Proteinsortering i sekretorisk vei er viktig for å opprettholde cellekompartmentalisering og homeostase. I tillegg til skallmediert sortering er lipiders rolle i kinesinsortering i prosessen med sekretorisk transport et langvarig grunnleggende spørsmål som ennå ikke er besvart. Her utfører vi samtidig 3D flerfarget høyoppløselig sanntidsavbildning for å bevise in vivo at nylig syntetiserte glykosylfosfatidylinositol-immobiliserte proteiner med svært lange ceramidlipidenheter er gruppert og klassifisert i spesialiserte endoplasmaer Net exit-sted, som er forskjellig fra det som brukes av transmembrane proteiner. I tillegg viser vi at kjedelengden til ceramid i det endoplasmatiske retikulummembranen er kritisk for denne sorteringsselektiviteten. Vår studie gir det første direkte in vivo-beviset for å klassifisere proteinlaster basert på lipidkjedelengde i selektive eksportsteder i sekretorisk vei.
I eukaryote celler blir proteinene som syntetiseres i endoplasmatisk retikulum (ER) deretter sortert under transport gjennom den sekretoriske veien for levering til deres passende cellulære destinasjon (1). I tillegg til kappemediert sortering har det lenge vært spekulert i at visse lipider også kan tjene som selektive utgangspunkter ved å gruppere dem i spesifikke membrandomener som spesifikke proteiner (2-5). Imidlertid mangler det fortsatt direkte in vivo-bevis for å bevise denne mulige lipidbaserte mekanismen. For å løse dette grunnleggende problemet studerte vi i gjær hvordan glykosylfosfatidylinositol (GPI)-forankrede proteiner (GPI-AP) eksporteres differensielt fra ER. GPI-AP er en rekke lipidforbundne celleoverflateproteiner (6, 7). GPI-AP er et utskilt protein festet til de ytre bladene på plasmamembranen gjennom glykolipiddelen (GPI-anker). De aksepterer GPI-ankre som konservative posttranslasjonelle modifikasjoner i ER-lumen (8). Etter binding passerer GPI-AP gjennom Golgi-apparatet (5, 9) fra ER til plasmamembranen. Tilstedeværelsen av GPI-ankre fører til at GPI-AP transporteres separat fra transmembranutskilte proteiner (inkludert andre plasmamembranproteiner) langs den sekretoriske veien (5, 9, 10). I gjærceller separeres GPI-AP fra andre utskilte proteiner i endoplasmatisk retikulum, og pakkes deretter inn i unike vesikler innpakket i kappeproteinkompleks II (COPII) (6, 7). Determinantene for denne klassifiseringsprosessen i ER-eksportprosessen er uklare, men det spekuleres i at denne mekanismen kan kreve lipider, spesielt den strukturelle ombyggingen av lipiddelen av GPI-ankeret (5, 8). I gjær begynner GPI-lipidombyggingen umiddelbart etter at GPI fester seg, og i mange tilfeller fører det til at ceramid binder seg til den 26-karbon langkjedede mettede fettsyren (C26:0) (11, 12). C26-ceramid er det viktigste ceramidet som produseres av gjærceller så langt. Det syntetiseres i ER, og mesteparten eksporteres til Golgi-apparatet gjennom COPII-vesikler (13). ER-eksporten av GPI-AP krever spesifikt kontinuerlig ceramidsyntese (14, 15), og omdannelsen av ceramid til inositolfosfatceramid (IPC) i Golgi-apparatet avhenger igjen av GPI-ankersyntese (16). Biofysiske studier med kunstige membraner har vist at svært lange acylkjedeceramider kan koalesere for å danne ordnede domener med unike fysiske egenskaper (17, 18). Disse dataene fører til hypotesen om at C26-ceramid og GPI-AP med C26-ceramid bruker sine fysiske egenskaper til å koalesere til ordnede regioner eller regioner i det relativt rotete ER-membranlipidmiljøet. Det består hovedsakelig av korte og umettede glyserolipider (C16:1 og C18:1) (19, 20). Disse regionene vil bli selektivt fokusert på spesifikke ER-utgangssteder (ERES), hvor ceramid og ceramidbasert GPI-AP kan samtransporteres til Golgi i den samme dedikerte COPII-vesikkelen (5).
I denne studien har vi direkte testet denne lipidbaserte mekanismen ved å bruke superoppløsningskonfokal sanntidsavbildningsmikroskopi (SCLIM), som er en banebrytende mikroskopiteknikk som samtidig kan observere fluorescensmerkede proteiner. De trefargede og tredimensjonale (3D) bildene har ekstremt høy oppløsning og hastighet i levende celler (21, 22).
