Vi har tidligere rapportert at serumnivåene av tryptofanmetabolitten indol-3-propionsyre (IPA) utvunnet fra tarmen er lavere hos pasienter med leverfibrose. I denne studien undersøkte vi transkriptomet og DNA-metylomet i overvektige lever i forhold til serum-IPA-nivåer, samt rollen til IPA i å indusere fenotypisk inaktivering av hepatiske stellatceller (HSC-er) in vitro.
Studien inkluderte 116 overvektige pasienter uten diabetes mellitus type 2 (T2DM) (alder 46,8 ± 9,3 år; BMI: 42,7 ± 5,0 kg/m²) som gjennomgikk fedmekirurgi ved Kuopio Bariatric Surgery Center (KOBS). Sirkulerende IPA-nivåer ble målt ved væskekromatografi-massespektrometri (LC-MS), levertranskriptomanalyse ble utført ved total RNA-sekvensering, og DNA-metyleringsanalyse ble utført ved hjelp av Infinium HumanMethylation450 BeadChip. Humane leverstellatceller (LX-2) ble brukt til in vitro-eksperimenter.
Serumnivåer av IPA korrelerte med uttrykket av gener involvert i apoptotiske, mitofagiske og levetidsforlengelsesveier i leveren. AKT serin/treoninkinase 1 (AKT1)-genet var det mest tallrike og dominerende interagerende genet i levertranskriptet og DNA-metyleringsprofilene. IPA-behandling induserte apoptose, reduserte mitokondriell respirasjon og endret cellemorfologi og mitokondriell dynamikk ved å modulere uttrykket av gener kjent for å regulere fibrose, apoptose og overlevelse av LX-2-celler.
Samlet sett støtter disse dataene at IPA har potensielle terapeutiske effekter og kan indusere apoptose og forskyve HSC-fenotypen mot en inaktiv tilstand, og dermed utvide muligheten for å hemme leverfibrose ved å forstyrre HSC-aktivering og mitokondriell metabolisme.
Forekomsten av fedme og metabolsk syndrom har vært assosiert med en økende forekomst av metabolsk assosiert fettleversykdom (MASLD); sykdommen rammer 25 % til 30 % av den generelle befolkningen [1]. Hovedkonsekvensen av MASLD-etiologien er leverfibrose, en dynamisk prosess karakterisert ved kontinuerlig akkumulering av fibrøs ekstracellulær matriks (ECM) [2]. De viktigste cellene involvert i leverfibrose er hepatiske stellatceller (HSC-er), som viser fire kjente fenotyper: hvilende, aktiverte, inaktiverte og senescente [3, 4]. HSC-er kan aktiveres og transdifferensieres fra en hvilende form til proliferative fibroblastlignende celler med høyt energibehov, med økt uttrykk av α-glattmuskelaktin (α-SMA) og type I-kollagen (Col-I) [5, 6]. Under reversering av leverfibrose elimineres aktiverte HSC-er via apoptose eller inaktivering. Disse prosessene inkluderer nedregulering av fibrogene gener og modulering av prosurvivalgener (som NF-κB og PI3K/Akt signalveier) [7, 8], samt endringer i mitokondriedynamikk og -funksjon [9].
Serumnivåer av tryptofanmetabolitten indol-3-propionsyre (IPA), produsert i tarmen, har vist seg å være redusert ved menneskelige metabolske sykdommer, inkludert MASLD [10–13]. IPA er assosiert med inntak av kostfiber, er kjent for sine antioksidant- og antiinflammatoriske effekter, og demper den diettinduserte ikke-alkoholiske steatohepatitt (NASH)-fenotypen in vivo og in vitro [11–14]. Noe bevis kommer fra vår tidligere studie, som viste at serumnivåene av IPA var lavere hos pasienter med leverfibrose enn hos overvektige pasienter uten leverfibrose i Kuopio Bariatric Surgery Study (KOBS). Videre viste vi at IPA-behandling kunne redusere uttrykket av gener som er klassiske markører for celleadhesjon, cellemigrasjon og hematopoietisk stamcelleaktivering i en human hepatisk stellatcelle (LX-2)-modell og er en potensiell hepatoprotektiv metabolitt [15]. Det er imidlertid fortsatt uklart hvordan IPA induserer leverfibrose-regresjon ved å aktivere HSC-apoptose og mitokondriell bioenergetikk.
Her demonstrerer vi at serum-IPA er assosiert med uttrykket av gener beriket i apoptose, mitofagi og levetidsveier i leveren hos overvektige personer med ikke-type 2-diabetes (KOBS). Videre fant vi at IPA kan indusere clearance og nedbrytning av aktiverte hematopoietiske stamceller (HSC-er) via inaktiveringsveien. Disse resultatene avslører en ny rolle for IPA, noe som gjør det til et potensielt terapeutisk mål for å fremme leverfibrose-regresjon.
En tidligere studie i KOBS-kohorten viste at pasienter med leverfibrose hadde lavere sirkulerende IPA-nivåer sammenlignet med pasienter uten leverfibrose [15]. For å utelukke den potensielle forvirrende effekten av type 2-diabetes rekrutterte vi 116 overvektige pasienter uten type 2-diabetes (gjennomsnittsalder ± SD: 46,8 ± 9,3 år; BMI: 42,7 ± 5,0 kg/m2) (tabell 1) fra den pågående KOBS-studien som studiepopulasjon [16]. Alle deltakerne ga skriftlig informert samtykke, og studieprotokollen ble godkjent av etikkomiteen ved North Savo County Hospital i samsvar med Helsingforsdeklarasjonen (54/2005, 104/2008 og 27/2010).
Leverbiopsiprøver ble tatt under fedmekirurgi og histologisk vurdert av erfarne patologer i henhold til tidligere beskrevne kriterier [17, 18]. Vurderingskriteriene er oppsummert i tilleggstabell S1 og har blitt beskrevet tidligere [19].
