Artikkelen er en del av forskningsemnet «Forbedring av belgfrukters resistens mot patogener og skadedyr», se alle 5 artiklene
Den årsakende faktoren for soppsykdommen nekrose hos planter, Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary, bruker en flerlagsstrategi for å infisere forskjellige vertsplanter. Denne studien foreslår bruk av diaminen L-ornitin, en ikke-proteinbasert aminosyre som stimulerer syntesen av andre essensielle aminosyrer, som en alternativ håndteringsstrategi for å forbedre de molekylære, fysiologiske og biokjemiske responsene til Phaseolus vulgaris L. på hvitmugg forårsaket av Pseudomonas sclerotiorum. In vitro-eksperimenter viste at L-ornitin signifikant hemmet mycelveksten til S. pyrenoidosa på en doseavhengig måte. Dessuten kunne det redusere alvorlighetsgraden av hvitmugg betydelig under drivhusforhold. Videre stimulerte L-ornitin veksten til de behandlede plantene, noe som indikerer at de testede konsentrasjonene av L-ornitin ikke var fytotoksiske for de behandlede plantene. I tillegg økte L-ornitin uttrykket av ikke-enzymatiske antioksidanter (totale løselige fenoler og flavonoider) og enzymatiske antioksidanter (katalase (CAT), peroksidase (POX) og polyfenoloksidase (PPO)), og økte uttrykket av tre antioksidantrelaterte gener (PvCAT1, PvSOD og PvGR). Videre avslørte in silico-analyse tilstedeværelsen av et antatt oksaloacetatacetylhydrolase (SsOAH)-protein i S. sclerotiorum-genomet, som var svært likt oksaloacetatacetylhydrolase (SsOAH)-proteinene til Aspergillus fijiensis (AfOAH) og Penicillium sp. (PlOAH) når det gjelder funksjonell analyse, konserverte domener og topologi. Interessant nok reduserte tilsetning av L-ornitin til potetdekstrosebuljongmedium (PDB) uttrykket av SsOAH-genet i S. sclerotiorum-mycel betydelig. På samme måte reduserte eksogen tilførsel av L-ornitin uttrykket av SsOAH-genet betydelig i soppmycelier samlet fra behandlede planter. Til slutt reduserte L-ornitintilførsel oksalsyresekresjonen betydelig i både PDB-medium og infiserte blader. Avslutningsvis spiller L-ornitin en nøkkelrolle i å opprettholde redoksstatusen samt forbedre forsvarsresponsen til infiserte planter. Resultatene av denne studien kan bidra til å utvikle innovative, miljøvennlige metoder for å kontrollere hvitmugg og redusere dens innvirkning på bønneproduksjon og andre avlinger.
Hvitmugg, forårsaket av den nekrotrofiske soppen Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary, er en ødeleggende, avlingsreduserende sykdom som utgjør en alvorlig trussel mot den globale bønneproduksjonen (Phaseolus vulgaris L.) (Bolton et al., 2006). Sclerotinia sclerotiorum er en av de vanskeligste jordbårne soppplantepatogenene å kontrollere, med et bredt vertsspekter på over 600 plantearter og evnen til raskt å maserere vertsvev på en uspesifikk måte (Liang og Rollins, 2018). Under ugunstige forhold gjennomgår den en kritisk fase av livssyklusen, der den forblir sovende i lange perioder som svarte, harde, frølignende strukturer kalt «sklerotier» i jorden eller som hvite, luftige utvekster i mycelet eller stilkmargen til infiserte planter (Schwartz et al., 2005). S. sclerotiorum er i stand til å danne sklerotier, noe som gjør at den kan overleve i infiserte åkre i lange perioder og vedvare under sykdom (Schwartz et al., 2005). Sklerotier er rike på næringsstoffer, kan vedvare i jorden i lange perioder og tjene som det primære inokulumet for påfølgende infeksjoner (Schwartz et al., 2005). Under gunstige forhold spirer sklerotier og produserer luftbårne sporer som kan infisere alle overjordiske deler av planten, inkludert, men ikke begrenset til, blomster, stilker eller belger (Schwartz et al., 2005).
Sclerotinia sclerotiorum bruker en flerlagsstrategi for å infisere vertsplantene sine, som involverer en rekke koordinerte hendelser fra sklerotiell spiring til symptomutvikling. I utgangspunktet produserer S. sclerotiorum suspenderte sporer (kalt askosporer) fra sopplignende strukturer kalt apoteker, som blir luftbårne og utvikler seg til ikke-bevegelige sklerotier på infiserte planteavfall (Bolton et al., 2006). Soppen skiller deretter ut oksalsyre, en virulensfaktor, for å kontrollere pH-verdien i plantecelleveggen, fremme enzymatisk nedbrytning og vevsinvasjon (Hegedus og Rimmer, 2005), og undertrykke vertsplantens oksidative utbrudd. Denne forsuringsprosessen svekker plantecelleveggen, og gir et gunstig miljø for normal og effektiv drift av soppcelleveggnedbrytende enzymer (CWDE-er), slik at patogenet kan overvinne den fysiske barrieren og trenge inn i vertsvevet (Marciano et al., 1983). Når S. sclerotiorum har penetrert, utskiller den en rekke CWDE-er, som polygalakturonase og cellulase, som letter spredningen i infisert vev og forårsaker vevsnekrose. Progresjonen av lesjoner og hyfematter fører til de karakteristiske symptomene på hvitmugg (Hegedus og Rimmer, 2005). I mellomtiden gjenkjenner vertsplanter patogenassosierte molekylære mønstre (PAMP-er) gjennom mønstergjenkjenningsreseptorer (PRR-er), noe som utløser en rekke signalhendelser som til slutt aktiverer forsvarsresponser.
Til tross for flere tiår med sykdomsbekjempelse, er det fortsatt mangel på tilstrekkelig resistent kimplasma i bønner, som i andre kommersielle avlinger, på grunn av patogenets resistens, overlevelse og tilpasningsevne. Sykdomshåndtering er derfor ekstremt utfordrende og krever en integrert, mangesidig strategi som inkluderer en kombinasjon av kulturpraksis, biologisk kontroll og kjemiske soppdrepende midler (O'Sullivan et al., 2021). Kjemisk kontroll av hvitmugg er den mest effektive fordi soppdrepende midler, når de brukes riktig og til rett tid, effektivt kan kontrollere spredningen av sykdommen, redusere alvorlighetsgraden av infeksjonen og minimere avlingstap. Imidlertid kan overforbruk og overdreven avhengighet av soppdrepende midler føre til fremvekst av resistente stammer av S. sclerotiorum og ha en negativ innvirkning på ikke-målorganismer, jordhelse og vannkvalitet (Le Cointe et al., 2016; Ceresini et al., 2024). Derfor har det å finne miljøvennlige alternativer blitt en topprioritet.
