Takk for at du besøker nature.com. Nettleserversjonen du bruker har begrenset CSS-støtte. For best mulig opplevelse anbefaler vi at du bruker den nyeste nettleserversjonen (eller slår av kompatibilitetsmodus i Internet Explorer). I tillegg, for å sikre fortsatt støtte, vil ikke dette nettstedet inkludere stiler eller JavaScript.
Hydrogensulfid (H2S) har flere fysiologiske og patologiske effekter på menneskekroppen. Natriumhydrosulfid (NaHS) er mye brukt som et farmakologisk verktøy for å evaluere effektene av H2S i biologiske eksperimenter. Selv om tapet av H2S fra NaHS-løsninger bare tar noen få minutter, har NaHS-løsninger blitt brukt som donorforbindelser for H2S i drikkevann i noen dyrestudier. Denne studien undersøkte om drikkevann med en NaHS-konsentrasjon på 30 μM fremstilt i rotte-/museflasker kunne forbli stabilt i minst 12–24 timer, som foreslått av noen forfattere. Lag en løsning av NaHS (30 μM) i drikkevann og hell den umiddelbart i rotte-/musevannflasker. Prøver ble samlet fra tuppen og innsiden av vannflasken etter 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 12 og 24 timer for å måle sulfidinnholdet ved hjelp av metylenblåttmetoden. I tillegg ble hann- og hunnrotter injisert med NaHS (30 μM) i to uker, og serumsulfidkonsentrasjoner ble målt annenhver dag i løpet av den første uken og på slutten av den andre uken. NaHS-løsningen i prøven tatt fra tuppen av vannflasken var ustabil; den minket med 72 % og 75 % etter henholdsvis 12 og 24 timer. I prøver tatt fra innsiden av vannflaskene var reduksjonen i NaHS ikke signifikant innen 2 timer; den minket imidlertid med 47 % og 72 % etter henholdsvis 12 og 24 timer. NaHS-injeksjon påvirket ikke serumsulfidnivået hos hann- og hunnrotter. Avslutningsvis bør ikke NaHS-løsninger fremstilt fra drikkevann brukes til H2S-donasjon fordi løsningen er ustabil. Denne administrasjonsveien vil eksponere dyr for uregelmessige og mindre enn forventede mengder NaHS.
Hydrogensulfid (H2S) har blitt brukt som et giftstoff siden 1700. Imidlertid ble dets mulige rolle som et endogent biosignalmolekyl beskrevet av Abe og Kimura i 1996. I løpet av de siste tre tiårene har en rekke funksjoner til H2S i ulike menneskelige systemer blitt belyst, noe som har ført til erkjennelsen av at H2S-donormolekyler kan ha kliniske anvendelser i behandling eller håndtering av visse sykdommer. Se Chirino et al. for en nylig gjennomgang.
Natriumhydrosulfid (NaHS) har blitt mye brukt som et farmakologisk verktøy for å vurdere effektene av H2S i mange cellekultur- og dyrestudier5,6,7,8. NaHS er imidlertid ikke en ideell H2S-donor fordi det raskt omdannes til H2S/HS- i løsning, lett forurenses med polysulfider og lett oksideres og fordampes4,9. I mange biologiske eksperimenter løses NaHS opp i vann, noe som resulterer i passiv fordampning og tap av H2S10,11,12, spontan oksidasjon av H2S11,12,13 og fotolyse14. Sulfid i den opprinnelige løsningen går tapt veldig raskt på grunn av fordampning av H2S11. I en åpen beholder er halveringstiden (t1/2) for H2S omtrent 5 minutter, og konsentrasjonen synker med omtrent 13 % per minutt10. Selv om tapet av hydrogensulfid fra NaHS-løsninger bare tar noen få minutter, har noen dyrestudier brukt NaHS-løsninger som en kilde til hydrogensulfid i drikkevann i 1–21 uker, og erstattet den NaHS-holdige løsningen hver 12.–24. time.15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26 Denne praksisen er ikke i samsvar med prinsippene for vitenskapelig forskning, siden medikamentdoseringer bør være basert på bruken av dem i andre arter, spesielt mennesker.27
Preklinisk forskning innen biomedisin har som mål å forbedre kvaliteten på pasientbehandling eller behandlingsresultater. Resultatene fra de fleste dyrestudier har imidlertid ennå ikke blitt oversatt til mennesker28,29,30. En av årsakene til denne translasjonsfeilen er mangelen på oppmerksomhet til den metodologiske kvaliteten på dyrestudier30. Målet med denne studien var derfor å undersøke om 30 μM NaHS-løsninger tilberedt i rotte-/musevannflasker kunne forbli stabile i drikkevann i 12–24 timer, slik det hevdes eller antydes i noen studier.