Fastende serumprøver ble analysert ved hjelp av ikke-målrettet væskekromatografi-massespektrometri (LC-MS) for metabolomikkanalyse (n = 116). Prøvene ble analysert ved hjelp av et UHPLC-qTOF-MS-system (1290 LC, 6540 qTOF-MS, Agilent Technologies, Waldbronn, Karlsruhe, Tyskland) som beskrevet tidligere19. Identifisering av isopropylalkohol (IPA) var basert på retensjonstid og sammenligning av MS/MS-spekteret med rene standarder. IPA-signalintensiteten (topparealet) ble tatt i betraktning i alle videre analyser [20].
Hellever-RNA-sekvensering ble utført ved bruk av Illumina HiSeq 2500, og dataene ble forhåndsbehandlet som beskrevet tidligere [19, 21, 22]. Vi utførte målrettet differensiell ekspresjonsanalyse av transkripter som påvirker mitokondriefunksjon/biogenese ved bruk av 1957 gener valgt fra MitoMiner 4.0-databasen [23]. Lever-DNA-metyleringsanalyse ble utført ved bruk av Infinium HumanMethylation450 BeadChip (Illumina, San Diego, CA, USA) med samme metodikk som beskrevet tidligere [24, 25].
Humane leverstellatceller (LX-2) ble vennligst levert av professor Stefano Romeo og ble dyrket og vedlikeholdt i DMEM/F12-medium (Biowest, L0093-500, 1 % Pen/Strep; Lonza, DE17-602E, 2 % FBS; Gibco, 10270-106). For å velge arbeidsdosen av IPA ble LX-2-celler behandlet med forskjellige konsentrasjoner av IPA (10 μM, 100 μM og 1 mM; Sigma, 220027) i DMEM/F12-medium i 24 timer. For å undersøke IPAs evne til å inaktivere HSC-er ble LX-2-celler videre behandlet med 5 ng/ml TGF-β1 (R&D-systemer, 240-B-002/CF) og 1 mM IPA i serumfritt medium i 24 timer. For de tilsvarende kontrollgruppene av kontrollgruppen ble 4 nM HCL som inneholdt 0,1 % BSA brukt til TGF-β1-behandling og 0,05 % DMSO til IPA-behandling, og begge ble brukt sammen til kombinasjonsbehandlingen.
Apoptose ble vurdert ved bruk av FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit med 7-AAD (Biolegend, San Diego, CA, USA, kat.nr. 640922) i henhold til produsentens instruksjoner. Kort fortalt ble LX-2 (1 × 105 celler/brønn) dyrket over natten i 12-brønnsplater og deretter behandlet med flere doser IPA eller IPA og TGF-β1. Dagen etter ble flytende og adherente celler samlet, trypsinisert, vasket med PBS, resuspendert i Annexin V-bindingsbuffer og inkubert med FITC-Annexin V og 7-AAD i 15 minutter.
Mitokondrier i levende celler ble farget for oksidativ aktivitet ved bruk av Mitotracker™ Red CMXRos (MTR) (Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, CA). For MTR-analyser ble LX-2-celler inkubert ved like tettheter med IPA og TGF-β1. Etter 24 timer ble levende celler trypsinert, vasket med PBS og deretter inkubert med 100 μM MTR i serumfritt medium ved 37 °C i 20 minutter som beskrevet tidligere [26]. For analyse av levende cellers morfologi ble cellestørrelse og cytoplasmisk kompleksitet analysert ved bruk av henholdsvis forward scatter (FSC) og side scatter (SSC) parametere.
Alle data (30 000 hendelser) ble innhentet ved hjelp av NovoCyte Quanteon (Agilent) og analysert ved hjelp av NovoExpress® 1.4.1 eller FlowJo V.10-programvaren.
Oksygenforbrukshastighet (OCR) og ekstracellulær forsuringshastighet (ECAR) ble målt i sanntid ved hjelp av en Seahorse Extracellular Flux Analyzer (Agilent Technologies, Santa Clara, CA) utstyrt med en Seahorse XF Cell Mito Stress i henhold til produsentens instruksjoner. Kort fortalt ble 2 × 104 LX-2 celler/brønn sådd på XF96 cellekulturplater. Etter inkubasjon over natten ble cellene behandlet med isopropanol (IPA) og TGF-β1 (Supplerende metoder 1). Dataanalyse ble utført ved hjelp av Seahorse XF Wave-programvare, som inkluderer Seahorse XF Cell Energy Phenotype Test Report Generator. Fra dette ble en bioenergetisk helseindeks (BHI) beregnet [27].
Totalt RNA ble transkribert til cDNA. For spesifikke metoder, se referanse [15]. mRNA-nivåer av humant 60S ribosomalt surt protein P0 (RPLP0) og cyklofilin A1 (PPIA) ble brukt som konstitutive genkontroller. QuantStudio 6 pro Real-Time PCR System (Thermo Fisher, Landsmeer, Nederland) ble brukt med TaqMan™ Fast Advanced Master Mix Kit (Applied Biosystems) eller Sensifast SYBR Lo-ROX Kit (Bioline, BIO 94050), og relativ genekspresjonsfolding ble beregnet ved hjelp av sammenlignende Ct-verdisyklusparametere (ΔΔCt) og ∆∆Ct-metoden. Detaljer om primerne er gitt i tilleggstabellene S2 og S3.
Nukleært DNA (ncDNA) og mitokondrielt DNA (mtDNA) ble ekstrahert ved bruk av DNeasy blod- og vevssett (Qiagen) som beskrevet tidligere [28]. Den relative mengden mtDNA ble beregnet ved å beregne forholdet mellom hver mål-mtDNA-region og det geometriske gjennomsnittet av de tre nukleære DNA-regionene (mtDNA/ncDNA), som beskrevet i tilleggsmetoder 2. Detaljer om primerne for mtDNA og ncDNA er gitt i tilleggstabell S4.