Polyaminer (PA), som putrescin, spermidin, spermin og kadaverin, kan tjene som lovende alternativer mot jordbårne plantepatogener, og dermed redusere bruken av farlige kjemiske soppdrepende midler helt eller delvis (Nehela et al., 2024; Yi et al., 2024). I høyere planter er PA involvert i mange fysiologiske prosesser, inkludert, men ikke begrenset til, celledeling, differensiering og respons på abiotiske og biotiske stressfaktorer (Killiny og Nehela, 2020). De kan fungere som antioksidanter, bidra til å fange opp reaktive oksygenarter (ROS), opprettholde redokshomeostase (Nehela og Killiny, 2023), indusere forsvarsrelaterte gener (Romero et al., 2018), regulere ulike metabolske veier (Nehela og Killiny, 2023), modulere endogene fytohormoner (Nehela og Killiny, 2019), etablere systemisk ervervet resistens (SAR) og regulere plante-patogen-interaksjoner (Nehela og Killiny, 2020; Asija et al., 2022; Czerwoniec, 2022). Det er verdt å merke seg at de spesifikke mekanismene og rollene til PA-er i planteforsvar varierer avhengig av planteart, patogener og miljøforhold. Den mest tallrike PA-en i planter biosyntetiseres fra det essensielle polyaminet L-ornitin (Killiny og Nehela, 2020).
L-ornitin spiller flere roller i plantevekst og -utvikling. Tidligere studier har for eksempel vist at ornitin i ris (Oryza sativa) kan være assosiert med nitrogenresirkulering (Liu et al., 2018), risutbytte, kvalitet og aroma (Lu et al., 2020) og vannstressrespons (Yang et al., 2000). Videre forbedret eksogen påføring av L-ornitin tørketoleransen betydelig hos sukkerroer (Beta vulgaris) (Hussein et al., 2019) og lindret saltstress hos løkplanter (Allium Cepa) (Çavuşoǧlu og Çavuşoǧlu, 2021) og cashewnøttplanter (Anacardium occidentale) (da Rocha et al., 2012). Den potensielle rollen til L-ornitin i abiotisk stressforsvar kan skyldes dets involvering i prolinopphopning i behandlede planter. For eksempel har gener relatert til prolinmetabolisme, som ornitin delta aminotransferase (delta-OAT) og prolin dehydrogenase (ProDH1 og ProDH2) gener, tidligere blitt rapportert å være involvert i forsvaret av Nicotiana benthamiana og Arabidopsis thaliana mot ikke-vert Pseudomonas syringae-stammer (Senthil-Kumar og Mysore, 2012). På den annen side er soppornitin dekarboksylase (ODC) nødvendig for patogenvekst (Singh et al., 2020). Målretting av ODC av Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici via vertsindusert gensilencing (HIGS) økte tomatplanters resistens mot Fusarium-visnesyke betydelig (Singh et al., 2020). Imidlertid har den potensielle rollen til eksogen ornitinpåføring mot biotiske stressfaktorer som fytopatogener ikke blitt godt studert. Enda viktigere er det at effektene av ornitin på sykdomsresistens og de tilhørende biokjemiske og fysiologiske fenomenene forblir i stor grad uutforsket.
Å forstå kompleksiteten ved S. sclerotiorum-infeksjon av belgfrukter er viktig for utviklingen av effektive kontrollstrategier. I denne studien hadde vi som mål å identifisere den potensielle rollen til diaminet L-ornitin som en nøkkelfaktor i å forbedre forsvarsmekanismene og motstanden til belgfrukter mot Sclerotinia sclerotiorum-infeksjon. Vi antar at L-ornitin, i tillegg til å forbedre forsvarsresponsene til infiserte planter, også spiller en nøkkelrolle i å opprettholde redoksstatusen. Vi foreslår at de potensielle effektene av L-ornitin er relatert til regulering av enzymatiske og ikke-enzymatiske antioksidantforsvarsmekanismer og interferens med sopppatogenitets-/virulensfaktorer og tilhørende proteiner. Denne doble funksjonaliteten til L-ornitin gjør det til en lovende kandidat for en bærekraftig strategi for å redusere virkningen av hvitmugg og øke motstanden til vanlige belgfruktvekster mot dette potente sopppatogenet. Resultatene fra denne studien kan bidra til utviklingen av innovative, miljøvennlige metoder for å kontrollere hvitmugg og redusere dens innvirkning på belgfruktproduksjon.
I denne studien ble en mottakelig kommersiell variant av vanlig bønne, Giza 3 (Phaseolus vulgaris L. cv. Giza 3), brukt som forsøksmateriale. Friske frø ble vennligst levert av Legume Research Department, Field Crops Research Institute (FCRI), Agricultural Research Center (ARC), Egypt. Fem frø ble sådd i plastpotter (indre diameter 35 cm, dybde 50 cm) fylt med S. sclerotiorum-infisert jord under drivhusforhold (25 ± 2 °C, relativ fuktighet 75 ± 1 %, 8 timer lys/16 timer mørke). 7–10 dager etter såing (DPS) ble frøplantene tynnet ut for å bare etterlate to frøplanter med jevn vekst og tre fullt utfoldede blader i hver potte. Alle potteplanter ble vannet annenhver uke og gjødslet månedlig med anbefalt mengde for den gitte varianten.
For å fremstille en konsentrasjon på 500 mg/L av L-ornitin-diamin (også kjent som (+)-(S)-2,5-diaminopentansyre; Sigma-Aldrich, Darmstadt, Tyskland), ble 50 mg først løst opp i 100 ml sterilt destillert vann. Stamløsningen ble deretter fortynnet og brukt i påfølgende eksperimenter. Kort fortalt ble seks serier med L-ornitin-konsentrasjoner (12,5, 25, 50, 75, 100 og 125 mg/L) testet in vitro. I tillegg ble sterilt destillert vann brukt som negativ kontroll (Mock) og det kommersielt fungicidet «Rizolex-T» 50 % fuktbart pulver (toklofos-metyl 20 % + tiram 30 %; KZ-Kafr El Zayat Pesticides and Chemicals Company, Kafr El Zayat, Gharbia Governorate, Egypt) ble brukt som positiv kontroll. Det kommersielle soppmiddelet «Rizolex-T» ble testet in vitro ved fem konsentrasjoner (2, 4, 6, 8 og 10 mg/L).
Prøver av vanlige bønnestengler og -belger som viste typiske symptomer på hvitmugg (angrepsrate: 10–30 %) ble samlet inn fra kommersielle gårder. Selv om det meste av det infiserte plantematerialet ble identifisert etter art/variant (mottakelig kommersiell variant Giza 3), var andre, spesielt de som ble hentet fra lokale markeder, av ukjent art. Det innsamlede infiserte materialet ble først overflatedesinfisert med 0,5 % natriumhypoklorittløsning i 3 minutter, deretter skylt flere ganger med sterilt destillert vann og tørket med sterilt filterpapir for å fjerne overflødig vann. De infiserte organene ble deretter kuttet i små biter fra det midterste vevet (mellom friskt og infisert vev), dyrket på potetdekstroseagar (PDA)-medium og inkubert ved 25 ± 2 °C med en 12 timers lys/12 timers mørkesyklus i 5 dager for å stimulere dannelse av sklerotier. Mycelspissmetoden ble også brukt til å rense soppsisolater fra blandede eller forurensede kulturer. Det rensede soppsisolatet ble først identifisert basert på dets kulturelle morfologiske egenskaper og deretter bekreftet å være S. sclerotiorum basert på mikroskopiske trekk. Til slutt ble alle rensede isolater testet for patogenitet på den mottakelige vanlige bønnekultivaren Giza 3 for å oppfylle Kochs postulater.
