Ulike planteforsvarsteorier gir viktig teoretisk veiledning for å forklare mønstrene i plantespesialisert metabolisme, men deres viktigste prediksjoner gjenstår å bli testet. Her brukte vi objektiv tandem-massespektrometri (MS/MS)-analyse for systematisk å utforske metabolomet til tobakkssvekkede stammer fra individuelle planter til populasjoner og nært beslektede arter, og behandlet et stort antall massespektrometriske trekkteorier basert på sammensatte spektre i informasjonsrammeverket for å teste de viktigste prediksjonene for optimalt forsvar (OD) og bevegelige mål (MT)-teorier. Informasjonskomponenten i plantemetabolomikk er i samsvar med OD-teorien, men motsier hovedprediksjonen i MT-teorien om metabolomikkdynamikk forårsaket av planteetere. Fra mikro- til makro-evolusjonær skala ble jasmonatsignalet identifisert som den viktigste determinanten for OD, mens etylensignalet ga finjustering av den planteeterspesifikke responsen kommentert av MS/MS-molekylnettverket.
Spesielle metabolitter med ulike strukturer er de viktigste deltakerne i planters tilpasning til miljøet, spesielt i forsvaret mot fiender (1). Den fantastiske diversifiseringen av den spesielle metabolismen som finnes i planter har stimulert flere tiår med grundig forskning på dens mange aspekter av økologiske funksjoner, og har dannet en lang liste med planteforsvarsteorier, som er den evolusjonære og økologiske utviklingen av plante-insekt-interaksjoner. Empirisk forskning gir viktig veiledning (2). Disse planteforsvarsteoriene fulgte imidlertid ikke den normative veien til hypotetisk deduktiv resonnement, der viktige forutsigelser var på samme analysenivå (3) og ble testet eksperimentelt for å fremme neste syklus av teoretisk utvikling (4). Tekniske begrensninger begrenser datainnsamlingen til spesifikke metabolske kategorier og utelukker omfattende analyse av spesialiserte metabolitter, og forhindrer dermed sammenligninger mellom kategorier som er essensielle for teoretisk utvikling (5). Mangelen på omfattende metabolomikkdata og en felles valuta for å sammenligne prosesseringsflyten i det metabolske rommet mellom ulike plantegrupper hindrer feltets vitenskapelige modenhet.
Den nyeste utviklingen innen tandem massespektrometri (MS/MS) metabolomikk kan omfattende karakterisere de metabolske endringene innenfor og mellom arter i en gitt systemklade, og kan kombineres med beregningsmetoder for å beregne den strukturelle likheten mellom disse komplekse blandingene. Forkunnskaper om kjemi (5). Kombinasjonen av avanserte teknologier innen analyse og databehandling gir et nødvendig rammeverk for langsiktig testing av mange forutsigelser gjort av de økologiske og evolusjonære teoriene om metabolsk mangfold. Shannon (6) introduserte informasjonsteori for første gang i sin banebrytende artikkel i 1948, og la grunnlaget for matematisk analyse av informasjon, som har blitt brukt på mange andre felt enn den opprinnelige anvendelsen. Innen genomikk har informasjonsteori blitt brukt med hell for å kvantifisere sekvenskonservativ informasjon (7). Innen transkriptomikkforskning analyserer informasjonsteori de generelle endringene i transkriptomet (8). I tidligere forskning anvendte vi det statistiske rammeverket for informasjonsteori på metabolomikk for å beskrive den metabolske ekspertisen på vevsnivået i planter (9). Her kombinerer vi den MS/MS-baserte arbeidsflyten med det statistiske rammeverket for informasjonsteori, karakterisert av det metabolske mangfoldet i den felles valutaen, for å sammenligne de viktigste prediksjonene i planteforsvarsteorien for metabolomet indusert av planteetere.
De teoretiske rammeverkene for planteforsvar er vanligvis gjensidig inkluderende og kan deles inn i to kategorier: de som prøver å forklare fordelingen av plantespesifikke metabolitter basert på forsvarsfunksjoner, som optimalt forsvar (OD) (10), bevegelig mål (MT) (11) og utseende (12) teori, mens andre søker mekaniske forklaringer på hvordan endringer i ressurstilgjengelighet påvirker plantevekst og akkumulering av spesialiserte metabolitter, som karbon: næringsbalansehypotesen (13), vekstratehypotesen (14) og vekst- og differensieringslikevektshypotesen (15). De to settene med teorier er på forskjellige analysenivåer (4). Imidlertid dominerer to teorier som involverer defensive funksjoner på funksjonsnivå samtalen om planters konstitutive og induserbare forsvar: OD-teorien, som antar at planter investerer i sitt dyre kjemiske forsvar bare når det er nødvendig, for eksempel når de inntas. Når et gressdyr angriper, tildeles derfor forbindelsen med en defensiv funksjon i henhold til muligheten for fremtidig angrep (10); MT-hypotesen antyder at det ikke finnes noen akse for retningsbestemt metabolittendring, men at metabolitten endres tilfeldig, og dermed skaper muligheten for å hindre det metabolske «bevegelsesmålet» til angripende planteetere. Med andre ord gir disse to teoriene motsatte forutsigelser om den metabolske ombyggingen som skjer etter angrep fra planteetere: forholdet mellom den ensrettede akkumuleringen av metabolitter med defensiv funksjon (OD) og ikke-rettede metabolske endringer (MT) (11).
OD- og MT-hypotesene involverer ikke bare de induserte endringene i metabolomet, men også de økologiske og evolusjonære konsekvensene av akkumuleringen av disse metabolittene, slik som de adaptive kostnadene og fordelene ved disse metabolske endringene i et spesifikt økologisk miljø (16). Selv om begge hypotesene anerkjenner den defensive funksjonen til spesialiserte metabolitter, som kan være dyre eller ikke, ligger den viktigste prediksjonen som skiller OD- og MT-hypotesene i retningen til de induserte metabolske endringene. Prediksjonen av OD-teorien har fått mest eksperimentell oppmerksomhet så langt. Disse testene inkluderer studiet av de direkte eller indirekte forsvarsfunksjonene til forskjellige vev av spesifikke forbindelser i veksthus og naturlige forhold, samt endringer i planteutviklingsstadiet (17-19). På grunn av mangelen på en arbeidsflyt og et statistisk rammeverk for global omfattende analyse av metabolsk mangfold hos enhver organisme, gjenstår imidlertid den viktigste forskjellsprediksjonen mellom de to teoriene (det vil si retningen på metabolske endringer) å bli testet. Her gir vi en slik analyse.
En av de viktigste egenskapene til plantespesifikke metabolitter er deres ekstreme strukturelle mangfold på alle nivåer fra enkeltplanter og populasjoner til lignende arter (20). Mange kvantitative endringer i spesialiserte metabolitter kan observeres på populasjonsnivå, mens sterke kvalitative forskjeller vanligvis opprettholdes på artsnivå (20). Derfor er plantemetabolsk mangfold hovedaspektet ved funksjonelt mangfold, noe som gjenspeiler tilpasningsevnen til forskjellige nisjer, spesielt de nisjene med forskjellige invasjonsmuligheter av spesielle insekter og vanlige planteetere (21). Siden Fraenkels (22) banebrytende artikkel om årsakene til eksistensen av plantespesifikke metabolitter, har interaksjoner med forskjellige insekter blitt ansett som viktig seleksjonspress, og disse interaksjonene antas å ha formet planter under evolusjonen. Metabolsk vei (23). Interartsforskjeller i mangfoldet av spesialiserte metabolitter kan også gjenspeile den fysiologiske balansen forbundet med konstitutivt og induserbart planteforsvar mot planteetende strategier, ettersom de to artene ofte er negativt korrelert med hverandre (24). Selv om det kan være fordelaktig å opprettholde et godt forsvar til enhver tid, gir rettidige metabolske endringer knyttet til forsvar klare fordeler ved at planter kan allokere verdifulle ressurser til andre fysiologiske investeringer (19, 24), og unngå behovet for symbiose. Tilleggsskade (25). I tillegg kan disse omorganiseringene av spesialiserte metabolitter forårsaket av insektplanteetere føre til destruktiv fordeling i populasjonen (26), og kan gjenspeile direkte avlesninger av betydelige naturlige endringer i jasmonsyre (JA)-signalet, som kan opprettholdes i populasjonen. Høye og lave JA-signaler er avveininger mellom forsvar mot planteetere og konkurranse med spesifikke arter (27). I tillegg vil spesialiserte metabolittbiosynteseveier gjennomgå raskt tap og transformasjon under evolusjonen, noe som resulterer i ujevn metabolsk fordeling blant nært beslektede arter (28). Disse polymorfismene kan raskt etableres som respons på endrede planteetermønstre (29), noe som betyr at fluktuasjonen i planteetersamfunn er en nøkkelfaktor som driver metabolsk heterogenitet.
Her løste vi spesifikt følgende problemer. (I) Hvordan omkonfigurerer det planteetende insektet plantemetabolomet? (Ii) Hva er de viktigste informasjonskomponentene i metabolsk plastisitet som kan kvantifiseres for å teste prediksjonene i langsiktig forsvarsteori? (Iii) Hvorvidt plantemetabolomet skal omprogrammeres på en måte som er unik for angriperen, i så fall hvilken rolle spiller plantehormon i å skreddersy en spesifikk metabolsk respons, og hvilke metabolitter bidrar til artsspesifisiteten i forsvaret? (Iv) Siden prediksjonene gjort av mange forsvarsteorier kan utvides på tvers av alle nivåer av biologisk vev, spurte vi hvor konsistent den metabolske responsen som forårsakes er fra intern sammenligning til sammenligning mellom arter? For dette formålet har vi systematisk studert bladmetabolomet til tobakksnikotin, som er en økologisk modellplante med rik spesialisert metabolisme, og er effektiv mot larvene til to stedegne planteetere, Lepidoptera Datura (Ms) (svært aggressiv, hovedsakelig spist). På Solanaceae og Spodoptera littoralis (Sl) er bomullsbladorm en slags "slekt", med vertsplanter fra Solanaceae og andre verter fra andre slekter og familier planteføde. Vi analyserte MS/MS metabolomikkspekteret og ekstraherte statistiske deskriptorer fra informasjonsteori for å sammenligne OD- og MT-teorier. Laget spesifisitetskart for å avdekke identiteten til viktige metabolitter. Analysen ble utvidet til den stedegne populasjonen av N. nasi og nært beslektede tobakksarter for å analysere kovariansen mellom plantehormonsignalering og OD-induksjon ytterligere.