Levende celler ble farget med Mitotracker™ Red CMXRos (MTR) (Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, CA) for å visualisere intercellulære og intracellulære mitokondrielle nettverk. LX-2-celler (1 × 104 celler/brønn) ble dyrket på glassplater i tilsvarende kulturplater med glassbunn (Ibidi GmbH, Martinsried, Tyskland). Etter 24 timer ble levende LX-2-celler inkubert med 100 μM MTR i 20 minutter ved 37 °C, og cellekjerner ble farget med DAPI (1 μg/ml, Sigma-Aldrich) som beskrevet tidligere [29]. Mitokondrielle nettverk ble visualisert ved hjelp av et Zeiss Axio Observer invertert mikroskop (Carl Zeiss Microimaging GmbH, Jena, Tyskland) utstyrt med en Zeiss LSM 800 konfokalmodul ved 37 °C i en fuktet atmosfære med 5 % CO2 ved bruk av et 63×NA 1.3 objektiv. Vi tok ti Z-seriebilder for hver prøvetype. Hver Z-serie inneholder 30 seksjoner, hver med en tykkelse på 9,86 μm. For hver prøve ble bilder av ti forskjellige synsfelt tatt ved hjelp av ZEN 2009-programvaren (Carl Zeiss Microimaging GmbH, Jena, Tyskland), og mitokondriell morfologianalyse ble utført ved hjelp av ImageJ-programvaren (v1.54d) [30, 31] i henhold til parametrene beskrevet i tilleggsmetoder 3.
Cellene ble fiksert med 2 % glutaraldehyd i 0,1 M fosfatbuffer, etterfulgt av fiksering med 1 % osmiumtetroksidløsning (Sigma Aldrich, MO, USA), gradvis dehydrert med aceton (Merck, Darmstadt, Tyskland) og til slutt innstøpt i epoksyharpiks. Ultratynne snitt ble fremstilt og farget med 1 % uranylacetat (Merck, Darmstadt, Tyskland) og 1 % blysitrat (Merck, Darmstadt, Tyskland). Ultrastrukturelle bilder ble tatt ved bruk av et JEM 2100F EXII transmisjonselektronmikroskop (JEOL Ltd, Tokyo, Japan) ved en akselerasjonsspenning på 80 kV.
Morfologien til LX-2-celler behandlet med IPA i 24 timer ble analysert ved fasekontrastmikroskopi ved 50x forstørrelse ved bruk av et Zeiss invertert lysmikroskop (Zeiss Axio Vert.A1 og AxioCam MRm, Jena, Tyskland).
Kliniske data ble uttrykt som gjennomsnitt ± standardavvik eller median (interkvartilområde: IQR). Enveis variansanalyse (kontinuerlige variabler) eller χ²-test (kategoriske variabler) ble brukt til å sammenligne forskjellene mellom de tre studiegruppene. Falsk positiv rate (FDR) ble brukt til å korrigere for multippel testing, og gener med FDR < 0,05 ble ansett som statistisk signifikante. Spearman-korrelasjonsanalyse ble brukt til å korrelere CpG-DNA-metylering med IPA-signalintensitet, med nominelle p-verdier (p < 0,05) rapportert.
Levertranskriptanalyse ble utført ved hjelp av et nettbasert verktøy for gensettanalyse (WebGestalt) for 268 transkripter (nominal p < 0,01), 119 mitokondrieassosierte transkripter (nominal p < 0,05) og 4350 CpG-er av 3093 levertranskripter som var assosiert med sirkulerende serum-IPA-nivåer. Det fritt tilgjengelige Venny DB-verktøyet (versjon 2.1.0) ble brukt til å finne overlappende gener, og StringDB (versjon 11.5) ble brukt til å visualisere protein-protein-interaksjoner.
For LX-2-eksperimentet ble prøvene testet for normalitet ved hjelp av D'Agostino-Pearson-testen. Data ble innhentet fra minst tre biologiske replikater og utsatt for enveis ANOVA med Bonferroni post hoc-test. En p-verdi på mindre enn 0,05 ble ansett som statistisk signifikant. Data presenteres som gjennomsnitt ± SD, og ​​antall eksperimenter er angitt i hver figur. Alle analyser og grafer ble utført ved hjelp av GraphPad Prism 8 statistisk programvare for Windows (GraphPad Software Inc., versjon 8.4.3, San Diego, USA).
Først undersøkte vi sammenhengen mellom serum-IPA-nivåer og lever-, helkropps- og mitokondrie-transkripter. I den totale transkriptprofilen var det sterkeste genet assosiert med serum-IPA-nivåer MAPKAPK3 (FDR = 0,0077; mitogenaktivert proteinkinase-aktivert proteinkinase 3); i den mitokondrie-relaterte transkriptprofilen var det sterkeste assosierte genet AKT1 (FDR = 0,7621; AKT serin/treoninkinase 1) (Tilleggsfil 1 og Tilleggsfil 2).
Deretter analyserte vi globale transkripter (n = 268; p < 0,01) og mitokondrieassosierte transkripter (n = 119; p < 0,05), og identifiserte til slutt apoptose som den viktigste kanoniske signalveien (p = 0,0089). For mitokondrietranskripter assosiert med serum-IPA-nivåer fokuserte vi på apoptose (FDR = 0,00001), mitofagi (FDR = 0,00029) og TNF-signalveier (FDR = 0,000006) (figur 1A, tabell 2 og tilleggsfigurene 1A-B).
Overlappende analyse av globale, mitokondriassosierte transkripter og DNA-metylering i menneskelig lever i forbindelse med serum-IPA-nivåer. A representerer 268 globale transkripter, 119 mitokondriassosierte transkripter og DNA-metylerte transkripter som er kartlagt til 3092 CpG-steder assosiert med serum-IPA-nivåer (p-verdier < 0,01 for globale transkripter og DNA-metylert, og p-verdier < 0,05 for mitokondrielle transkripter). De viktigste overlappende transkriptene er vist i midten (AKT1 og YKT6). B Interaksjonskartet for de 13 genene med høyest interaksjonspoengsum (0,900) med andre gener ble konstruert fra de 56 overlappende genene (svart linjeområde) som var signifikant assosiert med serum-IPA-nivåer ved hjelp av nettverktøyet StringDB. Grønn: Gener kartlagt til Gene Ontology (GO) cellulær komponent: mitokondrier (GO:0005739). AKT1 er proteinet med høyest poengsum (0,900) for interaksjoner med andre proteiner basert på dataene (basert på tekstutvinning, eksperimenter, databaser og koekspresjon). Nettverksnoder representerer proteiner, og kanter representerer forbindelser mellom proteiner.