I tillegg ble det mest invasive S. sclerotiorum-isolatet (isolat nr. 3) ytterligere bekreftet basert på intern transkribert spacer (ITS)-sekvensering som beskrevet av White et al., 1990; Baturo-Ciesniewska et al., 2017. Kort fortalt ble isolatene dyrket i potetdekstrosebuljong (PDB) og inkubert ved 25 ± 2 °C i 5–7 dager. Soppmycel ble deretter samlet, filtrert gjennom osteklede, vasket to ganger med sterilt vann og tørket med sterilt filterpapir. Genomisk DNA ble isolert ved bruk av Quick-DNA™ Fungal/Bacterial Miniprep Kit (Kuramae-Izioka, 1997; Atallah et al., 2022, 2024). ITS rDNA-regionen ble deretter amplifisert ved bruk av det spesifikke primerparet ITS1/ITS4 (TCCGTAGGTGAACCTGCGG TCCTCCGCTTATTGATATGC; forventet størrelse: 540 bp) (Baturo-Ciesniewska et al., 2017). De rensede PCR-produktene ble sendt inn for sekvensering (Beijing Aoke Dingsheng Biotechnology Co., Ltd.). ITS rDNA-sekvensene ble sekvensert toveis ved bruk av Sanger-sekvenseringsmetoden. De sammensatte spørresekvensene ble deretter sammenlignet med de nyeste dataene i GenBank og National Center for Biotechnology Information (NCBI, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/) ved bruk av BLASTn-programvare. Spørresekvensen ble sammenlignet med 20 andre S. sclerotiorum-stammer/isolater hentet fra de nyeste dataene i NCBI GenBank (Supplerende tabell S1) ved bruk av ClustalW i Molecular Evolutionary Genetics Analysis Package (MEGA-11; versjon 11) (Kumar et al., 2024). Evolusjonær analyse ble utført ved hjelp av metoden med maksimal sannsynlighet og den generelle tidsreversible nukleotidsubstitusjonsmodellen (Nei og Kumar, 2000). Treet med høyest log-sannsynlighet vises. Det første treet for det heuristiske søket velges ved å velge treet med høyest log-sannsynlighet mellom neighbor-joining (NJ)-treet (Kumar et al., 2024) og treet med maksimal parsimonium (MP). NJ-treet ble konstruert ved hjelp av en parvis avstandsmatrise beregnet ved hjelp av den generelle tidsreversible modellen (Nei og Kumar, 2000).
Den antibakterielle aktiviteten til L-ornitin og baktericidet «Rizolex-T» ble bestemt in vitro ved hjelp av agardiffusjonsmetoden. Metode: Ta passende mengde av stamløsningen av L-ornitin (500 mg/L) og bland den grundig med 10 ml av PDA-næringsmediet for å lage løsninger med sluttkonsentrasjoner på henholdsvis 12,5, 25, 50, 75, 100 og 125 mg/L. Fem konsentrasjoner av fungicidet «Rizolex-T» (2, 4, 6, 8 og 10 mg/L) og sterilt destillert vann ble brukt som kontroll. Etter at mediet hadde størknet, ble en nylaget mycelplugg av Sclerotinia sclerotiorum-kultur, 4 mm i diameter, overført til midten av petriskålen og dyrket ved 25 ± 2 °C til mycelet dekket hele kontrollpetriskålen, hvoretter soppveksten ble registrert. Beregn prosentvis hemming av radial vekst av S. sclerotiorum ved hjelp av ligning 1:
Eksperimentet ble gjentatt to ganger, med seks biologiske replikater for hver kontroll-/eksperimentgruppe og fem potter (to planter per potte) for hvert biologiske replikat. Hvert biologiske replikat ble analysert to ganger (to tekniske replikater) for å sikre nøyaktigheten, påliteligheten og reproduserbarheten til de eksperimentelle resultatene. I tillegg ble probit-regresjonsanalyse brukt til å beregne halvmaksimal hemmende konsentrasjon (IC50) og IC99 (Prentice, 1976).
For å evaluere potensialet til L-ornitin under drivhusforhold ble det utført to påfølgende potteeksperimenter. Kort fortalt ble pottene fylt med sterilisert leir-sandjord (3:1) og inokulert med en fersklaget kultur av S. sclerotiorum. Først ble det mest invasive isolatet av S. sclerotiorum (isolat nr. 3) dyrket ved å dele ett sklerot i to, plassere det med forsiden ned på en PDA og inkubere ved 25 °C i konstant mørke (24 timer) i 4 dager for å stimulere mycelvekst. Fire agarplugger med 5 mm diameter ble deretter tatt fra forkanten og inokulert med 100 g av en steril blanding av hvete- og riskli (1:1, v/v), og alle kolbene ble inkubert ved 25 ± 2 °C under en 12 timers lys/12 timers mørke-syklus i 5 dager for å stimulere dannelse av sklerotier. Innholdet i alle kolbene ble grundig blandet for å sikre homogenitet før jord ble tilsatt. Deretter ble 100 g av den koloniserende kliblandingen tilsatt hver potte for å sikre en konstant konsentrasjon av patogener. De inokulerte pottene ble vannet for å aktivere soppvekst og plassert i drivhusforhold i 7 dager.
Fem frø av Giza 3-sorten ble deretter sådd i hver potte. For pottene behandlet med L-ornitin og soppmiddelet Rizolex-T ble de steriliserte frøene først bløtlagt i to timer i en vandig løsning av de to forbindelsene med en endelig IC99-konsentrasjon på henholdsvis omtrent 250 mg/L og 50 mg/L, og deretter lufttørket i én time før såing. På den annen side ble frøene bløtlagt i sterilt destillert vann som en negativ kontroll. Etter 10 dager, før første vanning, ble frøplantene tynnet ut, slik at det bare var to rene frøplanter i hver potte. I tillegg, for å sikre infeksjon med S. sclerotiorum, ble bønneplantestengler på samme utviklingsstadium (10 dager) kuttet på to forskjellige steder ved hjelp av en sterilisert skalpell, og omtrent 0,5 g av den koloniserende kliblandingen ble plassert i hvert sår, etterfulgt av høy luftfuktighet for å stimulere infeksjon og sykdomsutvikling i alle inokulerte planter. Kontrollplanter ble såret på lignende måte, og en lik mengde (0,5 g) steril, ukolonisert kliblanding ble plassert i såret og holdt under høy luftfuktighet for å simulere miljøet for sykdomsutvikling og sikre konsistens mellom behandlingsgruppene.
Behandlingsmetode: Bønnefrøplanter ble vannet med 500 ml av en vandig løsning av L-ornitin (250 mg/l) eller soppmiddelet Rizolex-T (50 mg/l) ved å vanne jorden, deretter ble behandlingen gjentatt tre ganger med 10 dagers mellomrom. De placebobehandlede kontrollgruppene ble vannet med 500 ml sterilt destillert vann. Alle behandlinger ble utført under drivhusforhold (25 ± 2 °C, 75 ± 1 % relativ fuktighet og en fotoperiode på 8 timer lys/16 timer mørke). Alle potter ble vannet annenhver uke og behandlet månedlig med en balansert NPK-gjødsel (20-20-20, med 3,6 % svovel og TE-mikroelementer; Zain Seeds, Egypt) i en konsentrasjon på 3–4 g/l ved bladsprøyting i henhold til anbefalingene for den spesifikke sorten og produsentens instruksjoner. Med mindre annet er angitt, ble fullt ekspanderte modne blader (2. og 3. blad fra toppen) samlet fra hvert biologiske replikat 72 timer etter behandling (hpt), homogenisert, samlet og lagret ved -80 °C for videre analyser, inkludert, men ikke begrenset til, in situ histokjemisk lokalisering av oksidative stressindikatorer, lipidperoksidasjon, enzymatiske og ikke-enzymatiske antioksidanter og genuttrykk.
