetes. Interpretation. J. Pharmacy. 549, 201–217 (2018).