Siden metabolitter i tarmmikrobiota kan regulere epigenetisk sammensetning gjennom DNA-metylering [32], undersøkte vi om serum-IPA-nivåer var assosiert med lever-DNA-metylering. Vi fant at de to viktigste metyleringsstedene assosiert med serum-IPA-nivåer var nær prolin-serin-rik region 3 (C19orf55) og varmesjokkproteinfamilie B (liten) medlem 6 (HSPB6) (tilleggsfil 3). DNA-metylering av 4350 CpG (p < 0,01) var korrelert med serum-IPA-nivåer og var beriket med reguleringsveier for levetid (p = 0,006) (figur 1A, tabell 2 og tilleggsfigur 1C).
For å forstå de biologiske mekanismene som ligger til grunn for assosiasjonene mellom serum-IPA-nivåer, globale transkripter, mitokondrieassosierte transkripter og DNA-metylering i menneskelig lever, utførte vi en overlappingsanalyse av genene identifisert i den forrige signalveianalysen (figur 1A). Resultatene av signalveiberikelsesanalysen av de 56 overlappende genene (innenfor den svarte linjen i figur 1A) viste at apoptoseveien (p = 0,00029) fremhevet to gener som er felles for de tre analysene: AKT1 og YKT6 (YKT6 v-SNARE-homolog), som vist i Venn-diagrammet (tilleggsfigur 2 og figur 1A). Interessant nok fant vi at AKT1 (cg19831386) og YKT6 (cg24161647) var positivt korrelert med serum-IPA-nivåer (tilleggsfil 3). For å identifisere potensielle proteininteraksjoner mellom genprodukter, valgte vi 13 gener med den høyeste fellesregionspoengsummen (0,900) blant 56 overlappende gener som input og konstruerte et interaksjonskart. I følge konfidensnivået (marginal konfidens) var AKT1-genet med høyest poengsum (0,900) øverst (figur 1B).
Basert på signalveianalysen fant vi at apoptose var den viktigste signalveien, så vi undersøkte om IPA-behandling ville påvirke apoptosen til HSC-er in vitro. Vi har tidligere vist at forskjellige doser IPA (10 μM, 100 μM og 1 mM) ikke var giftige for LX-2-celler [15]. Denne studien viste at IPA-behandling ved 10 μM og 100 μM økte antallet levedyktige og nekrotiske celler. Sammenlignet med kontrollgruppen minket imidlertid cellelevedyktigheten ved 1 mM IPA-konsentrasjon, mens cellenekrosehastigheten forble uendret (figur 2A, B). For å finne den optimale konsentrasjonen for å indusere apoptose i LX-2-celler testet vi deretter 10 μM, 100 μM og 1 mM IPA i 24 timer (figur 2A-E og tilleggsfigur 3A-B). Interessant nok reduserte IPA 10 μM og 100 μM apoptoseraten (%), men IPA 1 mM økte sen apoptose og apoptoseraten (%) sammenlignet med kontrollgruppen og ble derfor valgt for videre eksperimenter (figur 2A–D).
IPA induserer apoptose av LX-2-celler. Annexin V og 7-AAD dobbeltfargingsmetoden ble brukt til å kvantifisere apoptoseraten og cellemorfologien ved hjelp av flowcytometri. BA-celler ble inkubert med 10 μM, 100 μM og 1 mM IPA i 24 timer eller med F–H TGF-β1 (5 ng/ml) og 1 mM IPA i serumfritt medium i 24 timer. A: levende celler (Annexin V -/ 7AAD-); B: nekrotiske celler (Annexin V -/ 7AAD+); C, F: tidlig (Annexin V +/ 7AAD-); D, G: sen (Annexin V+/7AAD.+); E, H: prosentandel av totale tidlige og sene apoptotiske celler i apoptoseraten (%). Data er uttrykt som gjennomsnitt ± SD, n = 3 uavhengige eksperimenter. Statistiske sammenligninger ble utført ved hjelp av enveis ANOVA med Bonferroni post hoc-test. *p < 0,05; ****p < 0,0001
Som vi har vist tidligere, kan 5 ng/ml TGF-β1 indusere HSC-aktivering ved å øke uttrykket av klassiske markørgener [15]. LX-2-celler ble behandlet med 5 ng/ml TGF-β1 og 1 mM IPA i kombinasjon (fig. 2E–H). TGF-β1-behandling endret ikke apoptoseraten, men samtidig behandling med IPA økte sen apoptose og apoptoseraten (%) sammenlignet med TGF-β1-behandling (fig. 2E–H). Disse resultatene indikerer at 1 mM IPA kan fremme apoptose i LX-2-celler uavhengig av TGF-β1-induksjon.
Vi undersøkte videre effekten av IPA på mitokondriell respirasjon i LX-2-celler. Resultatene viste at 1 mM IPA reduserte parametrene for oksygenforbruksrate (OCR): ikke-mitokondriell respirasjon, basal og maksimal respirasjon, protonlekkasje og ATP-produksjon sammenlignet med kontrollgruppen (figur 3A, B), mens den bioenergetiske helseindeksen (BHI) ikke endret seg.
IPA reduserer mitokondriell respirasjon i LX-2-celler. Den mitokondrielle respirasjonskurven (OCR) presenteres som mitokondrielle respirasjonsparametere (ikke-mitokondriell respirasjon, basal respirasjon, maksimal respirasjon, protonlekkasje, ATP-generering, SRC og BHI). Cellene A og B ble inkubert med henholdsvis 10 μM, 100 μM og 1 mM IPA i 24 timer. Cellene C og D ble inkubert med henholdsvis TGF-β1 (5 ng/ml) og 1 mM IPA i serumfritt medium i 24 timer. Alle målinger ble normalisert til DNA-innhold ved bruk av CyQuant-settet. BHI: bioenergetisk helseindeks; SRC: respiratorisk reservekapasitet; OCR: oksygenforbruksrate. Data presenteres som gjennomsnitt ± standardavvik (SD), n = 5 uavhengige eksperimenter. Statistiske sammenligninger ble utført ved bruk av enveis ANOVA og Bonferroni post hoc-test. *p < 0,05; **p < 0,01; og ***p < 0,001
For å få en mer omfattende forståelse av effekten av IPA på den bioenergetiske profilen til TGF-β1-aktiverte LX-2-celler, analyserte vi mitokondriell oksidativ fosforylering ved OCR (fig. 3C, D). Resultatene viste at TGF-β1-behandling kunne redusere maksimal respirasjon, respiratorisk reservekapasitet (SRC) og BHI sammenlignet med kontrollgruppen (fig. 3C, D). I tillegg reduserte kombinasjonsbehandlingen basal respirasjon, protonlekkasje og ATP-produksjon, men SRC og BHI var betydelig høyere enn de som ble behandlet med TGF-β1 (fig. 3C, D).