For å få et overordnet kart over plastisiteten og strukturen til bladmetabolomet hos planteetende tobakk, brukte vi en tidligere utviklet analyse- og beregningsarbeidsflyt for å samle inn og dekonvolvere høyoppløselige datauavhengige MS/MS-spektre fra planteekstrakter (9). Denne udifferensierte metoden (kalt MS/MS) kan konstruere ikke-redundante forbindelsesspektre, som deretter kan brukes til alle analyser på forbindelsesnivå beskrevet her. Disse dekonvolverte plantemetabolittene er av forskjellige typer, bestående av hundrevis til tusenvis av metabolitter (omtrent 500-1000 s/MS/MS her). Her vurderer vi metabolsk plastisitet innenfor rammen av informasjonsteori, og kvantifiserer mangfoldet og profesjonaliteten til metabolomet basert på Shannon-entropien til den metabolske frekvensfordelingen. Ved å bruke den tidligere implementerte formelen (8) beregnet vi et sett med indikatorer som kan brukes til å kvantifisere metabolommangfold (Hj-indikator), spesialisering av metabolsk profil (δj-indikator) og metabolsk spesifisitet til en enkelt metabolitt (Si-indikator). I tillegg brukte vi Relative Distance Plasticity Index (RDPI) for å kvantifisere metabolominduserbarheten hos planteetere (figur 1A) (30). Innenfor dette statistiske rammeverket behandler vi MS/MS-spekteret som den grunnleggende informasjonsenheten, og behandler den relative forekomsten av MS/MS til et frekvensfordelingskart, og bruker deretter Shannon-entropi for å estimere metabolomdiversitet ut fra det. Metabolomspesialiseringen måles ved den gjennomsnittlige spesifisiteten til et enkelt MS/MS-spektrum. Derfor transformeres økningen i forekomsten av noen MS/MS-klasser etter planteeterinduksjon til spektral induserbarhet, RDPI og spesialisering, det vil si økningen i δj-indeksen, fordi mer spesialiserte metabolitter produseres og en høy Si-indeks produseres. Senkingen av Hj-diversitetsindeksen gjenspeiler at enten antallet genererte MS/MS reduseres, eller at profilfrekvensfordelingen endres i en mindre ensartet retning, samtidig som den totale usikkerheten reduseres. Gjennom Si-indeksberegningen er det mulig å fremheve hvilke MS/MS som er indusert av visse planteetere, tvert imot hvilke MS/MS som ikke reagerer på induksjonen, noe som er en nøkkelindikator for å skille mellom MT- og OD-prediksjon.
(A) Statistiske deskriptorer brukt for planteetende (H1 til Hx) MS/MS-datainduserbarhet (RDPI), diversitet (Hj-indeks), spesialisering (δj-indeks) og metabolittspesifisitet (Si-indeks). En økning i spesialiseringsgraden (δj) indikerer at det i gjennomsnitt vil bli produsert flere planteetende spesifikke metabolitter, mens en reduksjon i diversitet (Hj) indikerer en reduksjon i produksjonen av metabolitter eller ujevn fordeling av metabolitter i distribusjonskartet. Si-verdien vurderer om metabolitten er spesifikk for en gitt tilstand (her planteetende) eller omvendt opprettholdes på samme nivå. (B) Konseptuelt diagram av forsvarsteoriprediksjon ved bruk av informasjonsteoriaksen. OD-teorien forutsier at planteeterangrep vil øke forsvarsmetabolitter, og dermed øke δj. Samtidig avtar Hj fordi profilen omorganiseres mot redusert usikkerhet i metabolsk informasjon. MT-teorien forutsier at angrep fra planteetere vil forårsake ikke-retningsbestemte endringer i metabolomet, og dermed øke Hj som en indikator på økt usikkerhet i metabolsk informasjon og forårsake en tilfeldig fordeling av Si. Vi foreslo også en blandet modell, den beste MT, der noen metabolitter med høyere defensive verdier vil være spesielt økte (høy Si-verdi), mens andre viser tilfeldige responser (lavere Si-verdi).
Ved å bruke informasjonsteori-deskriptorer tolker vi OD-teorien til å forutsi at herbivorinduserte spesielle metabolittendringer i en ikke-indusert konstitutiv tilstand vil føre til (i) en økning i metabolsk spesifisitet (Si-indeks) som driver metabonomisk spesifisitet (δj-indeks), økning av visse spesielle metabolittgrupper med høyere forsvarsverdi, og (ii) reduksjon av metabolomdiversitet (Hj-indeks) på grunn av endringen i metabolsk frekvensfordeling til mer leptin-kroppsfordeling. På nivået av en enkelt metabolitt forventes en ordnet Si-fordeling, hvor metabolitten vil øke Si-verdien i henhold til dens forsvarsverdi (figur 1B). På denne måten forklarer vi MT-teorien til å forutsi at eksitasjon vil føre til (i) ikke-retningsbestemte endringer i metabolitter som resulterer i en reduksjon i δj-indeksen, og (ii) en økning i Hj-indeksen på grunn av en økning i metabolsk usikkerhet. Eller tilfeldighet, som kan kvantifiseres ved Shannon-entropi i form av generalisert mangfold. Når det gjelder den metabolske sammensetningen, vil MT-teorien forutsi den tilfeldige fordelingen av Si. Tatt i betraktning at visse metabolitter er under spesifikke forhold under spesifikke forhold, og andre forhold ikke er under spesifikke forhold, og deres forsvarsverdi avhenger av miljøet, foreslo vi også en blandet forsvarsmodell, der δj og Hj er fordelt i to langs Si-økningen i alle retninger. Bare visse metabolittgrupper, som har høyere forsvarsverdier, vil øke Si spesielt, mens andre vil ha en tilfeldig fordeling (figur 1B).
For å teste den omdefinerte forsvarsteoriprediksjonen på aksen til informasjonsteoribeskrivelsen, fremkalte vi ekspert- (Ms) eller generalist- (Sl) planteeterlarver på bladene til Nepenthes pallens (figur 2A). Ved hjelp av MS/MS-analyse hentet vi 599 ikke-redundante MS/MS-spektre (datafil S1) fra metanolekstrakter av bladvev samlet inn etter larvefôring. Bruk av RDPI-, Hj- og δj-indekser for å visualisere rekonfigurasjonen av informasjonsinnhold i MS/MS-konfigurasjonsfiler avslører interessante mønstre (figur 2B). Den overordnede trenden er at, som beskrevet av informasjonsbeskrivelsen, når larvene fortsetter å spise blader, øker graden av all metabolsk reorganisering over tid: 72 timer etter at planteeteren spiser, øker RDPI betydelig. Sammenlignet med den uskadede kontrollen var Hj betydelig redusert, noe som skyldtes den økte graden av spesialisering av den metabolske profilen, som ble kvantifisert av δj-indeksen. Denne tilsynelatende trenden er i samsvar med prediksjonene i OD-teorien, men er inkonsistent med hovedprediksjonene i MT-teorien, som mener at tilfeldige (ikke-retningsbestemte) endringer i metabolittnivåer brukes som en defensiv kamuflasje (figur 1B). Selv om innholdet av oral sekresjon (OS) og spiseatferden til disse to planteeterne er forskjellige, resulterte deres direkte fôring i lignende endringer i retningene til Hj og δj i løpet av 24-timers og 72-timers høsteperioder. Den eneste forskjellen oppsto ved 72 timer med RDPI. Sammenlignet med det som ble forårsaket av Ms-fôring, var den totale metabolismen indusert av Sl-fôring høyere.
(A) Ekspertdesign: Vanlige gris- (S1) eller ekspert- (Ms) planteetere fôres med avsaltede blader fra muggeplanter, mens for simulert planteetning brukes OS (W + OSM) til Ms (W + OSM) til å håndtere punktering av standardiserte bladposisjoner i såret. S1 (W + OSSl) larver eller vann (W + W). Kontrollen (C) er et uskadet blad. (B) Induserbarhetsindeks (RDPI sammenlignet med kontrolldiagrammet), diversitetsindeks (Hj-indeks) og spesialiseringindeks (δj-indeks) beregnet for det spesielle metabolittkartet (599 MS/MS; datafil S1). Stjerner indikerer signifikante forskjeller mellom direkte planteeterfôring og kontrollgruppen (Student's t-test med paret t-test, *P < 0,05 og ***P < 0,001). ns, ikke viktig. (C) Tidsoppløsningsindeks for hovedspekteret (blå boks, aminosyre, organisk syre og sukker; datafil S2) og spesialmetabolittspekteret (rød boks 443 MS/MS; datafil S1) etter simulert planteetende behandling. Fargebåndet refererer til 95 % konfidensintervall. Stjernen indikerer den signifikante forskjellen mellom behandlingen og kontrollen [kvadratisk variansanalyse (ANOVA), etterfulgt av Tukeys ærlig signifikante forskjell (HSD) for post hoc multiple sammenligninger, *P < 0,05, **P < 0,01 og *** P < 0,001]. (D) Spesialisering av spredningsdiagrammer og spesielle metabolittprofiler (gjentatte prøver med forskjellige behandlinger).