Vi brukte først SCLIM-teknologi for å definere nærmere hvordan normal GPI-AP med C26-ceramidgruppen ble screenet fra transmembranutskilte proteiner etter å ha forlatt ER i S. cerevisiae. For å sjekke klassifiseringen av ER brukte vi et genetisk system som direkte kan visualisere nylig syntetisert last som kommer inn i ERES in vivo (7, 23). Som last valgte vi C26-ceramidbasert GPI-AP Gas1 merket med grønt fluorescerende protein (GFP) og transmembranutskilt protein Mid2 merket med nær-infrarødt fluorescerende protein (iRFP), som begge er rettet mot plasmamembranen (24–26). I den temperaturfølsomme mutanten sec31-1 uttrykkes disse to lastene under en galaktoseinduserbar promotor og en konstitutiv ERES-markør. Ved ekstrem temperatur (37 °C), fordi sec31-1-mutasjonen påvirker funksjonen til COPII-kappekomponenten Sec31 for å hemme COPII-spiring og ER-eksport, akkumuleres nylig syntetisert last ved ER (23). Etter avkjøling til lav temperatur (24 °C) gjenopprettet sec31-1-mutantcellene seg fra det sekretoriske området, og den akkumulerte nye syntetiske lasten begynte å bli eksportert fra ER. CLIM-visualisering viste at mesteparten av den nylig syntetiserte Gas1-GFP og Mid2-iRFP fortsatt akkumulerte seg i ER til sec31-1-mutantcellene etter inkubasjon ved 37 °C og deretter frigjort ved 24 °C i 5 minutter (figur 1). Siden Mid2-iRFP er fordelt på hele ER-membranen, og Gas1-GFP er konsentrert og samlet i det diskontinuerlige ER-membranområdet, er fordelingen deres helt forskjellig (figur 1, A til C og film S1). I tillegg, som vist i figur 1D, har ikke Gas1-GFP-klyngen Mid2-iRFP. Disse resultatene indikerer at GPI-AP og transmembranproteiner ble separert i forskjellige ER-membranregioner tidlig. Gas1-GFP-klyngen ligger ved siden av en spesifikk ERES merket med mCherrys COPII-kappeprotein Sec13 (figur 1, E og F, og film S1) (23).
sec31-1-celler uttrykker galaktoseinduserte sekresjoner, et lang acylkjedet (C26) ceramid GPI-AP Gas1-GFP (GPI-AP, grønn) og transmembranproteinet Mid2-iRFP (TMP, blå), og denne konstruktive ERES-merkingen Sec13-mCherry (ERES, magenta) ble inkubert ved 37 °C i 30 minutter, flyttet til 24 °C og avbildet med SCLIM 5 minutter senere. (A til C) viser et representativt sammenslått eller enkelt 2D-bilde av et plan (A), et 2D-projeksjonsbilde av 10 z-seksjoner (B) eller et 3D-cellehemisfærebilde av last og ERES-markører (C). Målestokk 1 μm (A og B). Skalaenheten er 0,551 μm (C). Gas1-GFP ble detektert i diskrete ER-regioner eller klynger, mens Mid2-iRFP ble detektert og distribuert gjennom ER-membranen (C). (D) Grafen viser den relative fluorescensintensiteten til Gas1-GFP og Mid2-iRFP i Gas1-GFP-klyngen langs den hvite pillinjen (venstre). AU, vilkårlig enhet. (E og F) representerer 3D-bildet som kombinerer varene og ERES-merket. Gas1-GFP-klynger ble oppdaget nær den spesifikke ERES. Skalaenheten er 0,551 μm. (F) Den hvite, heltrukne pilen markerer Gas1-GFP-klyngen assosiert med ERES. De midterste og høyre panelene viser det sammenslåtte, forstørrede 3D-bildet og en rotert visning av den valgte Gas1-GFP-klyngen.
Det nære romlige forholdet mellom Gas1-GFP-klyngen og en spesifikk ERES indikerer at Gas1-GFP kan komme inn i selektiv ERES, noe som er forskjellig fra selektiviteten som brukes av Mid2-iRFP for å forlate ER. For å undersøke denne muligheten kvantifiserte vi ERES-forholdet for bare én eller to varer (figur 2, A til C). Vi fant at de fleste ERES (70 %) bare inneholder én type last. Det nederste bildet i figur 2C viser to typiske eksempler på ERES med bare Gas1-GFP (figur 1) eller bare Mid2-iRFP (figur 2). I motsetning til dette inneholder omtrent 20 % av ERES to laster som overlapper hverandre i samme område. Det ble funnet at noe ERES (10 %) inneholdt to typer last, men de var isolert i tydelig forskjellige områder. Derfor viser denne statistiske analysen at etter at ER er eksportert, er GPI-AP Gas1-GFP og den transmembrane lasten Mid2-iRFP delt inn i forskjellige ERES (figur 2D). Denne sorteringseffektiviteten er svært konsistent med den tidligere biokjemiske analysen (6) og morfologiske bestemmelsen (7). Vi kan også observere oppførselen til den karantenesatte lasten som kommer inn i ERES (figur 2E og film S2). Figur 2E viser at bare en liten del av Gas1-GFP (panel 3) eller Mid2-iRFP (panel 4) kommer inn i ERES fra én side og er begrenset til et separat område. Panel 5 i figur 2E viser at Gas1-GFP og Mid2-iRFP noen ganger finnes i samme ERES, men de kommer inn fra forskjellige sider og er konsentrert i separate regioner som kan representere forskjellige COPII-vesikler. Vi bekreftet også at den observerte separasjonen og klassifiseringen av C26-ceramidbasert GPI-AP Gas1 som selektiv ERES er spesifikk fordi en annen transmembran sekresjonslast, det GFP-merkede plasmamembranproteinet Axl2 (27), viser lignende oppførsel som Mid2-iRFP. (Bilde S1 og film S3). Den nylig syntetiserte Axl2-GFP distribueres gjennom ER-membranen slik som Mid2-iRFP (figur S1, A og B), og er ko-lokalisert med Mid2-iRFP i de fleste ERES-er (figur S1, B til D). Panel 1 og 2 i figur 1. S1C viser to typiske eksempler på ERES der to transmembrane laster overlapper hverandre. I disse tilfellene kommer begge varene inn i ERES sammen (figur S1E, panel 3 og film S3).