Vi utførte også «Cellular Energy Phenotype Test» levert av Seahorse-programvaren (tilleggsfigur 4A–D). Som vist i tilleggsfigur 3B, ble både OCR- og ECAR-metabolske potensialer redusert etter TGF-β1-behandling. Det ble imidlertid ikke observert noen forskjell i kombinasjons- og IPA-behandlingsgruppene sammenlignet med kontrollgruppen. Videre ble både basale og stressnivåer av OCR redusert etter kombinasjons- og IPA-behandling sammenlignet med kontrollgruppen (tilleggsfigur 4C). Interessant nok ble et lignende mønster observert med kombinasjonsbehandling, hvor det ikke ble observert noen endring i basale og stressnivåer av ECAR sammenlignet med TGF-β1-behandling (tilleggsfigur 4C). I HSC-er endret ikke reduksjonen i mitokondriell oksidativ fosforylering og kombinasjonsbehandlingens evne til å gjenopprette SCR og BHI etter eksponering for TGF-β1-behandling det metabolske potensialet (OCR og ECAR). Samlet sett indikerer disse resultatene at IPA kan redusere bioenergetikk i HSC-er, noe som tyder på at IPA kan indusere en lavere energiprofil som forskyver HSC-fenotypen mot inaktivering (tilleggsfigur 4D).
Effekten av IPA på mitokondriedynamikk ble undersøkt ved hjelp av tredimensjonal kvantifisering av mitokondriemorfologi og nettverksforbindelser samt MTR-farging (figur 4 og tilleggsfigur 5). Figur 4 viser at TGF-β1-behandling, sammenlignet med kontrollgruppen, reduserte gjennomsnittlig overflateareal, antall grener, total grenlengde og antall grenforbindelser (figur 4A og B) og endret andelen mitokondrier fra sfærisk til intermediær morfologi (figur 4C). Bare IPA-behandling reduserte gjennomsnittlig mitokondrievolum og endret andelen mitokondrier fra sfærisk til intermediær morfologi sammenlignet med kontrollgruppen (figur 4A). I ​​motsetning til dette forble sfærisitet, gjennomsnittlig grenlengde og mitokondrieaktivitet vurdert ved mitokondriemembranpotensialavhengig MTR (figur 4A og E) uendret, og disse parametrene var ikke forskjellige mellom gruppene. Samlet sett tyder disse resultatene på at TGF-β1- og IPA-behandling ser ut til å modulere mitokondrieform og -størrelse samt nettverkskompleksitet i levende LX-2-celler.
IPA endrer mitokondriedynamikk og mitokondrie-DNA-forekomst i LX-2-celler. A. Representative konfokale bilder av levende LX-2-celler inkubert med TGF-β1 (5 ng/ml) og 1 mM IPA i 24 timer i serumfritt medium som viser mitokondrienettverk farget med Mitotracker™ Red CMXRos og kjerner farget blå med DAPI. Alle data inneholdt minst 15 bilder per gruppe. Vi kjøpte 10 Z-stack-bilder for hver prøvetype. Hver Z-aksesekvens inneholdt 30 skiver, hver med en tykkelse på 9,86 μm. Skala: 10 μm. B. Representative objekter (kun mitokondrier) identifisert ved å bruke adaptiv terskelverdi på bildet. Kvantitativ analyse og sammenligning av mitokondrie-morfologiske nettverksforbindelser ble utført for alle celler i hver gruppe. C. Frekvens av mitokondrieformforhold. Verdier nær 0 indikerer sfæriske former, og verdier nær 1 indikerer filamentøse former. D Mitokondrie-DNA (mtDNA)-innhold ble bestemt som beskrevet i Materialer og metoder. E Mitotracker™ Red CMXRos-analyse ble utført ved hjelp av flowcytometri (30 000 hendelser) som beskrevet i Materialer og metoder. Data presenteres som gjennomsnitt ± SD, n = 3 uavhengige eksperimenter. Statistiske sammenligninger ble utført ved hjelp av enveis ANOVA og Bonferroni post hoc-test. *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001; ****p < 0,0001
Deretter analyserte vi mtDNA-innholdet i LX-2-celler som en indikator på mitokondrietallet. Sammenlignet med kontrollgruppen var mtDNA-innholdet økt i gruppen som ble behandlet med TGF-β1 (figur 4D). Sammenlignet med gruppen som ble behandlet med TGF-β1 var mtDNA-innholdet redusert i gruppen som fikk kombinasjonsbehandling (figur 4D), noe som tyder på at IPA kan redusere mtDNA-innholdet og muligens mitokondrietallet samt mitokondrierespirasjon (figur 3C). Dessuten så IPA ut til å redusere mtDNA-innholdet i kombinasjonsbehandlingen, men påvirket ikke MTR-mediert mitokondrieaktivitet (figur 4A–C).