Alle eksperimentene i denne studien ble utført i samsvar med de publiserte retningslinjene for stell og bruk av forsøksdyr i Iran31. Alle eksperimentelle rapporter i denne studien fulgte også ARRIVE-retningslinjene32. Etikkomiteen ved Institute of Endocrine Sciences, Shahid Beheshti University of Medical Sciences, godkjente alle eksperimentelle prosedyrer i denne studien.
Sinkacetatdihydrat (CAS: 5970-45-6) og vannfritt jernklorid (CAS: 7705-08-0) ble kjøpt fra Biochem, Chemopahrama (Cosne-sur-Loire, Frankrike). Natriumhydrosulfidhydrat (CAS: 207683-19-0) og N,N-dimetyl-p-fenylendiamin (DMPD) (CAS: 535-47-0) ble kjøpt fra Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). Isofluran ble kjøpt fra Piramal (Bethlehem, PA, USA). Saltsyre (HCl) ble kjøpt fra Merck (Darmstadt, Tyskland).
Lag en løsning av NaHS (30 μM) i drikkevann og hell den umiddelbart i rotte-/musevannflaskene. Denne konsentrasjonen ble valgt basert på en rekke publikasjoner som bruker NaHS som kilde til H2S; se diskusjonsdelen. NaHS er et hydrert molekyl som kan inneholde varierende mengder hydrert vann (dvs. NaHS•xH2O); ifølge produsenten var prosentandelen NaHS som ble brukt i vår studie 70,7 % (dvs. NaHS•1,3 H2O), og vi tok hensyn til denne verdien i våre beregninger, der vi brukte en molekylvekt på 56,06 g/mol, som er molekylvekten til vannfri NaHS. Hydrert vann (også kalt krystallisasjonsvann) er vannmolekylene som utgjør den krystallinske strukturen33. Hydrater har forskjellige fysiske og termodynamiske egenskaper sammenlignet med anhydrater34.
Før du tilsetter NaHS i drikkevannet, mål pH og temperatur på løsningsmidlet. Hell NaHS-løsningen umiddelbart i rotte-/musevannflasken i dyreburet. Prøver ble samlet fra spissen og fra innsiden av vannflasken etter 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 12 og 24 timer for å måle sulfidinnholdet. Sulfidmålinger ble tatt umiddelbart etter hver prøvetaking. Vi tok prøver fra spissen av røret fordi noen studier har vist at den lille porestørrelsen i vannrøret kan minimere H2S-fordampning15,19. Dette problemet ser ut til å gjelde løsningen i flasken også. Dette var imidlertid ikke tilfelle for løsningen i halsen på vannflasken, som hadde en høyere fordampningshastighet og var autooksiderende; faktisk drakk dyrene dette vannet først.
Hann- og hunnrotter av Wistar ble brukt i studien. Rottene ble plassert i polypropylenbur (2–3 rotter per bur) under standardforhold (temperatur 21–26 °C, fuktighet 32–40 %) med 12 timer lys (kl. 07.00 til 19.00) og 12 timer mørke (kl. 19.00 til 07.00). Rottene hadde fri tilgang til vann fra springen og ble fôret med standardfôr (Khorak Dam Pars Company, Teheran, Iran). Aldersmatchede (6 måneder) hunnrotter (n=10, kroppsvekt: 190–230 g) og hannrotter (n=10, kroppsvekt: 320–370 g) av Wistar ble tilfeldig delt inn i kontrollgrupper og grupper behandlet med NaHS (30 μM) (n=5 per gruppe). For å bestemme utvalgsstørrelsen brukte vi KISS-tilnærmingen (Keep It Simple, Stupid), som kombinerer tidligere erfaring og styrkeanalyse35. Vi utførte først en pilotstudie på 3 rotter og bestemte gjennomsnittlig serum totalsulfidnivå og standardavvik (8,1 ± 0,81 μM). Deretter, med 80 % styrke og et tosidig signifikansnivå på 5 %, bestemte vi en foreløpig utvalgsstørrelse (n = 5 basert på tidligere litteratur) som tilsvarte en standardisert effektstørrelse på 2,02 med den forhåndsdefinerte verdien foreslått av Festing for å beregne utvalgsstørrelsen for forsøksdyr35. Etter å ha multiplisert denne verdien med SD (2,02 × 0,81), var den predikerte detekterbare effektstørrelsen (1,6 μM) 20 %, noe som er akseptabelt. Dette betyr at n = 5/gruppe er tilstrekkelig til å oppdage en gjennomsnittlig endring på 20 % mellom gruppene. Rotter ble tilfeldig delt inn i kontroll- og NaSH-behandlede grupper ved hjelp av den tilfeldige funksjonen i Excel-programvaren36 (tilleggsfigur 1). Blinding ble utført på utfallsnivå, og forskerne som utførte de biokjemiske målingene var ikke klar over gruppetildelingene.