Intensiteten av hvitmugginfeksjon ble vurdert ukentlig 21 dager etter inokulering (dpi) ved hjelp av en skala fra 1–9 (tilleggstabell S2) basert på Petzoldt og Dickson-skalaen (1996) modifisert av Teran et al. (2006). Kort fortalt ble stilkene og grenene til bønneplanter undersøkt fra inokuleringspunktet for å følge progresjonen av lesjoner langs internoder og noder. Avstanden til lesjonen fra inokuleringspunktet til det lengste punktet langs stilken eller grenen ble deretter målt, og en poengsum på 1–9 ble tildelt basert på plasseringen av lesjonen, hvor (1) indikerte ingen synlig infeksjon nær inokuleringspunktet og (2–9) indikerte en gradvis økning i lesjonsstørrelse og progresjon langs noder/internoder (tilleggstabell S2). Intensiteten av hvitmugginfeksjon ble deretter konvertert til prosentandel ved hjelp av formel 2:
I tillegg ble arealet under sykdomsprogresjonskurven (AUDPC) beregnet ved hjelp av formelen (Shaner og Finney, 1977), som nylig ble tilpasset for hvitråte hos vanlig bønne (Chauhan et al., 2020) ved hjelp av ligning 3:
Der Yi = sykdommens alvorlighetsgrad ved tidspunkt ti, Yi+1 = sykdommens alvorlighetsgrad ved neste tidspunkt ti+1, ti = tidspunkt for første måling (i dager), ti+1 = tidspunkt for neste måling (i dager), n = totalt antall tidspunkter eller observasjonspunkter. Vekstparametre for bønneplanter, inkludert plantehøyde (cm), antall grener per plante og antall blader per plante, ble registrert ukentlig i 21 dager i alle biologiske replikater.
I hvert biologiske replikat ble bladprøver (andre og tredje fullt utviklede blader fra toppen) samlet inn på dag 45 etter behandling (15 dager etter siste behandling). Hvert biologiske replikat besto av fem potter (to planter per potte). Omtrent 500 mg av det knuste vevet ble brukt til ekstraksjon av fotosyntetiske pigmenter (klorofyll a, klorofyll b og karotenoider) ved bruk av 80 % aceton ved 4 °C i mørket. Etter 24 timer ble prøvene sentrifugert, og supernatanten ble samlet inn for bestemmelse av klorofyll a, klorofyll b og karotenoidinnhold kolorimetrisk ved bruk av et UV-160A spektrofotometer (Shimadzu Corporation, Japan) i henhold til metoden til (Lichtenthaler, 1987) ved å måle absorbansen ved tre forskjellige bølgelengder (A470, A646 og A663 nm). Til slutt ble innholdet av fotosyntetiske pigmenter beregnet ved bruk av følgende formler 4–6 beskrevet av Lichtenthaler (1987).
72 timer etter behandling (hpt) ble blader (andre og tredje fullt utviklede blader fra toppen) samlet inn fra hvert biologiske replikat for in situ histokjemisk lokalisering av hydrogenperoksid (H2O2) og superoksidanion (O2•−). Hvert biologiske replikat besto av fem potter (to planter per potte). Hvert biologiske replikat ble analysert i duplikat (to tekniske replikater) for å sikre metodens nøyaktighet, pålitelighet og reproduserbarhet. H2O2 og O2•− ble bestemt ved bruk av henholdsvis 0,1 % 3,3′-diaminobenzidin (DAB; Sigma-Aldrich, Darmstadt, Tyskland) eller nitroblått tetrazolium (NBT; Sigma-Aldrich, Darmstadt, Tyskland), i henhold til metodene beskrevet av Romero-Puertas et al. (2004) og Adam et al. (1989) med mindre modifikasjoner. For histokjemisk lokalisering av H2O2 in situ ble klaffene vakuuminfiltrert med 0,1 % DAB i 10 mM Tris-buffer (pH 7,8) og deretter inkubert ved romtemperatur i lys i 60 minutter. Klaffene ble bleket i 0,15 % (v/v) TCA i 4:1 (v/v) etanol:kloroform (Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies, Kairo, Egypt) og deretter eksponert for lys til de ble mørkere. På samme måte ble klaffene vakuuminfiltrert med 10 mM kaliumfosfatbuffer (pH 7,8) som inneholdt 0,1 w/v % HBT for histokjemisk lokalisering av O2•− in situ. Klaffene ble inkubert i lys ved romtemperatur i 20 minutter, deretter bleket som ovenfor, og deretter belyst til mørkeblå/fiolette flekker dukket opp. Intensiteten til den resulterende brune (som en H₂O₂-indikator) eller blåfiolette (som en O₂•−-indikator) fargen ble vurdert ved hjelp av Fiji-versjonen av bildebehandlingspakken ImageJ (http://fiji.sc; åpnet 7. mars 2024).
Malondialdehyd (MDA; som en markør for lipidperoksidasjon) ble bestemt i henhold til metoden til Du og Bramlage (1992) med små modifikasjoner. Blader fra hvert biologiske replikat (andre og tredje fullt utviklede blader fra toppen) ble samlet 72 timer etter behandling (hpt). Hvert biologiske replikat inkluderte fem potter (to planter per potte). Hvert biologiske replikat ble analysert i duplikat (to tekniske replikater) for å sikre metodens nøyaktighet, pålitelighet og reproduserbarhet. Kort fortalt ble 0,5 g malt bladvev brukt til MDA-ekstraksjon med 20 % trikloreddiksyre (TCA; MilliporeSigma, Burlington, MA, USA) som inneholdt 0,01 % butylert hydroksytoluen (BHT; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA). MDA-innholdet i supernatanten ble deretter bestemt kolorimetrisk ved å måle absorbansen ved 532 og 600 nm ved bruk av et UV-160A spektrofotometer (Shimadzu Corporation, Japan) og deretter uttrykt som nmol g−1 FW.
For vurdering av ikke-enzymatiske og enzymatiske antioksidanter ble blader (andre og tredje fullt utviklede blader fra toppen) samlet fra hvert biologiske replikat 72 timer etter behandling (hpt). Hvert biologiske replikat besto av fem potter (to planter per potte). Hver biologiske prøve ble analysert i duplikat (to tekniske prøver). To blader ble malt med flytende nitrogen og brukt direkte til bestemmelse av enzymatiske og ikke-enzymatiske antioksidanter, totale aminosyrer, prolininnhold, genuttrykk og oksalatkvantifisering.