Vi undersøkte sammenhengen mellom IPA og mRNA-nivåene av gener assosiert med fibrose, apoptose, overlevelse og mitokondriedynamikk i LX-2-celler (figur 5A–D). Sammenlignet med kontrollgruppen viste gruppen som ble behandlet med TGF-β1 økt uttrykk av gener som kollagen type I α2-kjede (COL1A2), α-glattmuskelaktin (αSMA), matriksmetalloproteinase 2 (MMP2), vevshemmer av metalloproteinase 1 (TIMP1) og dynamin 1-lignende gen (DRP1), noe som indikerer økt fibrose og aktivering. Sammenlignet med kontrollgruppen reduserte TGF-β1-behandling dessuten mRNA-nivåene av nukleær pregnan X-reseptor (PXR), caspase 8 (CASP8), MAPKAPK3, hemmer av B-celle α, forsterker av nukleær faktor κ-genets lyspeptid (NFκB1A) og hemmer av nukleær faktor κB-kinase-subenhet β (IKBKB) (figur 5A–D). Sammenlignet med TGF-β1-behandling reduserte kombinasjonsbehandling med TGF-β1 og IPA uttrykket av COL1A2 og MMP2, men økte mRNA-nivåene av PXR, TIMP1, B-celle lymfom-2 (BCL-2), CASP8, NFκB1A, NFκB1-β og IKBKB. IPA-behandling reduserte uttrykket av MMP2, Bcl-2-assosiert protein X (BAX), AKT1, optisk atrofiprotein 1 (OPA1) og mitokondrielt fusjonsprotein 2 (MFN2) signifikant, mens uttrykket av CASP8, NFκB1A, NFκB1B og IKBKB var økt sammenlignet med kontrollgruppen. Imidlertid ble det ikke funnet noen forskjell i uttrykket av caspase-3 (CASP3), apoptotisk peptidaseaktiverende faktor 1 (APAF1), mitokondrielt fusjonsprotein 1 (MFN1) og fisjonsprotein 1 (FIS1). Samlet sett tyder disse resultatene på at IPA-behandling modulerer uttrykket av gener assosiert med fibrose, apoptose, overlevelse og mitokondriedynamikk. Våre data tyder på at IPA-behandling reduserer fibrose i LX-2-celler; samtidig stimulerer den overlevelse ved å endre fenotypen mot inaktivering.
IPA modulerer uttrykket av fibroblast-, apoptotiske, levedyktighets- og mitokondrielle dynamikkgener i LX-2-celler. Histogrammer viser mRNA-uttrykk i forhold til endogen kontroll (RPLP0 eller PPIA) etter at LX-2-celler ble indusert med TGF-β1 og IPA i serumfritt medium i 24 timer. A indikerer fibroblaster, B indikerer apoptotiske celler, C indikerer overlevende celler, og D indikerer mitokondrielle dynamikkgenuttrykk. Data presenteres som gjennomsnitt ± standardavvik (SD), n = 3 uavhengige eksperimenter. Statistiske sammenligninger ble utført ved hjelp av enveis ANOVA og Bonferroni post hoc-test. *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001; ****p < 0,0001
Deretter ble endringer i cellestørrelse (FSC-H) og cytoplasmisk kompleksitet (SSC-H) vurdert ved hjelp av flowcytometri (figur 6A, B), og endringer i cellemorfologi etter IPA-behandling ble vurdert ved hjelp av transmisjonselektronmikroskopi (TEM) og fasekontrastmikroskopi (tilleggsfigur 6A-B). Som forventet økte cellene i den TGF-β1-behandlede gruppen i størrelse sammenlignet med kontrollgruppen (figur 6A, B), noe som viser den klassiske utvidelsen av grovt endoplasmatisk retikulum (ER*) og fagolysosomer (P), noe som indikerer aktivering av hematopoietiske stamceller (HSC) (tilleggsfigur 6A). Sammenlignet med den TGF-β1-behandlede gruppen ble imidlertid cellestørrelsen, cytoplasmisk kompleksitet (fig. 6A, B) og ER*-innholdet redusert i gruppen som fikk kombinasjonsbehandling med TGF-β1 og IPA (tilleggsfigur 6A). Videre reduserte IPA-behandling cellestørrelsen, cytoplasmisk kompleksitet (fig. 6A, B), P- og ER*-innholdet (tilleggsfigur 6A) sammenlignet med kontrollgruppen. I tillegg økte innholdet av apoptotiske celler etter 24 timer med IPA-behandling sammenlignet med kontrollgruppen (hvite piler, tilleggsfigur 6B). Samlet sett tyder disse resultatene på at 1 mM IPA kan stimulere HSC-apoptose og reversere endringene i cellemorfologiske parametere indusert av TGF-β1, og dermed regulere cellestørrelsen og kompleksiteten, noe som kan være assosiert med HSC-inaktivering.
IPA endrer cellestørrelse og cytoplasmisk kompleksitet i LX-2-celler. Representative bilder av flowcytometrianalyse. Analysen brukte en gatingstrategi spesifikk for LX-2-celler: SSC-A/FSC-A for å definere cellepopulasjonen, FSC-H/FSC-A for å identifisere dubletter, og SSC-H/FSC-H for cellestørrelses- og kompleksitetsanalyse. Cellene ble inkubert med TGF-β1 (5 ng/ml) og 1 mM IPA i serumfritt medium i 24 timer. LX-2-celler ble fordelt i nedre venstre kvadrant (SSC-H-/FSC-H-), øvre venstre kvadrant (SSC-H+/FSC-H-), nedre høyre kvadrant (SSC-H-/FSC-H+) og øvre høyre kvadrant (SSC-H+/FSC-H+) for cellestørrelses- og cytoplasmisk kompleksitetsanalyse. B. Cellemorfologi ble analysert ved flowcytometri ved bruk av FSC-H (forward scatter, cellestørrelse) og SSC-H (sidespredning, cytoplasmisk kompleksitet) (30 000 hendelser). Data presenteres som gjennomsnitt ± SD, n = 3 uavhengige eksperimenter. Statistiske sammenligninger ble utført ved bruk av enveis ANOVA og Bonferroni post hoc-test. *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001 og ****p < 0,0001
Tarmmetabolitter som IPA har blitt et hett forskningstema, noe som tyder på at nye mål kan bli oppdaget i tarmmikrobiotaen. Det er derfor interessant at IPA, en metabolitt som vi har koblet til leverfibrose hos mennesker [15], har vist seg å være en potensiell antifibrotisk forbindelse i dyremodeller [13, 14]. Her demonstrerer vi for første gang en sammenheng mellom serum-IPA og global levertranskriptomikk og DNA-metylering hos overvektige individer uten type 2-diabetes (T2D), noe som fremhever apoptose, mitofagi og levetid, samt et mulig kandidatgen AKT1 som regulerer leverhomeostase. En annen nyhet i studien vår er at vi demonstrerte interaksjonen mellom IPA-behandling og apoptose, cellemorfologi, mitokondriell bioenergetikk og dynamikk i LX-2-celler, noe som indikerer et lavere energispektrum som forskyver HSC-fenotypen mot inaktivering, noe som gjør IPA til en potensiell kandidat for å forbedre leverfibrose.