NaHS-gruppene av begge kjønn ble behandlet med 30 μM NaHS-løsning tilberedt i drikkevann i 2 uker. Fersk løsning ble tilført hver 24. time, og i løpet av denne tiden ble kroppsvekten målt. Blodprøver ble samlet fra halespissene til alle rotter under isoflurananestesi annenhver dag på slutten av den første og andre uken. Blodprøvene ble sentrifugert ved 3000 g i 10 minutter, serum ble separert og lagret ved –80 °C for påfølgende måling av serumurea, kreatinin (Cr) og totalt sulfid. Serumurea ble bestemt ved enzymatisk ureasemetode, og serumkreatinin ble bestemt ved fotometrisk Jaffe-metode ved bruk av kommersielt tilgjengelige sett (Man Company, Teheran, Iran) og en automatisk analysator (Selectra E, serienummer 0-2124, Nederland). Intra- og interassay-variasjonskoeffisientene for urea og Cr var mindre enn 2,5 %.
Metylenblått (MB)-metoden brukes til å måle totalt sulfid i drikkevann og serum som inneholder NaHS; MB er den mest brukte metoden for å måle sulfid i bulkløsninger og biologiske prøver11,37. MB-metoden kan brukes til å estimere den totale sulfidmengden38 og måle uorganiske sulfider i form av H2S, HS- og S2 i den vandige fasen39. I denne metoden utfelles svovel som sinksulfid (ZnS) i nærvær av sinkacetat11,38. Sinkacetatutfelling er den mest brukte metoden for å separere sulfider fra andre kromoforer11. ZnS ble gjenoppløst ved bruk av HCl11 under sterkt sure forhold. Sulfidet reagerer med DMPD i et støkiometrisk forhold på 1:2 i en reaksjon katalysert av jernklorid (Fe3+ fungerer som et oksidasjonsmiddel) for å danne fargestoffet MB, som detekteres spektrofotometrisk ved 670 nm40,41. Deteksjonsgrensen for MB-metoden er omtrent 1 μM11.
I denne studien ble 100 μL av hver prøve (løsning eller serum) tilsatt et rør; deretter ble 200 μL sinkacetat (1 % w/v i destillert vann), 100 μL DMPD (20 mM i 7,2 M HCl) og 133 μL FeCl3 (30 mM i 1,2 M HCl) tilsatt. Blandingen ble inkubert ved 37 °C i mørket i 30 minutter. Løsningen ble sentrifugert ved 10 000 g i 10 minutter, og absorbansen til supernatanten ble avlest ved 670 nm ved hjelp av en mikroplateleser (BioTek, MQX2000R2, Winooski, VT, USA). Sulfidkonsentrasjoner ble bestemt ved hjelp av en kalibreringskurve av NaHS (0–100 μM) i ddH2O (tilleggsfigur 2). Alle løsninger som ble brukt til målingene var ferskt fremstilt. Intra- og interassay-variasjonskoeffisientene for sulfidmålinger var henholdsvis 2,8 % og 3,4 %. Vi bestemte også den totale sulfiden som ble gjenvunnet fra natriumtiosulfatholdige drikkevanns- og serumprøver ved hjelp av den berikede prøvemetoden42. Gjenvinningen for natriumtiosulfatholdige drikkevanns- og serumprøver var henholdsvis 91 ± 1,1 % (n = 6) og 93 ± 2,4 % (n = 6).
Statistisk analyse ble utført ved hjelp av GraphPad Prism-programvareversjon 8.0.2 for Windows (GraphPad Software, San Diego, CA, USA, www.graphpad.com). En paret t-test ble brukt til å sammenligne temperatur og pH i drikkevann før og etter tilsetning av NaHS. Tapet av H2S i den NaHS-holdige løsningen ble beregnet som en prosentvis reduksjon fra baseline-opptak, og for å vurdere om tapet var statistisk signifikant, utførte vi en enveis repeated-measures ANOVA etterfulgt av Dunnetts multiple comparison test. Kroppsvekt, serumurea, serumkreatinin og totalt serumsulfid over tid ble sammenlignet mellom kontroll- og NaHS-behandlede rotter av forskjellige kjønn ved hjelp av en toveis blandet (mellom-innen) ANOVA etterfulgt av en Bonferroni post hoc-test. Tosidige P-verdier < 0,05 ble ansett som statistisk signifikante.