For å undersøke om den herbivorinduserte ombyggingen på metabolomnivå gjenspeiles i endringene i nivået av individuelle metabolitter, fokuserte vi først på metabolittene som tidligere er studert i bladene til Nepenthes pallens med påvist herbivorresistens. Fenoliske amider er hydroksycinnamamid-polyaminkonjugater som akkumuleres under herbivorisk prosess hos insekter og er kjent for å redusere insekters ytelse (32). Vi søkte etter forløperne til den tilsvarende MS/MS og plottet deres kumulative kinetiske kurver (figur S1). Ikke overraskende er fenolderivater som ikke er direkte involvert i forsvaret mot herbivorer, som klorogensyre (CGA) og rutin, nedregulert etter herbivorisk behandling. I motsetning til dette kan herbivorer gjøre fenolamider svært potente. Kontinuerlig fôring av de to herbivorene resulterte i nesten samme eksitasjonsspektrum av fenolamider, og dette mønsteret var spesielt tydelig for de novo syntese av fenolamider. Det samme fenomenet vil bli observert når man utforsker 17-hydroksygeranylnonandiol-diterpenglykosider (17-HGL-DTG-er)-signalveien, som produserer et stort antall asykliske diterpener med effektive anti-herbivore funksjoner (33), hvorav Ms-fôring med Sl utløste en lignende uttrykkprofil (figur S1)).
Den mulige ulempen med direkte fôringsforsøk med planteetere er forskjellen i bladkonsumeringshastighet og fôringstid for planteetere, noe som gjør det vanskelig å eliminere de planteeterspesifikke effektene forårsaket av sår og planteetere. For å bedre løse planteeterartsspesifisiteten til den induserte bladmetabolske responsen, simulerte vi fôringen av Ms- og Sl-larver ved umiddelbart å påføre den nylig innsamlede OS (OSM og OSS1) på standardpunkturen W med konsistente bladposisjoner. Denne prosedyren kalles W + OS-behandling, og den standardiserer induksjonen ved å presist time starten på responsen fremkalt av planteeteren uten å forårsake forstyrrende effekter av forskjeller i hastighet eller mengde vevstap (figur 2A) (34). Ved å bruke MS/MS-analyse- og beregningspipeline hentet vi 443 MS/MS-spektre (datafil S1), som overlappet med spektrene som tidligere ble satt sammen fra direkte fôringsforsøk. Informasjonsteorianalysen av dette MS/MS-datasettet viste at omprogrammeringen av bladspesialiserte metabolomer ved å simulere planteetere viste OS-spesifikke induksjoner (figur 2C). Spesielt, sammenlignet med OSS1-behandling, forårsaket OSM en forsterkning av metabolomspesialiseringen etter 4 timer. Det er verdt å merke seg at sammenlignet med det eksperimentelle datasettet med direkte planteeterfôring, visualisertes den metabolske kinetikken i todimensjonalt rom ved bruk av Hj og δj som koordinater, og retningen til metabolomspesialiseringen som respons på simulert planteeterbehandling over tid økte konsistent (figur 2D). Samtidig kvantifiserte vi innholdet av aminosyrer, organiske syrer og sukkerarter (datafil S2) for å undersøke om denne målrettede økningen i metabolomekspertise skyldes omkonfigurering av sentral karbonmetabolisme som respons på simulerte planteetere (figur S2). For å bedre forklare dette mønsteret overvåket vi ytterligere den metabolske akkumuleringskinetikken til de tidligere omtalte fenolamid- og 17-HGL-DTG-veiene. Den OS-spesifikke induksjonen hos planteetere transformeres til et differensiell omorganiseringsmønster innenfor fenolamidmetabolismen (figur S3). Fenoliske amider som inneholder kumarin- og koffeoylenheter induseres fortrinnsvis av OSS1, mens OSM-er utløser en spesifikk induksjon av ferulylkonjugater. For 17-HGL-DTG-signalveien ble det påvist differensiell OS-induksjon ved nedstrøms malonylering og dimalonyleringsprodukter (figur S3).
Deretter studerte vi OS-indusert transkriptomplastisitet ved hjelp av tidsforløps-mikroarray-datasettet, som simulerer bruken av OSM-er for å behandle bladene på rosettplanteblader hos planteetere. Prøvetakingskinetikken overlapper i utgangspunktet med kinetikken som ble brukt i denne metabolomikkstudien (35). Sammenlignet med metabolomrekonfigurasjonen der metabolsk plastisitet økes spesielt over tid, observerer vi forbigående transkripsjonsutbrudd i blader indusert av Ms, der transkriptominduserbarhet (RDPI) og spesialisering (δj) er på 1. Det var en betydelig økning i timer og diversitet (Hj) på dette tidspunktet, uttrykket av BMP1 var betydelig redusert, etterfulgt av avslapning av transkriptomspesialisering (figur S4). Metabolske genfamilier (som P450, glykosyltransferase og BAHD-acyltransferase) deltar i prosessen med å sette sammen spesielle metabolitter fra strukturelle enheter avledet fra primær metabolisme, etter den nevnte tidlige høyspesialiseringsmodellen. Som en casestudie ble fenylalaninveien analysert. Analysen bekreftet at kjernegenene i fenolamidmetabolismen er sterkt OS-indusert hos planteetere sammenlignet med utiltrukket planter, og at uttrykksmønstrene deres er tett på linje. Transkripsjonsfaktoren MYB8 og strukturgenene PAL1, PAL2, C4H og 4CL i oppstrømsdelen av denne signalveien viste tidlig initiering av transkripsjon. Acyltransferaser som spiller en rolle i den endelige sammensetningen av fenolamid, slik som AT1, DH29 og CV86, viser et langvarig oppreguleringsmønster (figur S4). Observasjonene ovenfor indikerer at den tidlige initieringen av transkriptomspesialisering og den senere forbedringen av metabolomikkspesialisering er en koblet modus, noe som kan skyldes det synkrone reguleringssystemet som initierer en kraftig forsvarsrespons.
Rekonfigurasjonen i plantehormonsignalering fungerer som et regulatorisk lag som integrerer planteetende informasjon for å omprogrammere plantenes fysiologi. Etter planteetersimuleringen målte vi den kumulative dynamikken til viktige plantehormonkategorier og visualiserte den tidsmessige samekspresjonen mellom dem [Pearson-korrelasjonskoeffisient (PCC) > 0,4] (figur 3A). Som forventet er plantehormoner relatert til biosyntese koblet innenfor plantehormon-samekspresjonsnettverket. I tillegg er metabolsk spesifisitet (Si-indeks) kartlagt til dette nettverket for å fremheve plantehormonene indusert av forskjellige behandlinger. To hovedområder med planteetende spesifikk respons er tegnet: det ene er i JA-klyngen, hvor JA (dens biologisk aktive form JA-Ile) og andre JA-derivater viser den høyeste Si-poengsummen; det andre er etylen (ET). Gibberellin viste bare en moderat økning i planteetende spesifisitet, mens andre plantehormoner, som cytokinin, auxin og abscisinsyre, hadde lav induksjonsspesifisitet for planteetere. Sammenlignet med bruk av W + W alene, kan amplifiseringen av toppverdien av JA-derivater gjennom OS-applikasjonen (W + OS) i utgangspunktet transformeres til en sterk spesifikk indikator på JA-er. Uventet nok er det kjent at OSM og OSS1 med ulikt elicitorinnhold forårsaker lignende akkumulering av JA og JA-Ile. I motsetning til OSS1 induseres OSM spesifikt og sterkt av OSM-er, mens OSS1 ikke forsterker responsen på basale sår (figur 3B).
(A) Koekspresjonsnettverksanalyse basert på PCC-beregning av simulering av herbivorindusert plantehormonakkumuleringskinetikk. Noden representerer et enkelt plantehormon, og størrelsen på noden representerer Si-indeksen spesifikk for plantehormonet mellom behandlinger. (B) Akkumulering av JA, JA-Ile og ET i blader forårsaket av forskjellige behandlinger indikert med forskjellige farger: aprikos, W + OSM; blå, W + OSSl; svart, W + W; grå, C (kontroll). Stjerner indikerer signifikante forskjeller mellom behandling og kontroll (toveis ANOVA etterfulgt av Tukey HSD post hoc multippel sammenligning, *** P <0,001). Informasjonsteorianalyse av (C)697 MS/MS (datafil S1) i JA-biosyntese og svekket persepsjonsspektrum (irAOC og irCOI1) og (D)585 MS/MS (datafil S1) i ETR1 med svekket ET-signal. To simulerte herbivorbehandlinger utløste plantelinjer og tomme vehikkel (EV) kontrollplanter. Stjerner indikerer signifikante forskjeller mellom W+OS-behandling og uskadet kontroll (toveis ANOVA etterfulgt av Tukey HSD post hoc multippel sammenligning, *P < 0,05, **P < 0,01 og ***P < 0,001). (E) Spredte grafer av spredt motstand mot spesialisering. Fargene representerer forskjellige genmodifiserte stammer; symbolene representerer forskjellige behandlingsmetoder: trekant, W + OSS1; rektangel, W + OSM; sirkel C
Deretter bruker vi en genetisk modifisert stamme av svekket Nepenthes (irCOI1 og sETR1) i nøkkeltrinnene i JA- og ET-biosyntese (irAOC og irACO) og persepsjon (irCOI1 og sETR1) for å analysere metabolismen til disse to plantehormonene på planteetere. Det relative bidraget fra omprogrammering. I samsvar med tidligere eksperimenter bekreftet vi induksjonen av herbivor-OS i tomme bærerplanter (EV) (figur 3, C til D) og den generelle nedgangen i Hj-indeksen forårsaket av OSM, mens δj-indeksen økte. Responsen er mer uttalt enn responsen utløst av OSS1. En tolinjers graf som bruker Hj og δj som koordinater viser den spesifikke dereguleringen (figur 3E). Den mest åpenbare trenden er at i stammer som mangler JA-signal, er metabolomdiversiteten og spesialiseringsendringene forårsaket av planteetere nesten fullstendig eliminert (figur 3C). I motsetning til dette demper den stille ET-persepsjonen i sETR1-planter, selv om den totale effekten på endringer i planteetende metabolisme er mye lavere enn for JA-signalering, forskjellen i Hj- og δj-indekser mellom OSM- og OSS1-eksitasjoner (figur 3D og figur S5). Dette indikerer at i tillegg til kjernefunksjonen til JA-signaltransduksjon, fungerer ET-signaltransduksjon også som en finjustering av den artsspesifikke metabolske responsen til planteetere. I samsvar med denne finjusteringsfunksjonen var det ingen endring i den totale metabolominduserbarheten i sETR1-planter. På den annen side, sammenlignet med sETR1-planter, induserte irACO-planter lignende totale amplituder av metabolske endringer forårsaket av planteetere, men viste signifikant forskjellige Hj- og δj-score mellom OSM- og OSS1-utfordringer (figur S5).