Vi fant at apoptose, mitofagi og levetid var de viktigste kanoniske signalveiene beriket i levergener assosiert med sirkulerende serum-IPA. Forstyrrelse av mitokondriekvalitetskontrollsystemet (MQC) kan føre til mitokondriell dysfunksjon, mitofagi og apoptose, og dermed fremme forekomsten av MASLD [33, 34]. Derfor kan vi spekulere i at IPA kan være involvert i å opprettholde celledynamikk og mitokondrieintegritet gjennom apoptose, mitofagi og levetid i leveren. Våre data viste at to gener var vanlige på tvers av de tre analysene: YKT6 og AKT1. Det er verdt å merke seg at YKT6 er et SNARE-protein involvert i prosessen med cellemembranfusjon. Det spiller en rolle i autofagi og mitofagi ved å danne et initieringskompleks med STX17 og SNAP29 på autofagosomet, og dermed fremme fusjonen av autofagosomer og lysosomer [35]. Videre fører tap av YKT6-funksjon til svekket mitofagi[36], mens oppregulering av YKT6 er assosiert med progresjonen av hepatocellulært karsinom (HCC), noe som viser økt celleoverlevelse[37]. På den annen side er AKT1 det viktigste interagerende genet og spiller en viktig rolle i leversykdommer, inkludert PI3K/AKT-signalveien, cellesyklus, cellemigrasjon, proliferasjon, fokal adhesjon, mitokondriefunksjon og kollagensekresjon[38–40]. Aktivert PI3K/AKT-signalvei kan aktivere hematopoietiske stamceller (HSC-er), som er cellene som er ansvarlige for produksjonen av ekstracellulær matriks (ECM), og dens dysregulering kan bidra til forekomst og progresjon av leverfibrose[40]. I tillegg er AKT en av de viktigste celleoverlevelsesfaktorene som hemmer p53-avhengig celleapoptose, og AKT-aktivering kan være assosiert med hemming av levercelleapoptose[41, 42]. De oppnådde resultatene tyder på at IPA kan være involvert i levermitokondrierassosiert apoptose ved å påvirke hepatocytters beslutning om å gå inn i apoptose eller overlevelse. Disse effektene kan reguleres av AKT- og/eller YKT6-kandidatgener, som er kritiske for leverhomeostase.
Resultatene våre viste at 1 mM IPA induserte apoptose og reduserte mitokondriell respirasjon i LX-2-celler uavhengig av TGF-β1-behandling. Det er verdt å merke seg at apoptose er en viktig vei for fibroseoppløsning og aktivering av hematopoietiske stamceller (HSC), og er også en nøkkelhendelse i den reversible fysiologiske responsen på leverfibrose [4, 43]. Videre ga restaureringen av BHI i LX-2-celler etter kombinasjonsbehandling ny innsikt i den potensielle rollen til IPA i reguleringen av mitokondriell bioenergetikk. Under hvile- og inaktive forhold bruker hematopoietiske celler normalt mitokondriell oksidativ fosforylering for å produsere ATP og har lav metabolsk aktivitet. På den annen side forbedrer HSC-aktivering mitokondriell respirasjon og biosyntese for å kompensere for energibehovet ved å gå inn i glykolytisk tilstand [44]. Det faktum at IPA ikke påvirket metabolsk potensial og ECAR antyder at den glykolytiske veien er mindre prioritert. Tilsvarende viste en annen studie at 1 mM IPA var i stand til å modulere mitokondriell respirasjonskjedeaktivitet i kardiomyocytter, humane hepatocyttcellelinjer (Huh7) og humane navleveneendotelceller (HUVEC); Imidlertid ble det ikke funnet noen effekt av IPA på glykolyse i kardiomyocytter, noe som tyder på at IPA kan påvirke bioenergetikken til andre celletyper [45]. Derfor spekulerer vi i at 1 mM IPA kan fungere som en mild kjemisk frakobler, siden det kan redusere fibrogen genuttrykk, cellemorfologi og mitokondriell bioenergetikk betydelig uten å endre mengden mtDNA [46]. Mitokondrielle frakoblere kan hemme kulturindusert fibrose og HSC-aktivering [47] og redusere mitokondriell ATP-produksjon regulert eller indusert av visse proteiner som frakoblingsproteiner (UCP) eller adeninnukleotidtranslokase (ANT). Avhengig av celletypen kan dette fenomenet beskytte celler mot apoptose og/eller fremme apoptose [46]. Imidlertid er det behov for ytterligere studier for å belyse rollen til IPA som en mitokondriell frakobler i hematopoietisk stamcelleinaktivering.
Vi undersøkte deretter om endringene i mitokondriell respirasjon gjenspeiles i mitokondriemorfologien i levende LX-2-celler. Interessant nok endrer TGF-β1-behandling mitokondrieproporsjonen fra sfærisk til intermediær, med redusert mitokondrieforgrening og økt uttrykk av DRP1, en nøkkelfaktor i mitokondriefisjon [48]. Videre er mitokondriefragmentering assosiert med generell nettverkskompleksitet, og overgangen fra fusjon til fisjon er kritisk for aktivering av hematopoietiske stamceller (HSC), mens hemming av mitokondriefisjon fører til HSC-apoptose [49]. Resultatene våre indikerer dermed at TGF-β1-behandling kan indusere en reduksjon i mitokondrienettverkskompleksitet med redusert forgrening, noe som er mer vanlig i mitokondriefisjon assosiert med aktiverte hematopoietiske stamceller (HSC-er). Videre viste dataene våre at IPA kunne endre andelen mitokondrier fra sfærisk til intermediær form, og dermed redusere uttrykket av OPA1 og MFN2. Studier har vist at nedregulering av OPA1 kan forårsake en reduksjon i mitokondriemembranpotensial og utløse celleapoptose [50]. MFN2 er kjent for å mediere mitokondriefusjon og apoptose [51]. De oppnådde resultatene tyder på at induksjon av LX-2-celler av TGF-β1 og/eller IPA ser ut til å modulere mitokondrieform og -størrelse, samt aktiveringstilstand og nettverkskompleksitet.