Drikkevannets pH var 7,60 ± 0,01 før tilsetning av NaHS og 7,71 ± 0,03 etter tilsetning av NaHS (n = 13, p = 0,0029). Temperaturen på drikkevannet var 26,5 ± 0,2 og sank til 26,2 ± 0,2 etter tilsetning av NaHS (n = 13, p = 0,0128). Tilbered 30 μM NaHS-løsning i drikkevann og oppbevar den i en vannflaske. NaHS-løsningen er ustabil, og konsentrasjonen avtar over tid. Ved prøvetaking fra halsen på vannflasken ble det observert en signifikant reduksjon (68,0 %) i løpet av den første timen, og NaHS-innholdet i løsningen sank med 72 % og 75 % etter henholdsvis 12 og 24 timer. I prøver hentet fra vannflasker var reduksjonen i NaHS ikke signifikant opptil 2 timer, men etter 12 og 24 timer hadde den sunket med henholdsvis 47 % og 72 %. Disse dataene indikerer at prosentandelen NaHS i en 30 μM løsning fremstilt i drikkevann hadde sunket til omtrent en fjerdedel av startverdien etter 24 timer, uavhengig av prøvetakingssted (figur 1).
Stabilitet av NaHS-løsning (30 μM) i drikkevann i rotte-/museflasker. Etter tilberedning av løsningen ble det tatt prøver fra spissen og det indre av vannflasken. Data presenteres som gjennomsnitt ± SD (n = 6/gruppe). * og #, P < 0,05 sammenlignet med tid 0. Fotografiet av vannflasken viser spissen (med åpning) og flaskens kropp. Spissvolumet er omtrent 740 μL.
Konsentrasjonen av NaHS i den nylagde 30 μM-løsningen var 30,3 ± 0,4 μM (område: 28,7–31,9 μM, n = 12). Etter 24 timer sank imidlertid konsentrasjonen av NaHS til en lavere verdi (gjennomsnitt: 3,0 ± 0,6 μM). Som vist i figur 2 var ikke konsentrasjonene av NaHS som rottene ble eksponert for konstante i løpet av studieperioden.
Kroppsvekten til hunnrotter økte betydelig over tid (fra 205,2 ± 5,2 g til 213,8 ​​± 7,0 g i kontrollgruppen og fra 204,0 ± 8,6 g til 211,8 ± 7,5 g i NaHS-behandlede gruppen). NaHS-behandling hadde imidlertid ingen effekt på kroppsvekten (fig. 3). Kroppsvekten til hannrotter økte betydelig over tid (fra 338,6 ± 8,3 g til 352,4 ± 6,0 g i kontrollgruppen og fra 352,4 ± 5,9 g til 363,2 ± 4,3 g i NaHS-behandlede gruppen). NaHS-behandling hadde imidlertid ingen effekt på kroppsvekten (fig. 3).
Endringer i kroppsvekt hos hunn- og hannrotter etter administrering av NaHS (30 μM). Data presenteres som gjennomsnitt ± SEM og ble sammenlignet ved hjelp av toveis blandet (innenfor-mellom) variansanalyse med Bonferroni post hoc-test. n = 5 av hvert kjønn i hver gruppe.
Serumkonsentrasjonene av urea og kreatinfosfat var sammenlignbare hos kontrollrotter og NaSH-behandlede rotter gjennom hele studien. Videre påvirket ikke NaSH-behandling serumkonsentrasjonene av urea og kreatinkrom (tabell 1).
Baseline serumkonsentrasjoner av totale sulfid var sammenlignbare mellom kontroll og NaHS-behandlede hannrotter (8,1 ± 0,5 μM vs. 9,3 ± 0,2 μM) og hunnrotter (9,1 ± 1,0 μM vs. 6,1 ± 1,1 μM). NaHS-administrasjon i 14 dager hadde ingen effekt på serumnivåer av totale sulfid hos verken hann- eller hunnrotter (fig. 4).
Endringer i serumkonsentrasjoner av totale sulfidverdier hos hann- og hunnrotter etter administrering av NaHS (30 μM). Data presenteres som gjennomsnitt ± SEM og ble sammenlignet ved hjelp av en toveis blandet (innenfor-innen) variansanalyse med Bonferroni post hoc-test. Hvert kjønn, n = 5/gruppe.