Totalt løselig fenolisk materiale ble bestemt ved bruk av Folin-Ciocalteu-reagens (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) med små modifikasjoner av metoden beskrevet av Kahkonen et al. (1999). Kort fortalt ble omtrent 0,1 g homogenisert bladvev ekstrahert med 20 ml 80 % metanol i mørket i 24 timer, og supernatanten ble samlet opp etter sentrifugering. 0,1 ml av prøveekstraktet ble blandet med 0,5 ml Folin-Ciocalteu-reagens (10 %), ristet i 30 sekunder og latt stå i mørket i 5 minutter. Deretter ble 0,5 ml 20 % natriumkarbonatløsning (Na2CO3; Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies Company, Kairo, Egypt) tilsatt hvert rør, grundig blandet og inkubert ved romtemperatur i mørket i 1 time. Etter inkubasjon ble absorbansen til reaksjonsblandingen målt ved 765 nm ved bruk av et UV-160A-spektrofotometer (Shimadzu Corporation, Japan). Konsentrasjonen av totale løselige fenoler i prøveekstraktene ble bestemt ved hjelp av en gallussyrekalibreringskurve (Fisher Scientific, Hampton, NH, USA) og uttrykt som milligram gallussyreekvivalent per gram ferskvekt (mg GAE g-1 ferskvekt).
Totalt innhold av løselige flavonoider ble bestemt i henhold til metoden til Djeridane et al. (2006) med små modifikasjoner. Kort fortalt ble 0,3 ml av metanolekstraktet ovenfor blandet med 0,3 ml 5 % aluminiumkloridløsning (AlCl3; Fisher Scientific, Hampton, NH, USA), kraftig omrørt og deretter inkubert ved romtemperatur i 5 minutter, etterfulgt av tilsetning av 0,3 ml 10 % kaliumacetatløsning (Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies, Kairo, Egypt), grundig blandet og inkubert ved romtemperatur i 30 minutter i mørket. Etter inkubasjon ble absorbansen til reaksjonsblandingen målt ved 430 nm ved bruk av et UV-160A-spektrofotometer (Shimadzu Corporation, Japan). Konsentrasjonen av totale løselige flavonoider i prøveekstraktene ble bestemt ved bruk av en rutinkalibreringskurve (TCI America, Portland, OR, USA) og deretter uttrykt som milligram rutinekvivalent per gram ferskvekt (mg RE g-1 ferskvekt).
Det totale innholdet av frie aminosyrer i bønneblader ble bestemt ved bruk av et modifisert ninhydrinreagens (Thermo Scientific Chemicals, Waltham, MA, USA) basert på metoden foreslått av Yokoyama og Hiramatsu (2003) og modifisert av Sun et al. (2006). Kort fortalt ble 0,1 g malt vev ekstrahert med pH 5,4 buffer, og 200 μl av supernatanten ble reagert med 200 μl ninhydrin (2 %) og 200 μl pyridin (10 %; Spectrum Chemical, New Brunswick, NJ, USA), inkubert i et kokende vannbad i 30 minutter, deretter avkjølt og målt ved 580 nm ved bruk av et UV-160A spektrofotometer (Shimadzu Corporation, Japan). Prolin ble derimot bestemt ved Bates-metoden (Bates et al., 1973). Prolin ble ekstrahert med 3 % sulfosalicylsyre (Thermo Scientific Chemicals, Waltham, MA, USA), og etter sentrifugering ble 0,5 ml av supernatanten blandet med 1 ml iseddik (Fisher Scientific, Hampton, NH, USA) og ninhydrinreagens, inkubert ved 90 °C i 45 minutter, avkjølt og målt ved 520 nm med samme spektrofotometer som ovenfor. Totalt antall frie aminosyrer og prolin i bladekstraktene ble bestemt ved bruk av henholdsvis glysin- og prolinkalibreringskurver (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), og uttrykt som mg/g ferskvekt.
For å bestemme den enzymatiske aktiviteten til antioksidantenzymer ble omtrent 500 mg homogenisert vev ekstrahert med 3 ml 50 mM Tris-buffer (pH 7,8) som inneholdt 1 mM EDTA-Na2 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) og 7,5 % polyvinylpyrrolidon (PVP; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), sentrifugert ved 10 000 × g i 20 minutter under kjøling (4 °C), og supernatanten (rå enzymekstrakt) ble samlet opp (El-Nagar et al., 2023; Osman et al., 2023). Katalase (CAT) ble deretter reagert med 2 ml 0,1 M natriumfosfatbuffer (pH 6,5; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) og 100 μl 269 mM H2O2-løsning for å bestemme dens enzymatiske aktivitet i henhold til metoden til Aebi (1984) med små modifikasjoner (El-Nagar et al., 2023; Osman et al., 2023). Guaiacol-avhengig peroksidase (POX) enzymatisk aktivitet ble bestemt ved hjelp av metoden til Harrach et al. (2009). (2008) med mindre modifikasjoner (El-Nagar et al., 2023; Osman et al., 2023), og den enzymatiske aktiviteten til polyfenoloksidase (PPO) ble bestemt etter reaksjon med 2,2 ml 100 mM natriumfosfatbuffer (pH 6,0), 100 μl guaiacol (TCI chemicals, Portland, OR, USA) og 100 μl 12 mM H2O2. Metoden ble noe modifisert fra (El-Nagar et al., 2023; Osman et al., 2023). Analysen ble utført etter reaksjon med 3 ml katekolløsning (Thermo Scientific Chemicals, Waltham, MA, USA) (0,01 M) ferskt fremstilt i 0,1 M fosfatbuffer (pH 6,0). CAT-aktivitet ble målt ved å overvåke dekomponeringen av H2O2 ved 240 nm (A240), POX-aktivitet ble målt ved å overvåke økningen i absorbans ved 436 nm (A436), og PPO-aktivitet ble målt ved å registrere absorbansfluktuasjoner ved 495 nm (A495) hvert 30. sekund i 3 minutter ved bruk av et UV-160A-spektrofotometer (Shimadzu, Japan).
Realtids-RT-PCR ble brukt til å detektere transkriptnivåene av tre antioksidantrelaterte gener, inkludert peroksisomal katalase (PvCAT1; GenBank-tiltredelsesnr. KF033307.1), superoksiddismutase (PvSOD; GenBank-tiltredelsesnr. XM_068639556.1) og glutationreduktase (PvGR; GenBank-tiltredelsesnr. KY195009.1), i bønneblader (det andre og tredje fullt utviklede bladet fra toppen) 72 timer etter siste behandling. Kort fortalt ble RNA isolert ved bruk av Simply P Total RNA Extraction Kit (kat.nr. BSC52S1; BioFlux, Biori Technology, Kina) i henhold til produsentens protokoll. Deretter ble cDNA syntetisert ved bruk av TOP script™ cDNA Synthesis Kit i henhold til produsentens instruksjoner. Primersekvensene til de tre genene ovenfor er listet opp i tilleggstabell S3. PvActin-3 (GenBank-tiltredelsesnummer: XM_068616709.1) ble brukt som husholdningsgen, og den relative genuttrykkelsen ble beregnet ved hjelp av 2-ΔΔCT-metoden (Livak og Schmittgen, 2001). Aktinstabilitet under biotisk stress (ukompatibel interaksjon mellom vanlige belgfrukter og antraknosesoppen Colletotrichum lindemuthianum) og abiotisk stress (tørke, saltinnhold, lav temperatur) ble demonstrert (Borges et al., 2012).
Vi utførte først en genomomfattende in silico-analyse av oksaloacetatacetylhydrolase (OAH)-proteiner i S. sclerotiorum ved bruk av protein-protein BLAST-verktøyet (BLASTp 2.15.0+) (Altschul et al., 1997, 2005). Kort fortalt brukte vi OAH fra Aspergillus fijiensis CBS 313.89 (AfOAH; takside: 1191702; GenBank-tiltredelsesnummer XP_040799428.1; 342 aminosyrer) og Penicillium lagena (PlOAH; takside: 94218; GenBank-tiltredelsesnummer XP_056833920.1; 316 aminosyrer) som spørresekvenser for å kartlegge det homologe proteinet i S. sclerotiorum (takside: 5180). BLASTp ble utført mot de nyeste tilgjengelige S. sclerotiorum-genomdataene i GenBank på nettstedet til National Center for Biotechnology Information (NCBI), http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/.