For å identifisere spesialiserte metabolitter som har viktige bidrag til den artsspesifikke responsen hos planteetere og finjustere produksjonen deres gjennom ET-signaler, brukte vi den tidligere utviklede strukturelle MS/MS-metoden. Denne metoden er avhengig av bi-klyngemetoden for å utlede den metabolske familien på nytt fra MS/MS-fragmenter [normalisert prikkprodukt (NDP)] og likhetspoeng basert på nøytralt tap (NL). MS/MS-datasettet konstruert gjennom analyse av ET-transgene linjer produserte 585 MS/MS (datafil S1), som ble løst opp ved å gruppere dem i syv hoved-MS/MS-moduler (M) (figur 4A). Noen av disse modulene er tettpakket med tidligere karakteriserte spesielle metabolitter: for eksempel er M1, M2, M3, M4 og M7 rike på forskjellige fenolderivater (M1), flavonoidglykosider (M2), acylsukkerarter (M3 og M4) og 17-HGL-DTG (M7). I tillegg beregnes den metabolske spesifikke informasjonen (Si-indeksen) for en enkelt metabolitt i hver modul, og dens Si-fordeling kan sees intuitivt. Kort sagt, MS/MS-spektre som viser høy herbivori og genotypespesifisitet er karakterisert av høye Si-verdier, og kurtosestatistikk indikerer fordelingen av pels på høyre halehjørne. En slik mager kolloidfordeling ble oppdaget i M1, der fenolamid viste den høyeste Si-fraksjonen (figur 4B). Den tidligere nevnte herbivorøse induserbare 17-HGL-DTG i M7 viste en moderat Si-score, noe som indikerer en moderat grad av differensiell regulering mellom de to OS-typene. I motsetning til dette er de fleste konstitutivt produserte spesialiserte metabolitter, som rutin, CGA og acylsukker, blant de laveste Si-scorene. For å bedre utforske den strukturelle kompleksiteten og Si-fordelingen mellom spesielle metabolitter, ble et molekylært nettverk konstruert for hver modul (figur 4B). En viktig prediksjon i OD-teorien (oppsummert i figur 1B) er at omorganiseringen av spesielle metabolitter etter planteeting bør føre til enveisendringer i metabolitter med høy forsvarsverdi, spesielt ved å øke deres spesifisitet (i motsetning til tilfeldig fordeling) Modus) Defensiv metabolitt predikert av MT-teorien. De fleste fenolderivatene akkumulert i M1 er funksjonelt relatert til nedgangen i insektytelse (32). Ved sammenligning av Si-verdiene i M1-metabolittene mellom de induserte bladene og de konstituerende bladene til EV-kontrollplantene etter 24 timer, observerte vi at den metabolske spesifisiteten til mange metabolitter etter planteetende insekter har en betydelig økende trend (figur 4C). Den spesifikke økningen i Si-verdi ble bare oppdaget i defensive fenolamider, men ingen økning i Si-verdi ble oppdaget i andre fenoler og ukjente metabolitter som sameksisterte i denne modulen. Dette er en spesialisert modell, som er relatert til OD-teorien. De viktigste prediksjonene av metabolske endringer forårsaket av planteetere er konsistente. For å teste om denne særegenheten ved fenolamidspekteret ble indusert av OS-spesifikk ET, plottet vi metabolittens Si-indeks og forårsaket en differensiell ekspresjonsverdi mellom OSM og OSS1 i EV- og sETR1-genotypene (figur 4D). I sETR1 ble den fenamidinduserte forskjellen mellom OSM og OSS1 kraftig redusert. Bi-klyngemetoden ble også brukt på MS/MS-data samlet inn i stammer med utilstrekkelig JA til å utlede de viktigste MS/MS-modulene relatert til JA-regulert metabolsk spesialisering (figur S6).
(A) Klyngeresultatene for 585 MS/MS basert på delt fragment (NDP-likhet) og delt nøytralt tap (NL-likhet) resulterer i at modulen (M) er konsistent med den kjente forbindelsesfamilien, eller ved ukjent eller dårlig metabolisert metabolittsammensetning. Ved siden av hver modul vises den metabolittspesifikke (Si) fordelingen (MS/MS). (B) Modulært molekylært nettverk: Noder representerer MS/MS og kanter, NDP (rød) og NL (blå) MS/MS-score (grenseverdi, > 0,6). Den graderte metabolittspesifisitetsindeksen (Si) farget basert på modulen (venstre) og kartlagt til det molekylære nettverket (høyre). (C) Modul M1 av EV-plante i konstitutiv (kontroll) og indusert tilstand (simulert herbivor) etter 24 timer: molekylært nettverksdiagram (Si-verdien er nodestørrelsen, defensiv fenolamid er uthevet i blått). (D) M1-molekylært nettverksdiagram for spektrumlinjen sETR1 med svekket EV- og ET-persepsjon: fenolforbindelsen representert av den grønne sirkelnoden, og den signifikante forskjellen (P-verdi) mellom W + OSM- og W + OSS1-behandlinger som nodestørrelse. CP, N-kaffeoyl-tyrosin; CS, N-kaffeoyl-spermidin; FP, N-ferulsyreester-urinsyre; FS, N-ferulyl-spermidin; CoP, N', N“-kumarolyl-tyrosin; DCS, N', N”-dikaffeoyl-spermidin; CFS, N', N”-kaffeoyl, feruloyl-spermidin; Lycium barbarum i ulvebær-Son; Nick. O-AS, O-acylsukker.
Vi utvidet analysen videre fra en enkelt attenuert Nepenthes-genotype til naturlige populasjoner, hvor sterke intraspesifikke endringer i planteetende JA-nivåer og spesifikke metabolittnivåer tidligere er beskrevet i naturlige populasjoner (26). Bruk dette datasettet til å dekke 43 kimplasmer. Disse kimplasmene består av 123 plantearter fra N. pallens. Disse plantene ble tatt fra frø samlet i forskjellige naturlige habitater i Utah, Nevada, Arizona og California (figur S7), og vi beregnet metabolomdiversiteten (her kalt populasjonsnivå) β-diversitet) og spesialiseringen forårsaket av OSM. I samsvar med tidligere studier observerte vi et bredt spekter av metabolske endringer langs Hj- og δj-aksene, noe som indikerer at kimplasmer har signifikante forskjeller i plastisiteten til deres metabolske responser på planteetere (figur S7). Denne organiseringen minner om tidligere observasjoner om det dynamiske området for JA-endringer forårsaket av planteetere, og har opprettholdt en svært høy verdi i en enkelt populasjon (26, 36). Ved å bruke JA og JA-Ile til å teste den generelle nivåkorrelasjonen mellom Hj og δj, fant vi at det er en signifikant positiv korrelasjon mellom JA og metabolomets β-diversitets- og spesialiseringsindeks (figur S7). Dette antyder at den herbivorinduserte heterogeniteten i JA-induksjon oppdaget på populasjonsnivå kan skyldes viktige metabolske polymorfismer forårsaket av seleksjon fra insektherbivorer.
Tidligere studier har vist at tobakkstyper varierer sterkt i type og relativ avhengighet av induserte og konstitutive metabolske forsvar. Det antas at disse endringene i anti-herbivore signaltransduksjon og forsvarsevner reguleres av insektpopulasjonspress, plantelivssyklus og forsvarsproduksjonskostnader i nisjen der en gitt art vokser. Vi studerte konsistensen av bladmetabolomombygging indusert av planteetere av seks Nicotiana-arter som er hjemmehørende i Nord-Amerika og Sør-Amerika. Disse artene er nært beslektet med Nepenthes Nord-Amerika, nemlig Nicolas Bociflo. La, N. nicotinis, Nicotiana n. attenuated grass, Nicotiana tabacum, lineær tobakk, tobakk (Nicotiana spegazzinii) og tobakksbladtobakk (Nicotiana obtusifolia) (figur 5A) (37). Seks av disse artene, inkludert den velkarakteriserte arten N. please, er ettårige planter av petuniakladen, og obtusifolia N. er stauder av søsterkladen Trigonophyllae (38). Deretter ble W + W-, W + OSM- og W + OSS1-induksjon utført på disse syv artene for å studere den metabolske omorganiseringen av insekters ernæring på artsnivå.
(A) Et bootstrap fylogenetisk tre basert på maksimal sannsynlighet [for syntese av nukleær glutamin (38)] og den geografiske fordelingen av syv nært beslektede Nicotiana-arter (forskjellige farger) (37). (B) Et spredningsplott av spesialisert mangfold for de metabolske profilene til syv Nicotiana-arter (939 MS/MS; datafil S1). På artsnivå er metabolommangfoldet negativt korrelert med graden av spesialisering. Analysen av artsnivåkorrelasjonen mellom metabolsk mangfold og spesialisering og JA-akkumulering er vist i figur 2. S9. Farge, forskjellige typer; trekant, W + OSS1; rektangel, W + OSM; (C) Nicotiana JA- og JA-Ile-dynamikk er rangert i henhold til OS-eksitasjonsamplitude (toveis ANOVA og Tukey HSD etter multippel sammenligning, * P <0,05, ** P <0,01 og * ** For sammenligning av W + OS og W + W, P <0,001). Boksplott av (D) mangfold og (E) spesialisering av hver art etter simulering av planteetende og metyl JA (MeJA). Stjernen indikerer den signifikante forskjellen mellom W + OS og W + W eller lanolin pluss W (Lan + W) eller Lan pluss MeJA (Lan + MeJa) og Lan-kontroll (toveis variansanalyse, etterfulgt av Tukeys HSD post hoc multippel sammenligning, *P < 0,05, **P < 0,01 og ***P < 0,001).