Hovedkonklusjonen i denne studien er at drikkevann som inneholder NaHS er ustabilt: bare omtrent en fjerdedel av det opprinnelige totale sulfidinnholdet kan detekteres 24 timer etter prøvetaking fra spissen og innsiden av rotte-/musevannflasker. Videre ble rotter utsatt for ustabile NaHS-konsentrasjoner på grunn av tap av H2S i NaHS-løsningen, og tilsetning av NaHS til drikkevann påvirket ikke kroppsvekt, serumurea og kreatinkrom, eller totalt serumsulfid.
I denne studien var tapsraten for H2S fra 30 μM NaHS-løsninger fremstilt i drikkevann omtrent 3 % per time. I en bufret løsning (100 μM natriumsulfid i 10 mM PBS, pH 7,4) ble det rapportert at sulfidkonsentrasjonen minket med 7 % over tid i løpet av 8 timer. Vi har tidligere forsvart intraperitoneal administrering av NaHS ved å rapportere at tapsraten for sulfid fra en 54 μM NaHS-løsning i drikkevann var omtrent 2,3 % per time (4 %/time i løpet av de første 12 timene og 1,4 %/time i løpet av de siste 12 timene etter tilberedning)8. Tidligere studier43 fant et konstant tap av H2S fra NaHS-løsninger, hovedsakelig på grunn av fordampning og oksidasjon. Selv uten tilsetning av bobler går sulfid i stamløsningen raskt tapt på grunn av H2S-fordampning11. Studier har vist at under fortynningsprosessen, som tar omtrent 30–60 sekunder, går omtrent 5–10 % av H2S tapt på grunn av fordampning6. For å forhindre fordampning av H2S fra løsningen har forskere tatt flere tiltak, inkludert forsiktig omrøring av løsningen12, dekking av stamløsningen med plastfilm6 og minimering av løsningens eksponering for luft, siden hastigheten på H2S-fordampningen avhenger av luft-væske-grensesnittet.13 Spontan oksidasjon av H2S skjer hovedsakelig på grunn av overgangsmetallioner, spesielt jern(III)-jern, som er urenheter i vann.13 Oksidasjon av H2S resulterer i dannelse av polysulfider (svovelatomer bundet sammen av kovalente bindinger)11. For å unngå oksidasjon, fremstilles løsninger som inneholder H2S i deoksygenerte løsningsmidler44,45 og deretter renses med argon eller nitrogen i 20–30 minutter for å sikre deoksygenering.11,12,37,44,45,46 Dietylentriaminpentaeddiksyre (DTPA) er en metallchelator (10–4 M) som forhindrer HS--autooksidasjon i aerobe løsninger. I fravær av DTPA er autooksidasjonshastigheten for HS- omtrent 50 % over omtrent 3 timer ved 25 °C37,47. Siden oksidasjonen av 1e-sulfid katalyseres av ultrafiolett lys, bør løsningen dessuten lagres på is og beskyttes mot lys11.
Som vist i figur 5, dissosierer NaHS til Na+ og HS-6 når det løses opp i vann. Denne dissosiasjonen bestemmes av pK1 i reaksjonen, som er temperaturavhengig: pK1 = 3,122 + 1132/T, hvor T varierer fra 5 til 30 °C og måles i grader Kelvin (K), K = °C + 273,1548. HS- har en høy pK2 (pK2 = 19), så ved pH < 96,49 dannes ikke S2- eller dannes det i svært små mengder. I motsetning til dette fungerer HS- som en base og aksepterer H+ fra et H2O-molekyl, og H2O fungerer som en syre og omdannes til H2S og OH-.
Dannelse av oppløst H2S-gass i NaHS-løsning (30 µM). aq, vandig løsning; g, gass; l, væske. Alle beregninger forutsetter at vannets pH = 7,0 og vanntemperatur = 20 °C. Laget med BioRender.com.
Til tross for bevis på at NaHS-løsninger er ustabile, har flere dyrestudier brukt NaHS-løsninger i drikkevann som en H2S-donorforbindelse15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26 med intervensjonsvarigheter fra 1 til 21 uker (tabell 2). I løpet av disse studiene ble NaHS-løsningen fornyet hver 12., 15., 17., 18., 24., 25. eller 24., 19., 20., 21., 22., 23. time. Resultatene våre viste at rotter ble utsatt for ustabile medikamentkonsentrasjoner på grunn av tap av H2S fra NaHS-løsningen, og NaHS-innholdet i rotters drikkevann svingte betydelig over 12 eller 24 timer (se figur 2). To av disse studiene rapporterte at H2S-nivåene i vann forble stabile over 24 timer22, eller at bare 2–3 % H2S-tap ble observert over 12 timer15, men de ga ikke støttende data eller måledetaljer. To studier har vist at den lille diameteren på vannflasker kan minimere H2S-fordampning15,19. Resultatene våre viste imidlertid at dette kanskje bare forsinker H2S-tapet fra en vannflaske med 2 timer i stedet for 12–24 timer. Begge studiene bemerker at vi antar at NaHS-nivået i drikkevannet ikke endret seg fordi vi ikke observerte en fargeendring i vannet. Derfor var oksidasjon av H2S med luft ikke signifikant19,20. Overraskende nok vurderer denne subjektive metoden stabiliteten til NaHS i vann i stedet for å måle endringen i konsentrasjonen over tid.