I tillegg ble det predikerte OAH-genet fra S. sclerotiorum (SsOAH) og den evolusjonære analysen og det fylogenetiske treet til AfOAH fra A. fijiensis CBS 313.89 og PlOAH fra P. lagena utledet ved bruk av sannsynlighetsmetoden i MEGA11 (Tamura et al., 2021) og den JTT-matrisebaserte modellen (Jones et al., 1992). Det fylogenetiske treet ble kombinert med multippel justeringsanalyse av proteinsekvenser av alle predikerte OAH-gener (SsOAH) fra S. sclerotiorum og spørresekvensen ved bruk av Constraint-Based Alignment Tool (COBALT; https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/cobalt/re_cobalt.cgi) (Papadopoulos og Agarwala, 2007). I tillegg ble de best matchende aminosyresekvensene til SsOAH fra S. sclerotiorum justert med spørresekvensene (AfOAH og PlOAH) (Larkin et al., 2007) ved bruk av ClustalW (http://www.genome.jp/tools-bin/clustalw), og konserverte regioner i justeringen ble visualisert ved bruk av ESPript-verktøyet (versjon 3.0; https://espript.ibcp.fr/ESPript/ESPript/index.php).
Videre ble de predikerte funksjonelle representative domenene og konserverte setene til S. sclerotiorum SsOAH interaktivt klassifisert i forskjellige familier ved hjelp av InterPro-verktøyet (https://www.ebi.ac.uk/interpro/) (Blum et al., 2021). Til slutt ble tredimensjonal (3D) strukturmodellering av den predikerte S. sclerotiorum SsOAH utført ved hjelp av Protein Homology/Analogy Recognition Engine (Phyre2-server versjon 2.0; http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/~phyre2/html/page.cgi?id=index) (Kelley et al., 2015) og validert ved hjelp av SWISS-MODEL-serveren (https://swissmodel.expasy.org/) (Biasini et al., 2014). De predikerte tredimensjonale strukturene (PDB-format) ble interaktivt visualisert ved hjelp av UCSF-Chimera-pakken (versjon 1.15; https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/) (Pettersen et al., 2004).
Kvantitativ sanntidsfluorescens-PCR ble brukt til å bestemme transkripsjonsnivået av oksaloacetatacetylhydrolase (SsOAH; GenBank-tiltredelsesnummer: XM_001590428.1) i myceliet til Sclerotinia sclerotiorum. Kort fortalt ble S. sclerotiorum inokulert i en kolbe som inneholdt PDB og plassert i en risteinkubator (modell: I2400, New Brunswick Scientific Co., Edison, NJ, USA) ved 25 ± 2 °C i 24 timer ved 150 rpm og i konstant mørke (24 timer) for å stimulere mycelvekst. Deretter ble cellene behandlet med L-ornitin og fungicidet Rizolex-T ved endelige IC50-konsentrasjoner (henholdsvis omtrent 40 og 3,2 mg/L) og deretter dyrket i ytterligere 24 timer under de samme forholdene. Etter inkubasjon ble kulturene sentrifugert ved 2500 o/min i 5 minutter, og supernatanten (soppmycel) ble samlet inn for genekspresjonsanalyse. Tilsvarende ble soppmycel samlet inn 0, 24, 48, 72, 96 og 120 timer etter infeksjon fra infiserte planter som hadde dannet hvitmugg og bomullsmycel på overflaten av infisert vev. RNA ble ekstrahert fra soppmycelet, og deretter ble cDNA syntetisert som beskrevet ovenfor. Primersekvensene for SsOAH er listet opp i tilleggstabell S3. SsActin (GenBank-tiltredelsesnummer: XM_001589919.1) ble brukt som husholdningsgen, og relativ genekspresjon ble beregnet ved hjelp av 2-ΔΔCT-metoden (Livak og Schmittgen, 2001).
Oksalsyre ble bestemt i potetdekstrosebuljong (PDB) og planteprøver som inneholdt sopppatogenet Sclerotinia sclerotiorum i henhold til metoden til Xu og Zhang (2000) med små modifikasjoner. Kort fortalt ble S. sclerotiorum-isolater inokulert i kolber som inneholdt PDB og deretter dyrket i en risteinkubator (modell I2400, New Brunswick Scientific Co., Edison, NJ, USA) ved 150 rpm ved 25 ± 2 °C i 3–5 dager i konstant mørke (24 timer) for å stimulere mycelvekst. Etter inkubasjon ble soppkulturen først filtrert gjennom Whatman #1 filterpapir og deretter sentrifugert ved 2500 rpm i 5 minutter for å fjerne gjenværende mycel. Supernatanten ble samlet og lagret ved 4 °C for videre kvantitativ bestemmelse av oksalat. For fremstilling av planteprøver ble omtrent 0,1 g plantevevsfragmenter ekstrahert tre ganger med destillert vann (2 ml hver gang). Prøvene ble deretter sentrifugert ved 2500 o/min i 5 minutter, supernatanten ble tørrfiltrert gjennom Whatman nr. 1 filterpapir og samlet opp for videre analyse.
For kvantitativ analyse av oksalsyre ble reaksjonsblandingen fremstilt i et glasskorket rør i følgende rekkefølge: 0,2 ml prøve (eller PDB-kulturfiltrat eller oksalsyrestandardløsning), 0,11 ml bromfenolblått (BPB, 1 mM; Fisher Chemical, Pittsburgh, PA, USA), 0,198 ml 1 M svovelsyre (H2SO4; Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies, Cairo, Egypt) og 0,176 ml 100 mM kaliumdikromat (K2Cr2O7; TCI chemicals, Portland, OR, USA), og deretter ble løsningen fortynnet til 4,8 ml med destillert vann, kraftig blandet og umiddelbart plassert i et 60 °C vannbad. Etter 10 minutter ble reaksjonen stoppet ved å tilsette 0,5 ml natriumhydroksidløsning (NaOH; 0,75 M). Absorbansen (A600) til reaksjonsblandingen ble målt ved 600 nm ved bruk av et UV-160-spektrofotometer (Shimadzu Corporation, Japan). PDB og destillert vann ble brukt som kontroller for kvantifisering av henholdsvis kulturfiltrater og planteprøver. Oksalsyrekonsentrasjonene i kulturfiltratene, uttrykt som mikrogram oksalsyre per milliliter PDB-medium (μg.mL⁻¹), og i bladekstraktene, uttrykt som mikrogram oksalsyre per gram ferskvekt (μg.g⁻¹ FW), ble bestemt ved bruk av en oksalsyrekalibreringskurve (Thermo Fisher Scientific Chemicals, Waltham, MA, USA).