Ved å bruke den doble klyngemetoden identifiserte vi 9 moduler med 939 MS/MS (datafil S1). Sammensetningen av MS/MS rekonfigurert av forskjellige behandlinger varierer sterkt mellom forskjellige moduler mellom arter (figur S8). Visualisering av Hj (her referert til som artsnivå-γ-mangfold) og δj avslører at forskjellige arter aggregerer til svært forskjellige grupper i det metabolske rommet, hvor artsnivåinndeling vanligvis er mer fremtredende enn eksitasjon. Med unntak av N. linear og N. obliquus viser de et bredt dynamisk spekter av induksjonseffekter (figur 5B). I motsetning til dette har arter som N. purpurea og N. obtusifolia en mindre åpenbar metabolsk respons på behandling, men metabolomet er mer mangfoldig. Den artsspesifikke fordelingen av den induserte metabolske responsen resulterte i en signifikant negativ korrelasjon mellom spesialisering og gamma-mangfold (PCC = -0,46, P = 4,9 × 10-8). OS-induserte endringer i JA-nivåer er positivt korrelert med metabolomspesialisering, og negativt korrelert med det metabolske gamma-mangfoldet som hver art viser (figur 5B og figur S9). Det er verdt å merke seg at artene som i dagligtale omtales som "signalrespons"-arter i figur 5C, som Nepenthes nematoder, Nepenthes nepenthes, Nepenthes acute og Nepenthes attenuated, forårsaket signifikante tegn etter 30 minutter. De nylige OS-spesifikke JA- og JA-Ile-utbruddene, mens andre bakterier kalt "signal-ikke-responsive", som Nepenthes mills, Nepenthes powdery og N. obtusifolia, bare viser JA-Ile Edge-induksjon uten noen OS-spesifisitet (figur 5C). På metabolsk nivå, som nevnt ovenfor, for svekket Nepenthes, viste de signalresponsive stoffene OS-spesifisitet og økte δj betydelig, samtidig som de reduserte Hj. Denne OS-spesifikke priming-effekten ble ikke påvist i arter klassifisert som ikke-reaktive signalarter (figur 5, D og E). OS-spesifikke metabolitter deles oftere mellom signalresponsive arter, og disse signalklyngene klynger seg sammen med arter med svakere signalresponser, mens arter med svakere signalresponser viser mindre gjensidig avhengighet (figur S8). Dette resultatet indikerer at den OS-spesifikke induksjonen av JA-er og den OS-spesifikke rekonfigurasjonen av nedstrømsmetabolomet er koblet på artsnivå.
Deretter brukte vi en lanolinpasta som inneholder metyl JA (MeJA) for å behandle planter for å undersøke om disse koblingsmodusene er begrenset av tilgjengeligheten av JA påført av eksogen JA, som vil være i cytoplasmaet til planter. Rask deesterifisering er JA. Vi fant den samme trenden med gradvis endring fra signalresponsive arter til signal-ikke-responsive arter forårsaket av kontinuerlig tilførsel av JA (figur 5, D og E). Kort sagt, MeJA-behandling omprogrammerte metabolomene til lineære nematoder, N. obliquus, N. aquaticus, N. pallens og N. mikimotoi, noe som resulterte i en betydelig økning i δj og en reduksjon i Hj. N. purpurea viste bare en økning i δj, men ikke Hj. N. obtusifolia, som tidligere har vist seg å akkumulere ekstremt lave nivåer av JA-er, responderer også dårlig på MeJA-behandling når det gjelder metabolomrekonfigurasjon. Disse resultatene indikerer at JA-produksjon eller signaltransduksjon er fysiologisk begrenset hos signal-ikke-responsive arter. For å teste denne hypotesen studerte vi de fire artene (N. pallens, N. mills, N. pink og N. microphylla) indusert av W + W, W + OSM og W + OSS1 transkriptom (39). I samsvar med mønsteret for metabolomombygging er artene godt adskilt i transkriptomrommet, hvorav N. attenuated viste den høyeste OS-induserte RDPI, mens N. gracilis hadde den laveste (figur 6A). Det ble imidlertid funnet at transkriptomdiversiteten indusert av N. oblonga var den laveste blant de fire artene, i motsetning til den høyeste metabonomiske diversiteten av N. oblonga som tidligere er vist hos syv arter. Tidligere studier har vist at et sett med gener relatert til tidlige forsvarssignaler, inkludert JA-signaler, forklarer spesifisiteten til tidlige forsvarsresponser indusert av herbivorrelaterte elicitorer hos Nicotiana-arter (39). Sammenligning av JA-signalveiene mellom disse fire artene avdekket et interessant mønster (figur 6B). De fleste gener i denne signalveien, som AOC, OPR3, ACX og COI1, viste relativt høye induksjonsnivåer hos disse fire artene. Imidlertid omdanner et nøkkelgen, JAR4, JA til sin biologisk aktive form av JA-Ile-akkumulerte transkripter, og transkripsjonsnivået er svært lavt, spesielt i N. mills, Nepenthes pieris og N. microphylla. I tillegg ble bare transkriptet til et annet gen AOS ikke påvist i N. bifidum. Disse endringene i genuttrykk kan være ansvarlige for de ekstreme fenotypene indusert av den lave JA-produksjonen hos signalanergiske arter og induksjonen av N. gracilis.
(A) Informasjonsteoretisk analyse av reprogrammering av tidlige transkripsjonsresponser hos fire nært beslektede tobakksarter tatt prøver av 30 minutter etter induksjon av planteeting. RDPI beregnes ved å sammenligne bladene indusert av planteeterens OS med sårkontrollen. Fargene indikerer forskjellige arter, og symbolene indikerer forskjellige behandlingsmetoder. (B) Analyse av genuttrykk i JA-signalveier blant fire arter. Den forenklede JA-banen vises ved siden av boksplottet. Ulike farger indikerer forskjellige behandlingsmetoder. Stjernen indikerer at det er en signifikant forskjell mellom W + OS-behandlingen og W + W-kontrollen (for Student's t-test for parvise forskjeller, *P < 0,05, **P < 0,01 og ***P < 0,001). OPDA, 12-oksofytodiensyre; OPC-8: 0,3-okso-2(2′(Z)-pentenyl)-cyklopentan-1-oktansyre.
I den siste delen studerte vi hvordan insektartsspesifikk ombygging av metabolomet til forskjellige plantearter kan være resistent mot planteetere. Tidligere forskning har lagt vekt på Nicotiana-slekten. Deres resistens mot Ms og larver varierer sterkt (40). Her studerte vi sammenhengen mellom denne modellen og deres metabolske plastisitet. Ved å bruke de fire tobakksartene ovenfor, og ved å teste korrelasjonen mellom mangfoldet og spesialiseringen av metabolomet forårsaket av planteetere og plantenes resistens mot Ms og Sl, fant vi at resistens, mangfold og spesialisering mot generalisten Sl All er positivt korrelert, mens korrelasjonen mellom resistens mot ekspert-Sl og spesialisering er svak, og korrelasjonen med mangfold er ikke signifikant (figur S10). Når det gjelder S1-resistens, hadde både den svekkede N. chinensis og N. gracilis, som tidligere har vist seg å ha både JA-signaltransduksjonsnivåer og metabolomplastisitet, svært forskjellige responser på planteeterinduksjon, og de viste også lignende høy resistens.
I løpet av de siste seksti årene har planteforsvarsteori gitt et teoretisk rammeverk, basert på hvilket forskere har spådd et betydelig antall evolusjons- og funksjonsmønstre for plantespesialiserte metabolitter. De fleste av disse teoriene følger ikke den normale prosedyren med sterke slutninger (41). De foreslår nøkkelprediksjoner (3) på samme analysenivå. Når testing av nøkkelprediksjoner tillater analyse av spesifikke teorier, vil dette gjøre Feltet beveger seg fremover. Støttes, men avvis andre (42). I stedet gir den nye teorien prediksjoner på forskjellige analysenivåer og legger til et nytt lag med beskrivende hensyn (42). Imidlertid kan de to teoriene som foreslås på funksjonsnivå, MT og OD, lett forklares som viktige prediksjoner av spesialiserte metabolske endringer forårsaket av planteetere: OD-teorien mener at endringer i spesialisert metabolsk "rom" er svært retningsbestemte. MT-teorien mener at disse endringene vil være ikke-retningsbestemte og tilfeldig plassert i det metabolske rommet, og har en tendens til å ha metabolitter med høy forsvarsverdi. Tidligere undersøkelser av OD- og MT-prediksjoner har blitt testet ved hjelp av et smalt sett med a priori "forsvars"-forbindelser. Disse metabolitt-sentriske testene utelukker muligheten til å analysere omfanget og banen til metabolomrekonfigurasjon under planteeting, og tillater ikke testing innenfor et konsistent statistisk rammeverk for å kreve nøkkelprediksjoner som kan betraktes som en helhet for å kvantifisere endringer i plantemetabolomet. Her brukte vi den innovative teknologien innen metabolomikk basert på beregningsbasert MS og utførte dekonvolusjons-MS-analyse i de generelle informasjonsteoribeskrivelsene for å teste skillet mellom de to foreslåtte på globalt metabolomikknivå. Den viktigste prediksjonen i denne teorien. Informasjonsteori har blitt anvendt på mange felt, spesielt i sammenheng med forskning på biologisk mangfold og næringsstrøm (43). Så vidt vi vet, er dette imidlertid den første anvendelsen som brukes til å beskrive planters metabolske informasjonsrom og løse økologiske problemer knyttet til midlertidige metabolske endringer som respons på miljøsignaler. Spesielt ligger denne metodens evne i dens evne til å sammenligne mønstre innenfor og mellom plantearter for å undersøke hvordan planteetere har utviklet seg fra forskjellige arter til makroevolusjonære mønstre mellom arter på forskjellige evolusjonsnivåer. Metabolisme.