Sec31-1-cellene som uttrykker galaktoseinduserbare sekresjoner, Gas1-GFP (GPI-AP, grønn) og Mid2-iRFP (TMP, blå) og konstitutiv ERES-merking Sec13-mCherry (ERES, magenta) ble plassert ved 37 °C. Etter inkubasjon i 30 minutter ved °C, flytt til 24 °C for å frigjøre sekresjonsblokken, og avbilde med SCLIM etter 20 minutter. (A til C) Representative 2D-projeksjonsbilder (A; skalalinje, 1 μm) eller 3D-cellehemisfærebilder (B og C; skalaenhet, 0,456 μm) av lasten og 10 z-snitt markert med ERES. Det nedre panelet i (B) og panelet i (C) viser behandlede bilder for kun å vise varene som er tilstede i ERES (magenta) [Gas1-GFP (grå) og Mid2-iRFP (lyseblå)]. (C) Åpen pil: ERES frakter bare ett kolli last (1 til 4). Grå pil: ERES inneholder segregert last (5). Hvit, heltrukket pil: ERES som inneholder samlokalisert last. Nedenfor: Den valgte enkelt-ERES inneholder bare Gas1-GFP (1) eller Mid2-iRFP (2). Målestokk, 100 nm. (D) Kvantifisering av fotomikrografen beskrevet i (C). Gjennomsnittlig prosentandel av ERES som bare inneholder én last (Gas1-GFP eller Mid2-iRFP), segregert last og overlappende last. I tre uavhengige eksperimenter, n = 432 i 54 celler. Feilstang = SD. Tosidig, uparret t-test. *** P = 0,0002. (E) 3D-bilde av valgt ERES av karantenelast merket med (C). Gas1-GFP (grønn) (3) eller Mid2-iRFP (blå) (4) kommer inn i ERES (magenta) fra én side og er begrenset til et lite område innenfor ERES. Noen ganger kommer begge typer last inn i samme ERES (5) fra samme side og er begrenset til et isolert område innenfor ERES. Skala bar, 100 nm.
Deretter testet vi en hypotese om at det lange acylkjedede ceramidet (C26) som er tilstede i ER-membranen driver den spesifikke grupperingen og sorteringen av Gas1 til selektiv ERES. Til dette formålet brukte vi en modifisert gjærstamme GhLag1, der de to endogene ceramidsyntasene Lag1 og Lac1 ble erstattet av GhLag1 (Lag1-homologen til bomull), noe som resulterte i en gjærstamme med en cellemembran-ceramidstamme kortere enn villtypen (figur 3A) (28). Massespektrometri (MS)-analyse viste at i villtypestammer er 95 % av det totale ceramidet svært langkjedet (C26) ceramid, mens i GhLag1 er 85 % av ceramidet svært langt (C18 og C16), bare 2 % av ceramidet svært langkjedet (C26) ceramid. Selv om C18- og C16-ceramidene er de viktigste ceramidene som er påvist i GhLag1-membranen så langt, bekreftet MS-analyse også at GPI-ankeret til Gas1-GFP uttrykt i GhLag1-stammen inneholder C26-ceramid, som er sammenlignbart med villtypelipider. Kvaliteten er den samme (fig. 3A) (26). Derfor betyr dette at ceramid-ombyggingsenzymet Cwh43 er svært selektivt for C26-ceramid, som vist i figur 26, og det inkorporerer fortrinnsvis GPI-ankeret fra en liten mengde C26-ceramid i GhLag1-stammen. S2 (29). Likevel inneholder cellemembranen til GhLag1 i utgangspunktet bare C18-C16-ceramid, mens Gas1-GFP fortsatt har C26-ceramid. Dette faktum gjør denne stammen til et ideelt verktøy for spesifikt å løse problemet med acylkjedelengden til membranceramid i ER. Den hypotetiske rollen til klasse og sortering. Deretter studerte vi først evnen til C26 Gas1-GFP til å akkumulere i klynger i GhLag1 med et temperaturfølsomt mutantallel av sec31-1 gjennom konvensjonell fluorescensmikroskopi, hvor bare den lange (C18-C16) kjeden finnes i ER-membranen Ceramid (fig. 3). Vi observerte at i sec31-1 var mesteparten av Gas1-GFP konsentrert i klynger, mens Gas1-GFP i sec31-1 GhLag1 med lang (C18-C16) lang ceramid ER-membran hovedsakelig ikke var klynget og distribuert i hele ER-membranen. For å være presis, fordi C26 ceramidbasert klynging er nært knyttet til spesifikk ERES (figur 1), undersøkte vi deretter om denne prosessen også kan involvere funksjonen til ER-eksportproteinmekanismen. GPI-AP bruker et spesielt COPII-system for ER-eksport, som aktivt reguleres av Ted1s strukturelle ombygging av glykandelen av GPI-ankeret (30, 31). Det rekombinante GPI-glykanet gjenkjennes deretter av det transmembrane cargoreseptor p24-komplekset, som igjen selektivt rekrutterer Lst1, som er en spesifikk