Gjennom hele studien ble alle eksperimentene designet i et fullstendig randomisert design (CRD) med seks biologiske replikater per behandling og fem potter per biologisk replikat (to planter per potte) med mindre annet er angitt. Biologiske replikater ble analysert i duplikat (to tekniske replikater). Tekniske replikater ble brukt for å kontrollere reproduserbarheten av det samme eksperimentet, men ble ikke brukt i den statistiske analysen for å unngå falske replikater. Dataene ble statistisk analysert ved hjelp av variansanalyse (ANOVA) etterfulgt av Tukey-Kramer Honesty Significant Difference (HSD) test (p ≤ 0,05). For in vitro-eksperimenter ble IC50- og IC99-verdier beregnet ved hjelp av probit-modellen, og 95 % konfidensintervaller ble beregnet.
Totalt fire isolater ble samlet inn fra forskjellige soyabønneåkre i El Ghabiya-guvernementet i Egypt. På PDA-medium produserte alle isolatene kremhvitt mycel som raskt ble bomullshvitt (figur 1A) og deretter beige eller brunt på sklerotiumstadiet. Sklerotier er vanligvis tette, svarte, sfæriske eller uregelmessige i form, 5,2 til 7,7 mm lange og 3,4 til 5,3 mm i diameter (figur 1B). Selv om fire isolater utviklet et marginalt mønster av sklerotier i kanten av kulturmediet etter 10–12 dagers inkubasjon ved 25 ± 2 °C (figur 1A), var antallet sklerotier per plate signifikant forskjellig mellom dem (P < 0,001), med isolat 3 som hadde det høyeste antallet sklerotier (32,33 ± 1,53 sklerotier per plate; figur 1C). På samme måte produserte isolat nr. 3 mer oksalsyre i PDB enn andre isolater (3,33 ± 0,49 μg.mL−1; fig. 1D). Isolat nr. 3 viste typiske morfologiske og mikroskopiske egenskaper for den fytopatogene soppen Sclerotinia sclerotiorum. For eksempel vokste kolonier av isolat nr. 3 raskt på PDA, var kremhvite (figur 1A), omvendt beige eller lys laksegulbrune, og kremte 6–7 dager ved 25 ± 2 °C for å dekke overflaten av en plate med 9 cm diameter fullstendig. Basert på de ovennevnte morfologiske og mikroskopiske egenskapene ble isolat nr. 3 identifisert som Sclerotinia sclerotiorum.
Figur 1. Kjennetegn og patogenitet av S. sclerotiorum-isolater fra vanlige belgfrukter. (A) Mycelvekst av fire S. sclerotiorum-isolater på PDA-medium, (B) sklerotier av fire S. sclerotiorum-isolater, (C) antall sklerotier (per plate), (D) oksalsyresekresjon på PDB-medium (μg.mL−1), og (E) sykdomsgrad (%) av fire S. sclerotiorum-isolater på mottakelig kommersiell belgfruktkultivar Giza 3 under drivhusforhold. Verdiene representerer gjennomsnitt ± SD av fem biologiske replikater (n = 5). Ulike bokstaver indikerer statistisk signifikante forskjeller mellom behandlingene (p < 0,05). (F–H) Typiske hvitmuggsymptomer dukket opp på henholdsvis overjordiske stilker og silikker 10 dager etter inokulering med isolat nr. 3 (dpi). (I) Evolusjonær analyse av den interne transkriberte spacer-regionen (ITS) til S. sclerotiorum-isolat nr. 3 ble utført ved hjelp av sannsynlighetsmetoden og sammenlignet med 20 referanseisolater/stammer hentet fra National Center for Biotechnology Information (NCBI)-databasen (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Tallene over klyngelinjene indikerer regiondekningen (%), og tallene under klyngelinjene indikerer forgreningslengden.
For å bekrefte patogeniteten ble fire innhentede S. sclerotiorum-isolater brukt til å inokulere den mottakelige kommersielle bønnekultivaren Giza 3 under drivhusforhold, noe som er i samsvar med Kochs postulater (fig. 1E). Selv om alle de innhentede soppisolatene var patogene og kunne infisere den grønne bønnen (cv. Giza 3), noe som forårsaket typiske hvitmuggsymptomer på alle overjordiske deler (fig. 1F), spesielt på stilkene (fig. 1G) og belgene (fig. 1H) 10 dager etter inokulering (dpi), var isolat 3 det mest aggressive isolatet i to uavhengige eksperimenter. Isolat 3 hadde den høyeste sykdomsgraden (%) på bønneplanter (henholdsvis 24,0 ± 4,0, 58,0 ± 2,0 og 76,7 ± 3,1 7, 14 og 21 dager etter infeksjon; figur 1F).
Identifiseringen av det mest invasive S. sclerotiorum-isolatet nr. 3 ble ytterligere bekreftet basert på intern transkribert spacer (ITS)-sekvensering (figur 1I). Fylogenetisk analyse mellom isolat nr. 3 og 20 referanseisolater/stammer viste høy likhet (>99 %) mellom dem. Det er verdt å merke seg at S. sclerotiorum-isolatet nr. 3 (533 bp) har høy likhet med det amerikanske S. sclerotiorum-isolatet LPM36 isolert fra tørre ertefrø (GenBank-tiltredelsesnummer MK896659.1; 540 bp) og det kinesiske S. sclerotiorum-isolatet YKY211 (GenBank-tiltredelsesnummer OR206374.1; 548 bp), som forårsaker stilkråte på fiolett (Matthiola incana), som alle er gruppert separat øverst i dendrogrammet (figur 1I). Den nye sekvensen er blitt lagret i NCBI-databasen og har fått navnet «Sclerotinia sclerotiorum – isolat YN-25» (GenBank-tiltredelsesnummer PV202792). Det kan sees at isolat 3 er det mest invasive isolatet; derfor ble dette isolatet valgt for studier i alle påfølgende eksperimenter.
Den antibakterielle aktiviteten til diaminen L-ornitin (Sigma-Aldrich, Darmstadt, Tyskland) ved forskjellige konsentrasjoner (12,5, 25, 50, 75, 100 og 125 mg/L) mot S. sclerotiorum-isolat 3 ble undersøkt in vitro. Det er verdt å merke seg at L-ornitin utøvde en antibakteriell effekt og gradvis hemmet den radiale veksten av S. sclerotiorum-hyfer på en doseavhengig måte (figur 2A, B). Ved den høyeste testede konsentrasjonen (125 mg/L) viste L-ornitin den høyeste hemmingsraten for mycelvekst (99,62 ± 0,27 %; figur 2B), som tilsvarte det kommersielle fungicidet Rizolex-T (hemmingsrate 99,45 ± 0,39 %; figur 2C) ved den høyeste testede konsentrasjonen (10 mg/L), noe som indikerer lignende effekt.
Figur 2. In vitro antibakteriell aktivitet av L-ornitin mot Sclerotinia sclerotiorum. (A) Sammenligning av den antibakterielle aktiviteten til forskjellige konsentrasjoner av L-ornitin mot S. sclerotiorum med det kommersielle fungicidet Rizolex-T (10 mg/L). (B, C) Inhiberingsrate (%) av S. sclerotiorum mycelvekst etter behandling med forskjellige konsentrasjoner av L-ornitin (12,5, 25, 50, 75, 100 og 125 mg/L) eller Rizolex-T (2, 4, 6, 8 og 10 mg/L). Verdiene representerer gjennomsnitt ± SD av fem biologiske replikater (n = 5). Ulike bokstaver angir statistiske forskjeller mellom behandlingene (p < 0,05). (D, E) Probit-modellregresjonsanalyse av L-ornitin og det kommersielle fungicidet Rizolex-T, henholdsvis. Regresjonslinjen for probitmodellen vises som en heltrukket blå linje, og konfidensintervallet (95 %) vises som en stiplet rød linje.