Prinsipalkomponentanalyse (PCA) konverterer et multivariat datasett til et dimensjonalitetsreduksjonsrom slik at hovedtrenden i dataene kan forklares. Derfor brukes det vanligvis som en utforskende teknikk for å analysere datasettet, for eksempel dekonvolusjonsmetabolomer. Dimensjonalitetsreduksjon vil imidlertid miste deler av informasjonsinnholdet i datasettet, og PCA kan ikke gi kvantitativ informasjon om egenskaper som er spesielt relevante for økologisk teori, for eksempel: hvordan planteetere omkonfigurerer mangfold innen spesialiserte felt (for eksempel rikdom, distribusjon og overflod) metabolitter? Hvilke metabolitter er prediktorer for den induserte tilstanden til en gitt planteeter? Fra et spesifisitets-, mangfolds- og induserbarhetsperspektiv dekomponeres informasjonsinnholdet i den bladspesifikke metabolittprofilen, og det er funnet at spising av planteetere kan aktivere spesifikk metabolisme. Uventet observerte vi at, som beskrevet i de implementerte informasjonsteoriindikatorene, har den resulterende metabolske situasjonen en stor overlapping etter angrepene fra de to planteeterne (den nattfôrede generalisten Sl) og Solanaceae-eksperten Ms. Selv om deres spiseatferd og konsentrasjon er betydelig forskjellig. Fettsyre-aminosyrekonjugat (FAC)-initiator i OS (31). Ved å bruke planteeter-OS til å behandle standardiserte stikksår, viste simulert planteeterbehandling også en lignende trend. Denne standardiserte prosedyren for å simulere planters respons på planteeterangrep eliminerer de forstyrrende faktorene forårsaket av endringer i planteeternes spiseatferd, som fører til varierende grad av skade på forskjellige tidspunkter (34). FAC, som er kjent for å være hovedårsaken til OSM, reduserer JAS og andre plantehormonresponser i OSS1, mens OSS1 reduseres hundrevis av ganger (31). Imidlertid forårsaket OSS1 lignende nivåer av JA-akkumulering sammenlignet med OSM. Det har tidligere blitt vist at JA-responsen i svekket Nepenthes er svært følsom for OSM, hvor FAC kan opprettholde sin aktivitet selv om den fortynnes 1:1000 med vann (44). Sammenlignet med OSM er FAC i OSS1 derfor tilstrekkelig til å indusere tilstrekkelig JA-utbrudd, selv om den er svært lav. Tidligere studier har vist at porinlignende proteiner (45) og oligosakkarider (46) kan brukes som molekylære ledetråder for å utløse planteforsvarsresponser i OSS1. Det er imidlertid fortsatt uklart om disse elicitorene i OSS1 er ansvarlige for akkumuleringen av JA observert i den nåværende studien.
Selv om det finnes få studier som beskriver de differensielle metabolske fingeravtrykkene forårsaket av bruk av forskjellige planteetere eller eksogene JA eller SA (salisylsyre) (47), har ingen forstyrret den planteetende artsspesifikke forstyrrelsen i plantegressnettverket og dens effekter på den spesifikke personlige informasjonen. Den samlede effekten av metabolismen studeres systematisk. Denne analysen bekreftet videre at den interne hormonnettverksforbindelsen med andre plantehormoner enn JA former spesifisiteten til den metabolske reorganiseringen forårsaket av planteetere. Spesielt oppdaget vi at ET forårsaket av OSM var betydelig større enn det som var forårsaket av OSS1. Denne modusen er konsistent med mer FAC-innhold i OSM, som er en nødvendig og tilstrekkelig betingelse for å utløse et ET-utbrudd (48). I sammenheng med samspillet mellom planter og planteetere er signalfunksjonen til ET på plantespesifikk metabolittdynamikk fortsatt sporadisk og retter seg bare mot en enkelt stoffgruppe. I tillegg har de fleste studier brukt eksogen anvendelse av ET eller dets forløpere eller forskjellige hemmere for å studere reguleringen av ET, hvorav disse eksogene kjemiske anvendelsene vil produsere mange uspesifikke bivirkninger. Så vidt vi vet, representerer denne studien den første storskala systematiske undersøkelsen av rollen til ET i bruken av ET for å produsere og oppfatte svekkede transgene planter for å koordinere plantemetabolomdynamikken. Herbivorspesifikk ET-induksjon kan til slutt modulere metabolomresponsen. Den viktigste er den transgene manipulasjonen av ET-biosyntese (ACO) og persepsjon (ETR1) gener som avslørte den herbivorspesifikke de novo akkumuleringen av fenolamider. Det har tidligere blitt vist at ET kan finjustere JA-indusert nikotinakkumulering ved å regulere putrescin N-metyltransferase (49). Fra et mekanisk synspunkt er det imidlertid ikke klart hvordan ET finjusterer induksjonen av fenamid. I tillegg til signaltransduksjonsfunksjonen til ET, kan den metabolske fluksen også shuntes til S-adenosyl-1-metionin for å regulere investeringen i polyaminofenolamider. S-adenosyl-1-metionin er ET og et vanlig mellomprodukt i polyaminbiosynteseveien. Mekanismen som ET-signalet bruker for å regulere nivået av fenolamid trenger videre studier.
På grunn av det store antallet spesielle metabolitter med ukjent struktur har den intense oppmerksomheten mot spesifikke metabolske kategorier lenge ikke vært i stand til å nøyaktig vurdere de tidsmessige endringene i metabolsk mangfold etter biologiske interaksjoner. For tiden, basert på informasjonsteorianalyse, er hovedresultatet av MS/MS-spektruminnhenting basert på objektive metabolitter at planteetere som spiser eller simulerer planteetere fortsetter å redusere det totale metabolske mangfoldet til bladmetabolomet samtidig som de øker spesialiseringsgraden. Denne midlertidige økningen i metabolomspesifisitet forårsaket av planteetere er assosiert med en synergistisk økning i transkriptomspesifisitet. Funksjonen som bidrar mest til denne større metabolomspesialiseringen (med en høyere Si-verdi) er den spesielle metabolitten med den tidligere karakteriserte planteetende funksjonen. Denne modellen er i samsvar med prediksjonen i OD-teorien, men prediksjonen av MT relatert til tilfeldigheten av metabolomreprogrammering er ikke konsistent. Imidlertid er disse dataene også i samsvar med prediksjonen i den blandede modellen (beste MT; figur 1B), fordi andre ukarakteriserte metabolitter med ukjente forsvarsfunksjoner fortsatt kan følge en tilfeldig Si-fordeling.
Et bemerkelsesverdig mønster som denne forskningen ytterligere fanger opp, er at fra mikroevolusjonsnivået (enkelt plante og tobakkspopulasjon) til en større evolusjonær skala (nært beslektede tobakksarter), er ulike nivåer av evolusjonær organisering i «beste forsvar». Det er betydelige forskjeller i planteeteres evner. Moore et al. (20) og Kessler og Kalske (1) foreslo uavhengig av hverandre å konvertere de tre funksjonelle nivåene av biologisk mangfold som opprinnelig ble skilt ut av Whittaker (50) til de konstitutive og induserte tidsmessige endringene av kjemisk mangfold; disse forfatterne oppsummerte heller ikke. Prosedyrene for storskala metabolomdatainnsamling beskriver heller ikke hvordan man beregner metabolsk mangfold fra disse dataene. I denne studien vil mindre justeringer av Whittakers funksjonelle klassifisering betrakte α-metabolsk mangfold som mangfoldet av MS/MS-spektre i en gitt plante, og β-metabolsk mangfold som den grunnleggende intraspesifikke metabolismen til en gruppe populasjoner. Rom, og γ-metabolsk mangfold vil være en utvidelse av analysen av lignende arter.
JA-signalet er essensielt for et bredt spekter av herbivore metabolske responser. Det mangler imidlertid grundig kvantitativ testing av bidraget fra intraspesifikk regulering av JA-biosyntese til metabolomdiversitet, og hvorvidt JA-signalet er et generelt sted for stressindusert metabolsk diversifisering på en høyere makroevolusjonær skala er fortsatt unnvikende. Vi observerte at den herbivore naturen til Nepenthes herbivorous induserer metabolomspesialisering, og variasjonen av metabolomspesialisering innenfor populasjonen av Nicotiana-arter og blant nært beslektede Nicotiana-arter er systematisk positivt korrelert med JA-signalering. I tillegg, når JA-signalet er svekket, vil den metabolske spesifisiteten indusert av en enkelt genotype-herbivor bli kansellert (figur 3, C og E). Siden endringene i metabolsk spektrum for de naturlig svekkede Nepenthes-populasjonene for det meste er kvantitative, kan endringene i metabolsk β-diversitet og spesifisitet i denne analysen i stor grad være forårsaket av den sterke eksitasjonen av metabolittrike forbindelseskategorier. Disse forbindelsesklassene dominerer en del av metabolomprofilen og fører til en positiv korrelasjon med JA-signaler.
Fordi de biokjemiske mekanismene til tobakksarten som er nært beslektet med den er svært forskjellige, identifiseres metabolittene spesifikt i det kvalitative aspektet, slik at det er mer analytisk. Informasjonsteoriens behandling av den innfangede metabolske profilen avslører at planteetende induksjon forverrer avveiningen mellom metabolsk gamma-mangfold og spesialisering. JA-signalet spiller en sentral rolle i denne avveiningen. Økningen i metabolomspesialisering er i samsvar med den viktigste OD-prediksjonen og er positivt korrelert med JA-signalet, mens JA-signalet er negativt korrelert med metabolsk gamma-mangfold. Disse modellene indikerer at OD-kapasiteten til planter hovedsakelig bestemmes av plastisiteten til JA, enten på en mikroevolusjonær skala eller på en større evolusjonær skala. Eksogene JA-applikasjonseksperimenter som omgår JA-biosyntesefeil, avslører videre at nært beslektede tobakksarter kan skilles ut i signalresponsive og signal-ikke-responsive arter, akkurat som deres JA-modus og metabolomplastisitet indusert av planteetere. Signal-ikke-responsive arter kan ikke reagere på grunn av deres manglende evne til å produsere endogen JA og er derfor underlagt fysiologiske begrensninger. Dette kan være forårsaket av mutasjoner i noen nøkkelgener i JA-signalveien (AOS og JAR4 i N. crescens). Dette resultatet fremhever at disse makroevolusjonære mønstrene mellom arter hovedsakelig kan være drevet av endringer i intern hormonpersepsjon og responsivitet.