isoform av den viktigste COPII-cargobindingssubenheten Sec24, og danner en GPI-AP-rik COPII. Vesikler er nødvendige (31-33). Derfor konstruerte vi en dobbelmutant som kombinerte delesjonen av disse enkeltproteinene (p24-komplekskomponenten Emp24, GPI-glykan-ombyggingsenzymet Ted1 og den spesifikke COPII-subenheten Lst1) med sec31-1-mutantstammen, og studerte om det er mulig å danne Gas1-klynge-GFP (figur 3). Vi observerte at i sec31-1emp24Δ og sec31-1ted1Δ er Gas1-GFP hovedsakelig uklynget og distribuert gjennom ER-membranen, som tidligere sett i sec31-1 GhLag1, mens i sec31-1lst1Δ er Gas1-GFP som sec31-1. Disse resultatene indikerer at i tillegg til tilstedeværelsen av C26-ceramid i ER-membranen, må grupperingen av Gas1-GFP også binde seg til p24-komplekset, og krever ikke spesifikk Lst1-rekruttering. Deretter utforsket vi muligheten for at kjedelengden til ceramid i ER-membranen kan regulere bindingen av Gas1-GFP til p24. Vi fant imidlertid at tilstedeværelsen av C18-C16-ceramid i membranen ikke påvirker GPI-glykanene som rekonstrueres av p24-komplekset (figur S3 og S4, A og B) eller bindingen til GPI-AP og eksportevnen til GPI-AP. Rekrutter COPII-subtype Lst1 (figur S4C). Derfor krever ikke C26-ceramidavhengig gruppering proteininteraksjoner med forskjellige ER-eksportproteinmekanismer, men støtter en alternativ sorteringsmekanisme drevet av lipidlengde. Deretter analyserte vi om ceramid-acylkjedelengden i ER-membranen er viktig for effektiv klassifisering av Gas1-GFP som selektiv ERES. Siden Gas1 i GhLag1-stammen med kortkjedet ceramid forlater ER og går inn i plasmamembranen (figur S5), tror vi at hvis sorteringen er drevet av lengden på ceramid-acylkjeden, kan Gas1 i GhLag1-stammen omdirigeres og krysses. ERES-varer med samme membran.
(A) Cellemembranen til GhLag1 inneholder hovedsakelig kortere C18-C16 ceramider, mens GPI-ankeret til Gas1-GFP fortsatt har samme C26 IPC som villtypeceller. Over: acylkjedelengdeanalyse av ceramid i cellemembranen til villtype (Wt) og GhLag1p-stammer ved massespektrometri (MS). Dataene representerer prosentandelen av totalt ceramid. Gjennomsnittet av tre uavhengige eksperimenter. Feillinje = SD. Tosidig uparret t-test. **** P <0,0001. Bunnpanel: MS-analyse av acylkjedelengden til IPC-en som er tilstede i Gas1-GFP (GPI-IPC) GPI-ankeret uttrykt i villtype- og GhLag1p-stammene. Dataene representerer prosentandelen av totalt IPC-signal. Gjennomsnitt av fem uavhengige eksperimenter. Feillinje = SD. Tosidig uparret t-test. ns, ikke viktig. P = 0,9134. (B) Fluorescensmikrografer av sec31-1, sec31-1 GhLag1, sec31-1emp24Δ, sec31-1ted1Δ og sec31-1lst1Δ celler som uttrykker galaktoseindusert Gas1-GFP ble inkubert ved 37 °C i 30 minutter og sendt videre til Utfør rutinemessig fluorescensmikroskopi etter 24 °C. Hvit pil: ER Gas1-GFP-klynge. Åpen pil: Ikke-klynget Gas1-GFP er fordelt på hele ER-membranen, og viser den karakteristiske ER-kjerneringenfargingen. Skalalinje, 5 μm. (C) Kvantifisering av fotomikrografen beskrevet i (B). Gjennomsnittlig prosentandel av celler med punktformet Gas1-GFP-struktur. I tre uavhengige eksperimenter, n≥300 celler. Feillinje = SD. Tosidig uparret t-test. **** P <0,0001.
For å løse dette problemet direkte, utførte vi SCLIM-visualisering av Gas1-GFP og Mid2-iRFP i GhLag1 med det temperaturfølsomme mutantallelet sec31-1 (figur 4 og film S4). Etter at ER ble beholdt ved 37 °C og deretter frigjort ved 24 °C, var mesteparten av den nylig syntetiserte Gas1-GFP ikke gruppert og distribuert gjennom ER-membranen, slik det ble observert av konvensjonelle mikroskoper (figur 4, A og B). I tillegg inkluderer en stor andel av ERES (67 %) to typer last som er samlokalisert i den (figur 4D). Panel 1 og 2 i figur 4C viser to typiske eksempler på ERES med overlappende Gas1-GFP og Mid2-GFP. I tillegg ble begge varene rekruttert til samme ERES (figur 4E, panel 3 og film S4). Derfor indikerer resultatene våre at lengden på ceramidacylkjeden i ER-membranen er en viktig determinant for ER-proteinaggregering og -klassifisering.