I tillegg ble det utført probit-regresjonsanalyse, og de tilsvarende plottene er vist i tabell 1 og figur 2D og E. Kort fortalt indikerte den akseptable helningsverdien (y = 2,92x − 4,67) og tilhørende signifikant statistikk (Cox & Snell R2 = 0,3709, Nagelkerke R2 = 0,4998 og p < 0,0001; figur 2D) for L-ornitin en forbedret soppdrepende aktivitet mot S. sclerotiorum sammenlignet med det kommersielle soppmiddelet Rizolex-T (y = 1,96x − 0,99, Cox & Snell R2 = 0,1242, Nagelkerke R2 = 0,1708 og p < 0,0001) (tabell 1).
Tabell 1. Verdier for halvmaksimal hemmende konsentrasjon (IC50) og IC99 (mg/l) av L-ornitin og det kommersielle soppmiddelet «Rizolex-T» mot S. sclerotiorum.
Totalt sett reduserte L-ornitin (250 mg/L) utviklingen og alvorlighetsgraden av hvitmugg signifikant på behandlede vanlige bønneplanter sammenlignet med ubehandlede S. sclerotiorum-infiserte planter (kontroll; figur 3A). Kort sagt, selv om sykdomsalderen hos ubehandlede infiserte kontrollplanter gradvis økte (52,67 ± 1,53, 83,21 ± 2,61 og 92,33 ± 3,06 %), reduserte L-ornitin sykdomsalderen (%) signifikant gjennom hele eksperimentet (8,97 ± 0,15, 18,00 ± 1,00 og 26,36 ± 3,07) henholdsvis 7, 14 og 21 dager etter behandling (dpt) (figur 3A). På samme måte, da S. sclerotiorum-infiserte bønneplanter ble behandlet med 250 mg/L L-ornitin, reduserte arealet under sykdomsprogresjonskurven (AUDPC) fra 1274,33 ± 33,13 i den ubehandlede kontrollen til 281,03 ± 7,95, som var litt lavere enn for den positive kontrollen 50 mg/L Rizolex-T fungicid (183,61 ± 7,71; fig. 3B). Den samme trenden ble observert i det andre eksperimentet.
Fig. 3. Effekt av eksogen påføring av L-ornitin på utviklingen av hvit råte hos vanlig bønne forårsaket av Sclerotinia sclerotiorum under drivhusforhold. (A) Sykdomsprogresjonskurve for hvitmugg hos vanlig bønne etter behandling med 250 mg/L L-ornitin. (B) Arealet under sykdomsprogresjonskurven (AUDPC) for hvitmugg hos vanlig bønne etter behandling med L-ornitin. Verdier representerer gjennomsnitt ± SD av fem biologiske replikater (n = 5). Ulike bokstaver angir statistisk signifikante forskjeller mellom behandlingene (p < 0,05).
Eksogen påføring av 250 mg/L L-ornitin økte gradvis plantehøyden (fig. 4A), antall grener per plante (fig. 4B) og antall blader per plante (fig. 4C) etter 42 dager. Mens det kommersielle fungicidet Rizolex-T (50 mg/L) hadde størst effekt på alle ernæringsparametrene som ble studert, hadde eksogen påføring av 250 mg/L L-ornitin den nest største effekten sammenlignet med ubehandlede kontrollgrupper (fig. 4A–C). På den annen side hadde L-ornitinbehandling ingen signifikant effekt på innholdet av fotosyntetiske pigmenter klorofyll a (fig. 4D) og klorofyll b (fig. 4E), men økte det totale karotenoidinnholdet noe (0,56 ± 0,03 mg/g fr vekt) sammenlignet med negativ kontroll (0,44 ± 0,02 mg/g fr vekt) og positiv kontroll (0,46 ± 0,02 mg/g fr vekt; fig. 4F). Samlet sett indikerer disse resultatene at L-ornitin ikke er fytotoksisk for behandlede belgfrukter og til og med kan stimulere veksten deres.
Fig. 4. Effekt av eksogen L-ornitinpåføring på vekstegenskaper og fotosyntetiske pigmenter hos bønneblader infisert med Sclerotinia sclerotiorum under drivhusforhold. (A) Plantehøyde (cm), (B) Antall grener per plante, (C) Antall blader per plante, (D) Klorofyll a-innhold (mg g-1 fr vekt), (E) Klorofyll b-innhold (mg g-1 fr vekt), (F) Totalt karotenoidinnhold (mg g-1 fr vekt). Verdiene er gjennomsnitt ± SD av fem biologiske replikater (n = 5). Ulike bokstaver indikerer statistisk signifikante forskjeller mellom behandlingene (p < 0,05).
In situ histokjemisk lokalisering av reaktive oksygenforbindelser (ROS; uttrykt som hydrogenperoksid [H2O2]) og frie radikaler (uttrykt som superoksidanioner [O2•−]) viste at eksogen påføring av L-ornitin (250 mg/L) betydelig reduserte akkumuleringen av H2O2 (96,05 ± 5,33 nmol.g−1 FW; Fig. 5A) og O2•− (32,69 ± 8,56 nmol.g−1 FW; Fig. 5B) sammenlignet med akkumuleringen av både ubehandlede infiserte planter (henholdsvis 173,31 ± 12,06 og 149,35 ± 7,94 nmol.g−1 FW) og planter behandlet med 50 mg/L av det kommersielle fungicidet Rizolex-T (henholdsvis 170,12 ± 9,50 og 157,00 ± 7,81 nmol.g−1 fr wt) etter 72 timer. Høye nivåer av H2O2 og O2•− akkumulerte under hpt (fig. 5A, B). Tilsvarende viste TCA-basert malondialdehyd (MDA)-analyse at S. sclerotiorum-infiserte bønneplanter akkumulerte høyere nivåer av MDA (113,48 ± 10,02 nmol.g fr wt) i bladene sine (fig. 5C). Eksogen påføring av L-ornitin reduserte imidlertid lipidperoksidasjonen betydelig, noe som fremgår av reduksjonen i MDA-innhold i behandlede planter (33,08 ± 4,00 nmol.g fr wt).
Fig. 5. Effekt av eksogen L-ornitin-påføring på viktige markører for oksidativt stress og ikke-enzymatiske antioksidantforsvarsmekanismer i bønneblader infisert med S. sclerotiorum 72 timer etter infeksjon under drivhusforhold. (A) Hydrogenperoksid (H2O2; nmol g−1 FW) ved 72 hpt, (B) superoksidanion (O2•−; nmol g−1 FW) ved 72 hpt, (C) malondialdehyd (MDA; nmol g−1 FW) ved 72 hpt, (D) totale løselige fenoler (mg GAE g−1 FW) ved 72 hpt, (E) totale løselige flavonoider (mg RE g−1 FW) ved 72 hpt, (F) totale frie aminosyrer (mg g−1 FW) ved 72 hpt, og (G) prolininnhold (mg g−1 FW) ved 72 hpt. Verdiene representerer gjennomsnitt ± standardavvik (gjennomsnitt ± SD) for 5 biologiske replikater (n = 5). Ulike bokstaver indikerer statistisk signifikante forskjeller mellom behandlingene (p < 0,05).