I tillegg til samspillet mellom planter og planteetere, er utforskningen av metabolsk mangfold knyttet til alle viktige teoretiske fremskritt innen forskning på biologisk tilpasning til miljøet og utviklingen av komplekse fenotypiske egenskaper. Med økningen i mengden data innhentet av moderne MS-instrumenter, kan hypotesetesting om metabolsk mangfold nå overskride individuelle/kategori metabolittforskjeller og utføre global analyse for å avdekke uventede mønstre. I prosessen med storskala analyse er en viktig metafor ideen om å utarbeide meningsfulle kart som kan brukes til å utforske data. Derfor er et viktig resultat av den nåværende kombinasjonen av objektiv MS/MS metabolomikk og informasjonsteori at den gir en enkel metrikk som kan brukes til å konstruere kart for å bla gjennom metabolsk mangfold på forskjellige taksonomiske skalaer. Det er det grunnleggende kravet til denne metoden. Studiet av mikro-/makroevolusjon og samfunnsøkologi.
På makroevolusjonært nivå er kjernen i Ehrlich og Ravens (51) teori om plante-insekt-koevolusjon å forutsi at variasjonen i metabolsk mangfold mellom arter er årsaken til diversifiseringen av plantelinjer. Imidlertid har denne hypotesen sjelden blitt testet i de femti årene siden publiseringen av dette banebrytende arbeidet (52). Dette skyldes i stor grad de fylogenetiske egenskapene til sammenlignbare metabolske egenskaper på tvers av langdistanse plantelinjer. Sjeldenheten kan brukes til å forankre målanalysemetoder. Den nåværende MS/MS-arbeidsflyten behandlet av informasjonsteori kvantifiserer den strukturelle MS/MS-likheten til ukjente metabolitter (uten forutgående metabolittvalg) og konverterer disse MS/MS-ene til et sett med MS/MS, og dermed sammenlignes disse makroevolusjonære modellene i profesjonell metabolisme i klassifiseringsskala. Enkle statistiske indikatorer. Prosessen ligner på fylogenetisk analyse, som kan bruke sekvensjustering for å kvantifisere hastigheten på diversifisering eller karakterutvikling uten forutgående prediksjon.
På det biokjemiske nivået viser screeninghypotesen til Firn og Jones (53) at metabolsk mangfold opprettholdes på forskjellige nivåer for å gi råmaterialer til å utøve de biologiske aktivitetene til tidligere urelaterte eller substituerte metabolitter. Informasjonsteoretiske metoder gir et rammeverk der disse metabolittspesifikke evolusjonære overgangene som skjer under metabolittspesialisering kan kvantifiseres som en del av den foreslåtte evolusjonære screeningsprosessen: biologisk aktiv tilpasning fra lav spesifisitet til høy spesifisitet Hemmede metabolitter av et gitt miljø.
Alt i alt ble det i molekylærbiologiens tidlige dager utviklet viktige teorier om planteforsvar, og deduktive hypotesedrevne metoder anses i stor grad for å være det eneste middelet til vitenskapelig fremgang. Dette skyldes i stor grad de tekniske begrensningene ved å måle hele metabolomet. Selv om hypotesedrevne metoder er spesielt nyttige for å velge andre årsaksmekanismer, er deres evne til å fremme vår forståelse av biokjemiske nettverk mer begrenset enn de beregningsmetodene som for tiden er tilgjengelige i moderne dataintensiv vitenskap. Derfor er teorier som ikke kan forutsies langt utenfor omfanget av tilgjengelige data, så den hypotetiske formel-/testsyklusen for fremgang innen forskningsfeltet kan ikke avskaffes (4). Vi ser for oss at den beregningsmessige arbeidsflyten for metabolomikk som introduseres her, kan gjenopplive interessen for de nylige (hvordan) og endelige (hvorfor) problemstillingene rundt metabolsk mangfold, og bidra til en ny æra av teoretisk styrt datavitenskap. Æraen undersøkte på nytt de viktige teoriene som inspirerte tidligere generasjoner.
Direkte planteeterfôring utføres ved å oppdra en andre instarlarve eller Sl-larve på et enkelt blekfarget muggeblad fra en enkelt roseblomstrende plante, med 10 plantereplikater per plante. Insektlarvene ble klemt fast med klemmer, og det gjenværende bladvevet ble samlet inn 24 og 72 timer etter infeksjon og hurtigfryst, og metabolittene ble ekstrahert.
Simuler planteetende behandling på en svært synkronisert måte. Metoden går ut på å bruke stoffmønsterhjul til å punktere tre rader med torner på hver side av midtribben på de tre fullt utvidede bladene på planten i løpet av vekststadiet til stoffgirlanderen, og umiddelbart påføre 1:5 fortynnet Ms. Eller bruk fingre med hanske til å sette S1 OS inn i stikksåret. Høst og bearbeid et blad som beskrevet ovenfor. Bruk den tidligere beskrevne metoden til å ekstrahere primære metabolitter og plantehormoner (54).
For eksogene JA-applikasjoner behandles de tre bladstilkene til hver av de seks roseblomstrende plantene av hver art med 20 μl lanolinpasta som inneholder 150 μg MeJA (Lan + MeJA) og 20 μl lanolin pluss sårbehandling (Lan + W), eller 20 μl ren lanolin brukes som kontroll. Bladene ble høstet 72 timer etter behandling, hurtigfrosset i flytende nitrogen og lagret ved -80 °C inntil bruk.
Fire transgene JA- og ET-linjer, nemlig irAOC (36), irCOI1 (55), irACO og sETR1 (48), har blitt identifisert i vår forskningsgruppe. irAOC viste en sterk reduksjon i JA- og JA-Ile-nivåer, mens irCOI1 ikke var følsom for JA-er. Sammenlignet med EV økte JA-Ile-akkumuleringen. På samme måte vil irACO redusere produksjonen av ET, og sammenlignet med EV vil sETR1, som er ufølsom for ET, øke produksjonen av ET.
Et fotoakustisk laserspektrometer (Sensor Sense ETD-300 sanntids-ET-sensor) brukes til å utføre ET-måling ikke-invasivt. Umiddelbart etter behandling ble halvparten av bladene kuttet og overført til et 4 ml forseglet glassampulle, og lufttoppen fikk samle seg i løpet av 5 timer. Under målingen ble hvert ampulle skylt med en strøm på 2 liter/time ren luft i 8 minutter, som tidligere hadde passert gjennom en katalysator levert av Sensor Sense for å fjerne CO2 og vann.
Mikroarray-dataene ble opprinnelig publisert i (35) og lagret i National Center for Biotechnology Information (NCBI) Gene Expression Comprehensive Database (tiltredelsesnummer GSE30287). Dataene som tilsvarer bladene forårsaket av W + OSM-behandlingen og den uskadede kontrollen ble ekstrahert for denne studien. Råintensiteten er log2. Før statistisk analyse ble baseline konvertert og normalisert til sin 75. persentil ved hjelp av R-programvarepakken.
De originale RNA-sekvenseringsdataene (RNA-sekvenseringsdataene) for Nicotiana-arter ble hentet fra NCBI Short Reading Archives (SRA), prosjektnummeret er PRJNA301787, som ble rapportert av Zhou et al. (39) og fortsetter som beskrevet i (56). Rådataene behandlet av W + W, W + OSM og W + OSS1 som korresponderer med Nicotiana-arter ble valgt ut for analyse i denne studien, og behandlet på følgende måte: Først ble de rå RNA-sekvenseringsavlesningene konvertert til FASTQ-format. HISAT2 konverterer FASTQ til SAM, og SAMtools konverterer SAM-filer til sorterte BAM-filer. StringTie brukes til å beregne genuttrykk, og uttrykkmetoden er at det er fragmenter per tusen basefragmenter per million sekvenserte transkripsjonsfragmenter.
Acclaim-kromatografikolonnen (150 mm x 2,1 mm; partikkelstørrelse 2,2 μm) som ble brukt i analysen og 4 mm x 4 mm beskyttelseskolonnen består av samme materiale. Følgende binære gradient brukes i Dionex UltiMate 3000 Ultra High Performance Liquid Chromatography (UHPLC)-systemet: 0 til 0,5 minutter, isokratisk 90 % A [avionisert vann, 0,1 % (v/v) acetonitril og 0,05 % maursyre], 10 % B (acetonitril og 0,05 % maursyre); 0,5 til 23,5 minutter, gradientfasen er henholdsvis 10 % A og 90 % B; 23,5 til 25 minutter, isokratisk 10 % A og 90 % B. Strømningshastigheten er 400 μl/min. For alle MS-analyser, injiser kolonneeluenten i en kvadrupol- og time-of-flight (qTOF)-analysator utstyrt med en elektrospraykilde som opererer i positiv ioniseringsmodus (kapillærspenning, 4500 V; kapillærutløp 130 V; tørketemperatur 200 °C; tørkeluftstrøm 10 liter/min).