Sec31-1 GhLag1-celler som uttrykker galaktoseinduserte sekresjoner, Gas1-GFP (GPI-AP, grønn) og Mid2-iRFP (TMP, blå) og konstitutiv ERES-merket Sec13-mCherry (ERES, magenta). Inkuber ved 37 °C. Fortsett i 30 minutter, senk til 24 °C for å frigjøre sekresjoner, og avbilde med SCLIM etter 20 minutter. (A til C) Representative 2D-projeksjonsbilder (A; skalalinje, 1 μm) eller 3D-cellehemisfærebilder (B og C; skalaenhet, 0,45 μm) av de 10 z-seksjonene markert med last og ERES. Det nedre panelet i (B) og panelet i (C) viser behandlede bilder for kun å vise varene som er tilstede i ERES (magenta) [Gas1-GFP (grå) og Mid2-iRFP (lyseblå)]. (C) Hvit fylt pil: ERES, varer overlapper hverandre. Åpen pil: ERES inneholder bare ett element. Nedre panel: Den valgte ERES har overlappende varer (1 og 2) markert i (C). Målestokk, 100 nm. (D) Kvantifisering av fotomikrografen beskrevet i (C). I sec31-1 og sec31-1 GhLag1-enhetene er bare én last (Gas1-GFP eller Mid2-iRFP) inkludert, og gjennomsnittlig prosentandel av ERES for isolert last og overlappende last. I tre uavhengige eksperimenter, n = 432 i 54 celler (sec31-1) og n = 430 i 47 celler (sec31-1 GhLag1). Feilstang = SD. Tosidig uparret t-test. *** P = 0,0002 (sec31-1) og ** P = 0,0031 (sec31-1 GhLag1). (E) 3D-bilde av valgt ERES med overlappende last (3) markert i (C). Gas1-GFP (grønn) og Mid2-iRFP (blå) nærmer seg ERES (magenta) fra samme side og holder seg i samme ERES-begrensede område. Skala, 100 nm.
Denne studien gir direkte in vivo-bevis for at lipidbaserte proteinlaster klassifiseres til selektive eksportsteder i den sekretoriske veien, og avslører viktigheten av acylkjedelengde for klassifiseringsselektivitet. Ved å bruke en kraftig og banebrytende mikroskopiteknikk kalt SCLIM, demonstrerte vi den nylig syntetiserte Gas1-GFP (en viktig plasmamembran-GPI-AP med en veldig lang acylkjede (C26) ceramidlipiddel) i gjær. Regionene gruppert i diskrete ER-er er assosiert med spesifikke ERES, mens transmembranutskilte proteiner er fordelt over hele ER-membranen (figur 1). I tillegg går disse to typene varer selektivt inn i forskjellige ERES (figur 2). Acylkjedelengden til det cellulære ceramidet i membranen reduseres fra C26 til C18-C16, Gas1-GFP-klyngen forstyrres til den diskrete ER-regionen, og Gas1-GFP omdirigeres for å forlate ER med transmembranproteinet gjennom den samme ERES (figur 3 og figur 3). 4).
Selv om GPI-AP bruker en spesialisert proteinmekanisme for å forlate ER, fant vi at C26-ceramidavhengig separasjon ikke er avhengig av differensielle proteininteraksjoner som kan føre til ERES-spesialisering (figur S4 og S5). I stedet støtter funnene våre en alternativ klassifiseringsmekanisme drevet av lipidbasert proteinklynging og påfølgende eksklusjon av andre laster. Våre observasjoner indikerer at Gas1-GFP-regionen eller -klyngen assosiert med en spesifikk ERES mangler det transmembranutskilte proteinet Mid2-iRFP, noe som indikerer at den C26-ceramidavhengige GPI-AP-klyngen vil legge til rette for deres inntreden i den relevante ERES, og samtidig ekskludere transmembrane sekresjoner kommer inn i denne spesifikke ERES (figur 1 og 2). I motsetning til dette forårsaker ikke tilstedeværelsen av C18-C16-ceramider i ER-membranen at GPI-AP danner regioner eller klynger, så de ekskluderer eller erstatter ikke transmembranutskilte proteiner i den samme ERES (figur 3 og 4). Derfor foreslår vi at C26-ceramid driver separasjon og klassifisering ved å legge til rette for gruppering av proteiner knyttet til spesifikk ERES.
Hvordan oppnå denne C26-ceramidavhengige klyngingen i et spesifikt ER-område? Membranceramidets tendens til å separere lateralt kan føre til at GPI-AP og C26-ceramid danner små og umiddelbart ordnede lipider i det mer uregelmessige lipidmiljøet i ER-membranen som inneholder kortere og umettede glyserolipider. Kvalitetsklynger (17, 18). Disse små, midlertidige klyngene kan videre fusjoneres til større, mer stabile klynger etter binding til p24-komplekset (34). I samsvar med dette viste vi at C26 Gas1-GFP må samhandle med p24-komplekset for å danne større synlige klynger (figur 3). P24-komplekset er en heterozygot oligomer bestående av fire forskjellige p24-transmembranproteiner i gjær (35), som gir multivalent binding, noe som kan føre til kryssbinding av små GPI-AP-klynger, og dermed generere større stabile klynger (34). Samspillet mellom protein-ektodomenene til GPI-AP-er kan også bidra til aggregeringen deres, som vist under Golgi-transporten deres i polariserte epitelceller hos pattedyr (36). Når C18-C16-ceramid er tilstede i ER-membranen, vil det imidlertid ikke dannes store separate klynger når p24-komplekset binder seg til Gas1-GFP. Den underliggende mekanismen kan avhenge av de spesifikke fysiske og kjemiske egenskapene til det lange acylkjede-ceramidet. Biofysiske studier av kunstige membraner viser at selv om både lange (C24) og korte (C18-C16) acylkjede-ceramider kan forårsake faseseparasjon, er det bare lange acylkjede-ceramider (C24) som kan fremme høy krumning og filmbøying for å omforme filmen. Gjennom gjensidig referanse (17, 37, 38). Det har blitt