Tapet av H2S i NaHS-løsning er relatert til pH og temperatur. Som nevnt i vår studie, resulterer oppløsning av NaHS i vann i dannelsen av en alkalisk løsning50. Når NaHS løses opp i vann, avhenger dannelsen av oppløst H2S-gass av pH-verdien6. Jo lavere pH i løsningen er, desto større er andelen NaHS som er tilstede som H2S-gassmolekyler, og desto mer sulfid går tapt fra den vandige løsningen11. Ingen av disse studiene rapporterte pH-verdien i drikkevann brukt som løsemiddel for NaHS. I henhold til WHOs anbefalinger, som er vedtatt av de fleste land, bør pH-verdien i drikkevann være i området 6,5–8,551. I dette pH-området øker hastigheten på spontan oksidasjon av H2S omtrent ti ganger13. Oppløsning av NaHS i vann i dette pH-området vil resultere i en oppløst H2S-gasskonsentrasjon på 1 til 22,5 μM, noe som understreker viktigheten av å overvåke pH-verdien i vannet før oppløsning av NaHS. I tillegg ville temperaturområdet rapportert i studien ovenfor (18–26 °C) resultere i en endring i konsentrasjonen av oppløst H2S-gass i løsningen på omtrent 10 %, siden temperaturendringer endrer pK1, og små endringer i pK1 kan ha en betydelig innvirkning på konsentrasjonen av oppløst H2S-gass48. I tillegg forverrer den lange varigheten av noen studier (5 måneder)22, hvor store temperaturvariasjoner forventes, også dette problemet.
Alle studier unntatt én21 brukte 30 μM NaHS-løsning i drikkevann. For å forklare dosen som ble brukt (dvs. 30 μM), påpekte noen forfattere at NaHS i vannfasen produserer nøyaktig samme konsentrasjon av H2S-gass, og at det fysiologiske området for H2S er 10 til 100 μM, så denne dosen er innenfor det fysiologiske området15,16. Andre forklarte at 30 μM NaHS kan opprettholde plasmanivået av H2S innenfor det fysiologiske området, dvs. 5–300 μM19,20. Vi vurderer konsentrasjonen av NaHS i vann på 30 μM (pH = 7,0, T = 20 °C), som ble brukt i noen studier for å studere effektene av H2S. Vi kan beregne at konsentrasjonen av oppløst H2S-gass er 14,7 μM, som er omtrent 50 % av den opprinnelige NaHS-konsentrasjonen. Denne verdien er lik verdien beregnet av andre forfattere under de samme forholdene13,48.
I vår studie endret ikke NaHS-administrasjon kroppsvekten; dette resultatet er i samsvar med resultatene fra andre studier på hannmus22,23 og hannrotter18. Imidlertid rapporterte to studier at NaSH gjenopprettet den reduserte kroppsvekten hos nefrektomiserte rotter24,26, mens andre studier ikke rapporterte effekten av NaSH-administrasjon på kroppsvekt15,16,17,19,20,21,25. Videre påvirket ikke NaSH-administrasjon serumurea- og kreatinkromnivåene i vår studie, noe som er i samsvar med resultatene fra en annen rapport25.
Studien fant at tilsetning av NaHS til drikkevann i 2 uker ikke påvirket totale serumsulfidkonsentrasjoner hos hann- og hunnrotter. Dette funnet er i samsvar med resultatene til Sen et al. (16): 8 ukers behandling med 30 μM NaHS i drikkevann påvirket ikke plasmasulfidnivåene hos kontrollrotter; de rapporterte imidlertid at denne intervensjonen gjenopprettet de reduserte H2S-nivåene i plasma hos nefrektomiserte mus. Li et al. (22) rapporterte også at behandling med 30 μM NaHS i drikkevann i 5 måneder økte plasmanivåene av fritt sulfid hos eldre mus med omtrent 26 %. Andre studier har ikke rapportert endringer i sirkulerende sulfid etter tilsetning av NaHS til drikkevann.