Utfør MS/MS-fragmentanalyse (heretter referert til som MS/MS) som er irrelevant eller umulig å skille fra dataene for å innhente strukturell informasjon om den generelle detekterbare metabolske profilen. Konseptet med den vilkårlige MS/MS-metoden er avhengig av det faktum at kvadrupolen har et veldig stort masseisolasjonsvindu [derfor, betrakt alle masse-til-ladningsforhold (m/z)-signaler som fragmenter]. Av denne grunn, fordi Impact II-instrumentet ikke var i stand til å skape en CE-tilt, ble flere uavhengige analyser utført ved bruk av økte kollisjonsinduserte dissosiasjonskollisjonsenergiverdier (CE). Kort sagt, analyser først prøven ved UHPLC-elektrosprayionisering/qTOF-MS ved bruk av enkelt massespektrometrimodus (lavfragmenteringsforhold generert av fragmentering i kilden), skanning fra m/z 50 til 1500 ved en repetisjonsfrekvens på 5 Hz. Bruk nitrogen som kollisjonsgass for MS/MS-analyse, og utfør uavhengige målinger ved følgende fire forskjellige kollisjonsinduserte dissosiasjonsspenninger: 20, 30, 40 og 50 eV. Gjennom hele måleprosessen har kvadrupolen det største masseisolasjonsvinduet, fra m/z 50 til 1500. Når frontkroppens m/z og isolasjonsbreddeeksperiment er satt til 200, aktiveres masseområdet automatisk av instrumentets operativsystemprogramvare og 0 Da. Skann etter massefragmenter som i enkeltmassemodus. Bruk natriumformiat (50 ml isopropanol, 200 μl maursyre og 1 ml 1M NaOH vandig løsning) for massekalibrering. Ved hjelp av Brukers høypresisjonskalibreringsalgoritme kalibreres datafilen etter å ha kjørt gjennomsnittsspekteret i en gitt tidsperiode. Bruk eksportfunksjonen til Data Analysis v4.0-programvaren (Brook Dalton, Bremen, Tyskland) for å konvertere rådatafilene til NetCDF-format. MS/MS-datasettet er lagret i den åpne metabolomikkdatabasen MetaboLights (www.ebi.ac.uk) med tiltredelsesnummeret MTBLS1471.
MS/MS-assembling kan realiseres gjennom korrelasjonsanalyse mellom MS1- og MS/MS-kvalitetssignaler for lav og høy kollisjonsenergi og nylig implementerte regler. R-skriptet brukes til å realisere korrelasjonsanalysen av fordelingen av forløperen til produktet, og C#-skriptet (https://github.com/MPI-DL/indiscriminant-MS-MS-assembly-pipeline) brukes til å implementere reglene.
For å redusere falske positive feil forårsaket av bakgrunnsstøy og falsk korrelasjon forårsaket av å oppdage visse m/z-funksjoner i bare noen få prøver, bruker vi funksjonen "filled peak" i R-pakken XCMS (for korrigering av bakgrunnsstøy). Denne funksjonen bør brukes til å erstatte intensiteten "NA" (uoppdaget topp). Når fylltoppfunksjonen brukes, er det fortsatt mange intensitetsverdier på "0" i datasettet som vil påvirke korrelasjonsberegningen. Deretter sammenligner vi databehandlingsresultatene som oppnås når fylltoppfunksjonen brukes og når fylltoppfunksjonen ikke brukes, og beregner bakgrunnsstøyverdien basert på den gjennomsnittlige korrigerte estimerte verdien, og erstatter deretter disse intensitetsverdiene på 0 med den beregnede bakgrunnsverdien. Vi vurderte også bare funksjoner med en intensitet som oversteg tre ganger bakgrunnsverdien og betraktet dem som "sanne topper". For PCC-beregninger vurderes bare m/z-signalene fra prøveforløperen (MS1) og fragmentdatasettene med minst åtte sanne topper.
Hvis intensiteten til forløperkvalitetsegenskapen i hele prøven er signifikant korrelert med den reduserte intensiteten til den samme kvalitetsegenskapen som utsettes for lav eller høy kollisjonsenergi, og egenskapen ikke er merket som en isotoptopp av CAMERA, kan den defineres ytterligere. Deretter, ved å beregne alle mulige forløper-produkt-par innen 3 sekunder (det estimerte retensjonstidsvinduet for toppretensjon), utføres korrelasjonsanalysen. Bare når m/z-verdien er lavere enn forløperverdien og MS/MS-fragmentering forekommer på samme prøveplassering i datasettet som forløperen den er avledet fra, regnes den som et fragment.
Basert på disse to enkle reglene ekskluderer vi de spesifiserte fragmentene med m/z-verdier større enn m/z-verdien til den identifiserte forløperen, og basert på prøveposisjonen der forløperen vises og det spesifiserte fragmentet. Det er også mulig å velge kvalitetsfunksjonene generert av mange kildefragmenter generert i MS1-modus som kandidatforløpere, og dermed generere redundante MS/MS-forbindelser. For å redusere denne dataredundansen, hvis NDP-likheten til spektrene overstiger 0,6, og de tilhører kromatogrammet "pcgroup" annotert av CAMERA, vil vi slå dem sammen. Til slutt slår vi sammen alle fire CE-resultatene assosiert med forløperen og fragmentene til det endelige dekonvolverte komposittspekteret ved å velge toppen med høyest intensitet blant alle kandidattopper med samme m/z-verdi ved forskjellige kollisjonsenergier. De påfølgende behandlingstrinnene er basert på konseptet med komposittspektrum og tar hensyn til de forskjellige CE-forholdene som kreves for å maksimere sannsynligheten for fragmentering, fordi noen fragmenter bare kan detekteres under en spesifikk kollisjonsenergi.
RDPI (30) ble brukt til å beregne induserbarheten til den metabolske profilen. Det metabolske spektrumdiversiteten (Hj-indeksen) er avledet fra mengden av MS/MS-forløpere ved å bruke Shannon-entropien til MS/MS-frekvensfordelingen ved å bruke følgende ligning beskrevet av Martínez et al. (8). Hj = −∑i = 1mPijlog2(Pij) hvor Pij tilsvarer den relative frekvensen til den i-te MS/MS i den j-te prøven (j = 1, 2,…, m) (i = 1, 2, …, m) t).
Metabolsk spesifisitet (Si-indeks) er definert som uttrykksidentiteten til en gitt MS/MS i forhold til frekvensen mellom prøvene som vurderes. MS/MS-spesifisitet beregnes som Si = 1t (∑j = 1tPijPilog2PijPi)
Bruk følgende formel til å måle den metabolomspesifikke δj-indeksen for hver j-prøve, og gjennomsnittet av MS/MS-spesifisiteten δj = ∑i = 1mPijSi
MS/MS-spektre er justert parvis, og likheten beregnes basert på de to poengsummene. Først, ved å bruke standard NDP (også kjent som cosinuskorrelasjonsmetode), bruk følgende ligning for å score segmentlikheten mellom spektrene: NDP = (∑iS1 og S2WS1, iWS2, i) 2∑iWS1, i2∑iWS2, i2 hvor S1 og S2 Tilsvarende, for spektrum 1 og spektrum 2, samt WS1, i og WS2, representerer i vekten basert på toppintensiteten der forskjellen mellom den i-te felles toppen mellom de to spektrene er mindre enn 0,01 Da. Vekten beregnes som følger: W = [toppintensitet] m [kvalitet] n, m = 0,5, n = 2, som foreslått av MassBank.
En annen scoringsmetode ble implementert, som involverte analyse av den delte NL mellom MS/MS. Til dette formålet brukte vi de 52 NL-listene som ofte oppstår under MS-fragmenteringsprosessen i tandem, og den mer spesifikke NL (datafil S1) som tidligere har blitt annotert for MS/MS-spekteret av de sekundære metabolittene til den svekkede Nepenthes-arten (9, 26). Opprett en binær vektor på 1 og 0 for hver MS/MS, som tilsvarer henholdsvis nåværende og ikke-eksisterende av noen NL. Basert på den euklidske avstandslikheten beregnes NL-likhetspoengsummen for hvert par av binære NL-vektorer.
For å utføre dobbel klynging brukte vi R-pakken DiffCoEx, som er basert på en utvidelse av Weighted Gene Co-expression Analysis (WGCNA). Ved å bruke NDP- og NL-scoringsmatrisene fra MS/MS-spektre brukte vi DiffCoEx til å beregne den komparative korrelasjonsmatrisen. Binær klynging utføres ved å sette parameteren «cutreeDynamic» til method = «hybrid», cutHeight = 0,9999, deepSplit = T og minClusterSize = 10. R-kildekoden til DiffCoEx ble lastet ned fra tilleggsfil 1 av Tesson et al. (57); Den nødvendige R WGCNA-programvarepakken finnes på https://horvath.genetics.ucla.edu/html/CoexpressionNetwork/Rpackages/WGCNA.
For å utføre MS/MS molekylær nettverksanalyse, beregnet vi paret spektral konnektivitet basert på NDP- og NL-likhetstyper, og brukte Cytoscape-programvare for å visualisere nettverkstopologi ved hjelp av organisk layout i CyFilescape yFiles layoutalgoritmeutvidelsesapplikasjonen.
Bruk R versjon 3.0.1 til å utføre statistisk analyse av dataene. Statistisk signifikans ble vurdert ved hjelp av toveis variansanalyse (ANOVA), etterfulgt av Tukeys HSD-test (honestly significant difference) post-hoc. For å analysere forskjellen mellom den planteetende behandlingen og kontrollen ble den tosidige fordelingen av de to gruppene av prøver med samme varians analysert ved hjelp av Students t-test.
For tilleggsmateriale til denne artikkelen, se http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/24/eaaz0381/DC1
Dette er en artikkel med åpen tilgang distribuert under vilkårene i Creative Commons Attribution-Non-Commercial License, som tillater bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, så lenge den endelige bruken ikke er for kommersiell vinning og forutsetningen er at det originale verket er korrekt. Referanse.
Merk: Vi ber deg bare om å oppgi e-postadressen din, slik at personen du anbefaler til siden vet at du vil at de skal se e-posten, og at den ikke er spam. Vi vil ikke registrere noen e-postadresser.
Dette spørsmålet brukes til å teste om du er en besøkende og forhindre automatisk spaminnsending.
Informasjonsteori gir en universell valuta for sammenligning av spesielle metabolomer og prediksjon av testforsvarsteorier.
Informasjonsteori gir en universell valuta for sammenligning av spesielle metabolomer og prediksjon av testforsvarsteorier.
©2021 American Association for the Advancement of Science. alle rettigheter forbeholdt. AAAS er partner av HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef og COUNTER. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.