vist at transmembranheliksen til TMED2, den humane homologen til Emp24, selektivt interagerer med C18-ceramidbasert sfingomyelin i de cytoplasmatiske lobulene (39). Ved hjelp av molekylærdynamikk (MD)-simuleringer fant vi at både C18- og C26-ceramider akkumuleres rundt de cytoplasmatiske lobulene i Emp24-transmembranheliksen, og de har lignende preferanser (figur S6). Det er verdt å merke seg at dette indikerer at transmembranheliksen til Emp24 kan føre til asymmetrisk fordeling av lipider i membranen. Dette er et nylig resultat basert på pattedyrceller. Lignende MD-simuleringer viser også tilstedeværelsen av eterlipider (40). Derfor spekulerer vi i at C26-ceramid i de to lobulene til ER26 er lokalt anriket. Når GPI-AP i luminal lobuli binder seg direkte til multivalent p24 og akkumulering av C26 ceramid rundt p24 i de cytoplasmatiske lobulene, kan det fremme den medfølgende proteinaggregeringen og membrankrumning som genereres gjennom fingrene (41), noe som fører til at GPI-AP separeres i atskilte regioner ved siden av ERES, noe som også favoriserer de svært buede områdene i ER-membranen (42). Tidligere rapporter støttet den foreslåtte mekanismen (43, 44). Den multivalente bindingen av oligolectiner, patogener eller antistoffer til ceramidbaserte glykosfingolipider (GSL) på plasmamembranen utløser stor GSL-aggregering, forbedrer faseseparasjon og forårsaker membrandeformasjon og internalisering (44). Iwabuchi etc. (43) Det ble funnet at i nærvær av lange (C24), men ikke korte (C16) acylkjeder, induserte den multivalente liganden bundet til GSL-laktosylceramid dannelsen av store klynger og membraninvaginasjon, og cytoplasmaets Lyn-medierte signaltransduksjon på bladene er interdigitert av acylkjeder i koblede nøytrofiler.
I polariserte epitelceller hos pattedyr kontrollerer konsentrasjonen av anti-Golgi-nettverket (TGN) til nivået av den apikale plasmamembranen separasjonen og sorteringen av GPI-AP (10, 45). Denne aggregeringen drives av GPI-AP-oligomerisering (36), men den kan også avhenge av ceramidkjedelengden vi finner i gjær. Selv om pattedyrs GPI-AP har et eterlipidbasert anker, og dens kjemiske struktur er svært forskjellig fra det svært lange acylkjedeceramidet, fant en nylig studie at begge lipidene har evolusjonært lignende fysiske og kjemiske egenskaper og funksjon (40). Derfor kan eterlipiddelen i pattedyrceller være lik C26-ceramidet i gjær, og dens rolle er å assosiere med det langkjedede ceramidet i membranen for å fremme GPI-AP-aggregering og sortering. Selv om denne muligheten fortsatt må testes direkte, støtter tidligere funn at transporten av det langkjedede acylkjedeceramidet til Golgi-legemet ikke utføres av cytoplasmatiske overføringsproteiner, men avhenger av syntesen av GPI-ankre som gjær. Derfor ser det ut til at den evolusjonære konservative mekanismen er i stand til selektivt å samtransportere ceramid med svært lang acylkjede og GPI-AP (13, 16, 20, 46, 47) i samme transportvesikkel.
I polariserte epitelcellesystemer hos gjær og pattedyr skjer GPI-AP-aggregering og separasjon fra andre plasmamembranproteiner før de når celleoverflaten. Paladino et al. (48) fant at på TGN til polariserte epitelceller hos pattedyr er GPI-AP-klynging ikke bare nødvendig for selektiv klassifisering av GPI-AP-er til den apikale plasmamembranen, men regulerer også klyngeorganiseringen av GPI-AP-er og dens biologiske aktivitet. Celleoverflate. I gjær viste denne studien at den C26-ceramidavhengige GPI-AP-klyngen på ER kan regulere klyngeorganiseringen og den funksjonelle aktiviteten til GPI-AP på plasmamembranen (24, 49). I samsvar med denne modellen er GhLag1-celler allergiske mot GPI-hemmere eller legemidler som påvirker celleveggens integritet (28), og behovet for funksjonelle Gas1-GFP-klynger (49) av spissceramidet som projiseres i paringen av gjærceller indikerer G​​​ Mulige fysiologiske konsekvenser av hLag1-celler. GPI-AP-feil. Videre testing av om den funksjonelle organiseringen av celleoverflaten har blitt programmert fra ER ved en sorteringsmetode basert på lipidlengde vil imidlertid være gjenstand for vår fremtidige forskning.
Saccharomyces cerevisiae-stammene som ble brukt i dette arbeidet er listet opp i tabell S1. MMY1583- og MMY1635-stammene av SCLIM for levende celleavbildning ble konstruert i bakgrunnen av W303. Disse stammene som uttrykker Sec13-mCherry med en fluorescerende proteintagg ble konstruert ved hjelp av en polymerasekjedereaksjon (PCR)-basert metode med pFA6a-plasmid som mal (23). Stammen som uttrykker Mid2-iRFP merket med fluorescerende protein under kontroll av GAL1-promotoren ble konstruert som følger. PCR-amplifisering av iRFP-KanMx-sekvens fra pKTiRFP-KAN-vektor (gave fra E. O'Shea, Addgene-plasmidnummer 64687; http://n2t.net/addgene: 64687; forskningsressursidentifikator (RRID): Addgene_64687) og satt inn i C-terminalen til endogen Mid2. Etter at Mid2-iRFP-genomsekvensen ble amplifisert og klonet inn i GAL1-promotoren, ble den integrert i Not I-Sac I-setet til integrasjonsplasmidet pRS306. Det resulterende plasmidet pRGS7 ble linearisert med Pst I for å integreres i URA3-lokuset.