Syv studier rapporterte bruk av Sigma NaHS15,16,19,20,21,22,23, men ga ikke ytterligere detaljer om hydreringsvannet, og fem studier nevnte ikke kilden til NaHS som ble brukt i fremstillingsmetodene deres17,18,24,25,26. NaHS er et hydrert molekyl, og innholdet av hydreringsvann kan variere, noe som påvirker mengden NaHS som kreves for å fremstille en løsning med en gitt molaritet. For eksempel var NaHS-innholdet i vår studie NaHS•1,3 H2O. Dermed kan de faktiske NaHS-konsentrasjonene i disse studiene være lavere enn de som er rapportert.
«Hvordan kan en så kortlivet forbindelse ha en så langvarig effekt?» Pozgay et al.21 stilte dette spørsmålet da de evaluerte effekten av NaHS på kolitt hos mus. De håper at fremtidige studier vil kunne svare på dette spørsmålet og spekulere i at NaHS-løsninger kan inneholde mer stabile polysulfider i tillegg til H2S og disulfider som medierer effekten av NaHS21. En annen mulighet er at svært lave konsentrasjoner av NaHS som er igjen i løsningen også kan ha en gunstig effekt. Faktisk ga Olson et al. bevis for at mikromolare nivåer av H2S i blodet ikke er fysiologiske og bør være i det nanomolare området eller være helt fraværende13. H2S kan virke gjennom proteinsulfatering, en reversibel posttranslasjonell modifikasjon som påvirker funksjonen, stabiliteten og lokaliseringen av mange proteiner52,53,54. Faktisk er omtrent 10 % til 25 % av mange leverproteiner sulfylert53 under fysiologiske forhold. Begge studiene anerkjenner den raske nedbrytningen av NaHS19,23, men slår overraskende fast at «vi kontrollerte konsentrasjonen av NaHS i drikkevann ved å erstatte det daglig».23 Én studie slo ved et uhell fast at «NaHS er en standard H2S-donor og brukes ofte i klinisk praksis for å erstatte selve H2S».18
Diskusjonen ovenfor viser at NaHS går tapt fra løsningen gjennom fordampning, oksidasjon og fotolyse, og det gis derfor noen forslag for å redusere tapet av H2S fra løsningen. For det første avhenger fordampningen av H2S av gass-væske-grensesnittet13 og pH-verdien i løsningen11. For å minimere fordampningstapet kan derfor halsen på vannflasken gjøres så liten som mulig som beskrevet tidligere15,19, og pH-verdien i vannet kan justeres til en akseptabel øvre grense (dvs. 6,5–8,551) for å minimere fordampningstapet11. For det andre skjer spontan oksidasjon av H2S på grunn av effekten av oksygen og tilstedeværelsen av overgangsmetallioner i drikkevann13, så deoksygenering av drikkevann med argon eller nitrogen44,45 og bruk av metallchelatorer37,47 kan redusere oksidasjonen av sulfider. For det tredje, for å forhindre fotodekomponering av H2S, kan vannflasker pakkes inn i aluminiumsfolie; Denne praksisen gjelder også for lysfølsomme materialer som streptozotocin55. Til slutt kan uorganiske sulfidsalter (NaHS, Na2S og CaS) administreres via sonde i stedet for å løses opp i drikkevann, som tidligere rapportert56,57,58. Studier har vist at radioaktivt natriumsulfid administrert via sonde til rotter absorberes godt og distribueres til praktisk talt alle vev59. Til dags dato har de fleste studier administrert uorganiske sulfidsalter intraperitonealt. Denne veien brukes imidlertid sjelden i kliniske settinger60. På den annen side er oral vei den vanligste og foretrukne administreringsveien hos mennesker61. Derfor anbefaler vi å evaluere effektene av H2S-donorer hos gnagere ved oral sonde.
En begrensning er at vi målte sulfid i vandig løsning og serum ved hjelp av MB-metoden. Metodene for måling av sulfid inkluderer jodtitrering, spektrofotometri, elektrokjemisk metode (potensiometri, amperometri, coulometrisk metode og amperometrisk metode) og kromatografi (gasskromatografi og høytrykksvæskekromatografi), hvorav den mest brukte metoden er MB-spektrofotometrisk metode62. En begrensning med MB-metoden for måling av H2S i biologiske prøver er at den måler alle svovelholdige forbindelser og ikke fritt H2S63 fordi den utføres under sure forhold, noe som resulterer i ekstraksjon av svovel fra den biologiske kilden64. I følge American Public Health Association er imidlertid MB standardmetoden for måling av sulfid i vann65. Derfor påvirker ikke denne begrensningen våre hovedresultater om ustabiliteten til løsninger som inneholder NaHS. Videre var gjenvinningen av sulfidmålinger i vann- og serumprøver som inneholder NaHS i vår studie henholdsvis 91 % og 93 %. Disse verdiene er i tråd med tidligere rapporterte områder (77–92)66, noe som indikerer akseptabel analytisk presisjon42. Det er verdt å merke seg at vi brukte både hann- og hunnrotter i samsvar med retningslinjene fra National Institutes of Health (NIH) for å unngå overdreven avhengighet av studier kun på hannrotter i prekliniske studier67 og for å inkludere både hann- og hunnrotter når det er mulig68. Dette poenget har blitt understreket av andre69,70,71.