Resultatene våre indikerer at kombinasjonsbehandlingen av TGFβ-1 og IPA kan redusere mtDNA og cellemorfologiske parametere ved å regulere mRNA-ekspresjonen av fibrose, apoptose og overlevelsesrelaterte gener i apoptose-unnvikende celler. IPA reduserte faktisk mRNA-ekspresjonsnivået av AKT1 og viktige fibrosegener som COL1A2 og MMP2, men økte ekspresjonsnivået av CASP8, som er assosiert med apoptose. Resultatene våre viste at etter IPA-behandling reduserte BAX-ekspresjonen og mRNA-ekspresjonen av TIMP1-familiens underenheter, BCL-2 og NF-κB økte, noe som tyder på at IPA kan stimulere overlevelsessignaler i hematopoietiske stamceller (HSC-er) som unngår apoptose. Disse molekylene kan fungere som pro-overlevelsessignaler i aktiverte hematopoietiske stamceller, noe som kan være assosiert med økt ekspresjon av anti-apoptotiske proteiner (som Bcl-2), redusert ekspresjon av pro-apoptotisk BAX og et komplekst samspill mellom TIMP og NF-κB [5, 7]. IPA utøver sine effekter gjennom PXR, og vi fant at kombinasjonsbehandling med TGF-β1 og IPA økte PXR mRNA-ekspresjonsnivåene, noe som indikerer undertrykkelse av HSC-aktivering. Aktivert PXR-signalering er kjent for å hemme HSC-aktivering både in vivo og in vitro [52, 53]. Resultatene våre indikerer at IPA kan delta i clearance av aktiverte HSC-er ved å fremme apoptose, redusere fibrose og mitokondriell metabolisme, og forbedre overlevelsessignaler, som er typiske prosesser som konverterer den aktiverte HSC-fenotypen til en inaktivert. En annen mulig forklaring på den potensielle mekanismen og rollen til IPA i apoptose er at den fanger opp dysfunksjonelle mitokondrier primært gjennom mitofagi (intrinsisk signalvei) og den ekstrinsiske TNF-signalveien (tabell 1), som er direkte knyttet til NF-κB-overlevelsessignalveien (tilleggsfigur 7). Interessant nok er IPA-relaterte berikede gener i stand til å indusere pro-apoptotiske og pro-overlevelsessignaler i den apoptotiske banen [54], noe som tyder på at IPA kan indusere den apoptotiske banen eller overlevelse ved å samhandle med disse genene. Hvordan IPA induserer apoptose eller overlevelse under HSC-aktivering og dens mekanistiske veier er imidlertid fortsatt uklare.
IPA er en mikrobiell metabolitt dannet fra tryptofan i kosten via tarmfloraen. Studier har vist at den har betennelsesdempende, antioksidant- og epigenetiske regulatoriske egenskaper i tarmmiljøet.[55] Studier har vist at IPA kan modulere tarmbarrierefunksjonen og redusere oksidativt stress, noe som kan bidra til dens lokale fysiologiske effekter.[56] Faktisk transporteres IPA til målorganer via sirkulasjonen, og siden IPA deler en lignende hovedmetabolittstruktur med tryptofan, serotonin og indolderivater, utøver IPA metabolske virkninger som resulterer i konkurrerende metabolske skjebner.[52] IPA kan konkurrere med tryptofan-avledede metabolitter om bindingssteder på enzymer eller reseptorer, noe som potensielt forstyrrer normale metabolske veier. Dette understreker behovet for ytterligere studier av dens farmakokinetikk og farmakodynamikk for å bedre forstå dets terapeutiske vindu.[57] Det gjenstår å se om dette også kan forekomme i hematopoietiske stamceller (HSC-er).
Vi erkjenner at studien vår har noen begrensninger. For spesifikt å undersøke assosiasjoner relatert til IPA, ekskluderte vi pasienter med type 2 diabetes mellitus (T2DM). Vi erkjenner at dette begrenser den brede anvendeligheten av funnene våre til pasienter med type 2 diabetes mellitus og avansert leversykdom. Selv om den fysiologiske konsentrasjonen av IPA i humant serum er 1–10 μM [11, 20], ble en konsentrasjon på 1 mM IPA valgt basert på den høyeste ikke-toksiske konsentrasjonen [15] og den høyeste apoptoseraten, uten forskjell i prosentandelen av nekrotiske cellepopulasjoner. Selv om suprafysiologiske nivåer av IPA ble brukt i denne studien, er det for øyeblikket ingen enighet om den effektive dosen av IPA [52]. Selv om resultatene våre er signifikante, er den bredere metabolske skjebnen til IPA fortsatt et aktivt forskningsområde. Dessuten ble funnene våre om sammenhengen mellom serum-IPA-nivåer og DNA-metylering av levertranskripter ikke bare oppnådd fra hematopoietiske stamceller (HSC-er), men også fra levervev. Vi valgte å bruke humane LX-2-celler basert på våre tidligere funn fra transkriptomanalyse om at IPA er assosiert med aktivering av hematopoietiske stamceller (HSC) [15], og HSC-er er de viktigste cellene involvert i utviklingen av leverfibrose. Leveren består av flere celletyper, så andre cellemodeller som hepatocytt-HSC-immuncelle-kokultursystem kombinert med caspase-aktivering og DNA-fragmentering, samt virkningsmekanismen inkludert proteinnivå, bør vurderes for å studere rollen til IPA og dens interaksjon med andre levercelletyper.