Gas1-GFP-fusjonsgenet uttrykkes under kontroll av GAL1-promotoren i sentromerplasmidet (CEN), som er konstruert som følger. Gas1-GFP-sekvensen ble amplifisert ved PCR fra pRS416-GAS1-GFP-plasmidet (24) (gave fra L. Popolo) og klonet inn i Xma I–Xho I-setet til CEN-plasmidet pBEVY-GL LEU2 (gave fra C). Miller; Addgene-plasmidnummer 51225; http://n2t.net/addgene: 51225; RRID: Addgene_51225). Det resulterende plasmidet ble kalt pRGS6. Axl2-GFP-fusjonsgenet uttrykkes også under kontroll av GAL1-promotoren til pBEVY-GL LEU2-vektoren, og konstruksjonen er som følger. Axl2-GFP-sekvensen ble amplifisert fra pRS304-p2HSE-Axl2-GFP-plasmidet (23) ved PCR, og klonet inn i BamHI-PstI-setet til pBEVY-GL LEU2-vektoren. Det resulterende plasmidet ble kalt pRGS12. Sekvensen til oligonukleotidene som ble brukt i denne studien er listet opp i tabell S2.
Stammen ble tilsatt 0,2 % adenin og 2 % glukose [YP-dekstrose (YPD)], 2 % raffinose [YP-raffinose]-rikt gjærekstraktprotein p (YP)-medium (1 % gjærekstrakt og 2 % protein ept. (YPR)] eller 2 % galaktose [YP-galaktose (YPG)] som karbonkilde, eller i et syntetisk minimalt medium (0,15 % gjærnitrogenbase og 0,5 % ammoniumsulfat) for å supplere passende aminosyrer og baser som kreves for ernæring, og som inneholdt 2 % glukose (syntetisk glukoseminimalmedium) eller 2 % galaktose (syntetisk galaktoseminimalmedium) som karbonkilde.
For sanntidsavbildning ble temperaturfølsomme sec31-1-mutantceller som uttrykte konstruksjonen under GAL1-promotoren dyrket i YPR-medium ved 24 °C over natten til mid-logaritmisk fase. Etter induksjon i YPG ved 24 °C i 1 time ble cellene inkubert i SG ved 37 °C i 30 minutter, og deretter overført til 24 °C for å frigjøres fra sekresjonsblokken. Concanavalin A ble brukt til å fiksere cellene på et glassplate og avbildet med SCLIM. SCLIM er en kombinasjon av Olympus IX-71 invertert fluorescensmikroskop og UPlanSApo 100×1.4 numerisk aperturoljelinse (Olympus), høyhastighets og høyt signal-til-støy-forhold roterende skivekonfokalskanner (Yokogawa Electric), spesialtilpasset spektrometer og spesialtilpasset kjøling. Systemets bildeforsterker (Hamamatsu Photonics) kan gi et forstørrelseslinsesystem med en endelig forstørrelse på ×266.7 og et ladningskoblet enhetskamera som multipliserer elektroner (Hamamatsu Photonics) (21). Bildeopptak utføres av spesialtilpasset programvare (Yokogawa Electric). For 3D-bilder brukte vi en spesiallaget piezoelektrisk aktuator for å vibrere objektivlinsen vertikalt, og samlet de optiske delene 100 nm fra hverandre i en stabel. Z-stabelbildet konverteres til 3D-vokseldata, og den teoretiske punktspredningsfunksjonen som brukes for det roterende skivekonfokalmikroskopet brukes til dekonvolusjonsbehandling av Volocity-programvare (PerkinElmer). Ved å bruke Volocity-programvare til automatisk terskelbestemmelse for samlokaliseringsanalyse, ble ERES inkludert last målt. Linjeskanningsanalyse ble utført ved hjelp av MetaMorph-programvare (Molecular Devices).
Bruk GraphPad Prism-programvaren til å bestemme statistisk signifikans. For den tosidige Student's t-testen og den ordinære enveis variansanalysen (ANOVA) anses forskjeller mellom gruppene å ha en signifikant innvirkning på P <0,05 (*).
For fluorescensmikroskopi av Gas1-GFP ble logaritmiske faseceller dyrket over natten i YPD og samlet inn ved sentrifugering, vasket to ganger med fosfatbufret saltvann og inkubert på is i minst 15 minutter, og deretter undersøkt under mikroskopet som tidligere beskrevet i Kontroll (24). Leica DMi8-mikroskopet (HCX PL APO 1003/1.40 olje PH3 CS) utstyrt med objektivlinse, L5 (GFP)-filter, Hamamatsu-kamera og Application Suite X (LAS X)-programvare ble brukt til opptak.