Avslutningsvis indikerer resultatene av denne studien at NaHS-løsninger fremstilt fra drikkevann ikke kan brukes til å generere H2S på grunn av deres ustabilitet. Denne administreringsveien ville eksponere dyr for ustabile og lavere enn forventede nivåer av NaHS; derfor er funnene kanskje ikke anvendelige på mennesker.
Datasettene som ble brukt og/eller analysert i løpet av den nåværende studien er tilgjengelige fra den korresponderende forfatteren på rimelig forespørsel.
Szabo, K. Tidslinje for forskning på hydrogensulfid (H2S): fra miljøtoksin til biologisk mediator. Biokjemi og farmakologi 149, 5–19. https://doi.org/10.1016/j.bcp.2017.09.010 (2018).
Abe, K. og Kimura, H. Mulig rolle for hydrogensulfid som en endogen nevromodulator. Journal of Neuroscience, 16, 1066–1071. https://doi.org/10.1523/JNEUROSCI.16-03-01066.1996 (1996).
Chirino, G., Szabo, C. og Papapetropoulos, A. Hydrogensulfids fysiologiske rolle i pattedyrceller, vev og organer. Reviews in Physiology and Molecular Biology 103, 31–276. https://doi.org/10.1152/physrev.00028.2021 (2023).
Dillon, KM, Carrazzone, RJ, Matson, JB, og Kashfi, K. Utviklende løfter om cellulære leveringssystemer for nitrogenoksid og hydrogensulfid: en ny æra innen personlig medisin. Biochemistry and Pharmacology 176, 113931. https://doi.org/10.1016/j.bcp.2020.113931 (2020).
Sun, X., et al. Langvarig administrering av en hydrogensulfiddonor med langsom frigjøring kan forhindre myokardisk iskemi/reperfusjonsskade. Scientific reports 7, 3541. https://doi.org/10.1038/s41598-017-03941-0 (2017).
Sitdikova, GF, Fuchs, R., Kainz, W., Weiger, TM og Hermann, A. BK-kanalfosforylering regulerer hydrogensulfid (H2S)-følsomhet. Frontiers in Physiology 5, 431. https://doi.org/10.3389/fphys.2014.00431 (2014).
Sitdikova, GF, Weiger, TM og Hermann, A. Hydrogensulfid forsterker aktiviteten til kalsiumaktiverte kalium (BK)-kanaler i hypofysetumorceller hos rotter. Archit. Pfluegers. 459, 389–397. https://doi.org/10.1007/s00424-009-0737-0 (2010).
Jeddy, S., et al. Hydrogensulfid forsterker den beskyttende effekten av nitritt mot myokardisk iskemi-reperfusjonsskade hos rotter med type 2 diabetikk. Nitrogenoksid 124, 15–23. https://doi.org/10.1016/j.niox.2022.04.004 (2022).
Corvino, A., et al. Trender i H2S-donorkjemi og dens innvirkning på hjerte- og karsykdommer. Antioxidants 10, 429. https://doi.org/10.3390/antiox10030429 (2021).
DeLeon, ER, Stoy, GF, og Olson, KR (2012). Passive tap av hydrogensulfid i biologiske eksperimenter. Analytical Biochemistry 421, 203–207. https://doi.org/10.1016/j.ab.2011.10.016 (2012).
Nagy, P., et al. Kjemiske aspekter ved hydrogensulfidmålinger i fysiologiske prøver. Biochimica et Biophysical Acta 1840, 876–891. https://doi.org/10.1016/j.bbagen.2013.05.037 (2014).
Kline, LL.D. Spektrofotometrisk bestemmelse av hydrogensulfid i naturlige vann. Limnol. Oceanogr. 14, 454–458. https://doi.org/10.4319/lo.1969.14.3.0454 (1969).
Olson, KR (2012). Praktisk opplæring i kjemi og biologi av hydrogensulfid. «Antioksidanter.» Redox Signaling. 17, 32–44. https://doi.org/10.1089/ars.2011.4401 (2012).