Prøvene ble denaturert med SDS-prøvebuffer ved 65 °C i 10 minutter, og deretter separert ved SDS-polyakrylamidgelelektroforese (PAGE). For immunoblottinganalyse ble 10 μl prøve lastet per bane. Primært antistoff: Bruk polyklonalt kanin-anti-Gas1 i en fortynning på 1:3000, polyklonalt kanin-anti-Emp24 i en fortynning på 1:500, og polyklonalt kanin-anti-GFP (en gave fra H. Riezman) i en fortynning på 1:3000. Det monoklonale mus-anti-Pgk1-antistoffet ble brukt i en fortynning på 1:5000 (en gave fra J. de la Cruz). Sekundært antistoff: Pepperrotperoksidase (HRP)-konjugert geite-anti-kanin-immunoglobulin G (IgG) brukt i en fortynning på 1:3000 (Pierce). HRP-konjugert geite-anti-mus IgG ble brukt i en fortynning på 1:3000 (Pierce). Immunresponssonen ble observert ved hjelp av kjemiluminescensmetoden til SuperSignal West Pico-reagens (Thermo Fisher Scientific).
Som beskrevet i (31) ble et naturlig immunutfellingseksperiment utført på den anrikede ER-fraksjonen. Kort sagt, gjærcellene ble vasket med TNE-buffer [50 mM tris-HCl (pH 7,5), 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1 mM fenylmetylsulfonylfluorid og proteasehemmerblanding) ved 600 nm (OD600) og 100 optisk tetthet to ganger. Den ble knust med glasskuler, og deretter ble celleavfall og glasskuler fjernet ved sentrifugering. Supernatanten ble deretter sentrifugert ved 17 000 g i 15 minutter ved 4 °C. Pelleten ble resuspendert i TNE, og digitalis-saponin ble tilsatt til en sluttkonsentrasjon på 1 %. Suspensjonen ble inkubert i 1 time med rotasjon ved 4 °C, og deretter ble de uløselige komponentene fjernet ved sentrifugering ved 13 000 g ved 4 °C i 60 minutter. For Gas1-GFP-immunutfelling, forinkuber først prøven med tomme agarosekuler (ChromoTek) ved 4 °C i 1 time, og inkuber deretter med GFP-Trap_A (ChromoTek) ved 4 °C i 3 timer. De immunutfelte kulene ble vasket fem ganger med TNE som inneholdt 0,2 % digoksigenin, eluert med SDS-prøvebuffer, separert på SDS-PAGE og analysert ved immunoblotting.
Som beskrevet i (31) ble tverrbindingsbestemmelse utført på den anrikede ER-fraksjonen. Kort fortalt ble den anrikede ER-fraksjonen inkubert med 0,5 mM ditiobis(succinimidylpropionat) (Pierce, Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL, USA; 20 °C, 20 min). Tverrbindingsreaksjonen ble stoppet ved å tilsette glysin (50 mM sluttkonsentrasjon, 5 minutter, 20 °C).
Som tidligere beskrevet (50) ble MS-analyse av ceramid i villtype- og GhLag1-stammer utført. Kort fortalt ble cellene dyrket til eksponentiell fase (3 til 4 OD600-enheter/ml) i YPD ved 30 °C, og 25 × 107 celler ble høstet. Metabolismen deres ble stoppet med trikloreddiksyre. Bruk ekstraksjonsløsningsmiddel [etanol, vann, eter, pyridin og 4,2 N ammoniumhydroksid (15:15:5:1:0,018 v/v)] og 1,2 nmol intern standard C17 ceramid (860517, Avanti polar lipid) kvalitet). Bruk monometylaminreagens [metanol, vann, n-butanol og metylaminløsning (4:3:1:5 v/v)] for å utføre mild alkalisk hydrolyse av ekstraktet, og bruk deretter vannmettet n-butanol for å avsalte. Til slutt ble ekstraktet resuspendert i et positivt løsningsmiddel [kloroform/metanol/vann (2:7:1) + 5 mM ammoniumacetat] og injisert i massespektrometeret. Multireaksjonsmonitorering (MRM) ble utført for identifisering og kvantifisering av sfingolipidmolekyler. TSQ Vantage tertiær kvadrupolmassespektrometer (Thermo Fisher Scientific) er utstyrt med en robotisk nanoflow-ionekilde, Nanomate HD (Advion Biosciences, Ithaca, NY) for lipidanalyse. Kollisjonsenergien er optimalisert for hver ceramidkategori. MS-data ble innhentet i positiv modus. For hvert biologiske replikat er lipidsignalet medianen av tre uavhengige målinger.
Som beskrevet i (31) ble cellene (800 × 107) som uttrykte Gas1-GFP utsatt for naturlig immunutfelling. Den rensede Gas1-GFP ble separert ved SDS-PAGE og overført til en polyvinylidenfluorid (PVDF)-membran. Proteinet ble visualisert ved å farge PVDF med amidsvart. Gas1-GFP-båndet ble kuttet fra PVDF og vasket 5 ganger med metanol og én gang med vann av væskekromatografi-MS (LC-MS)-kvalitet. Ved å inkubere membranstrimmelen med 500 μl 0,3 M NaOAc (pH 4,0), buffer og 500 μl nyoppløst 1 M natriumnitrittblanding ved 37 °C i 3 timer, frigjøres lipidfraksjonen fra Gas1-GFP og lyseres. Frigjøring av inosinfosfatceramid mellom glukosamin og inositol (51). Deretter ble membranstrimmelen vasket fire ganger med vann av LC-MS-kvalitet, tørket ved romtemperatur og lagret i en nitrogenatmosfære ved -80 °C inntil analyse. Som kontroll ble en blindprøve av PVDF-membran brukt for hvert eksperiment. Lipidet ekstrahert fra Gas1-GFP ble deretter analysert ved MS som beskrevet (50). Kort sagt ble PVDF-strimler som inneholdt GPI-lipid resuspendert i 75 μl negativt formløsningsmiddel [kloroform/metanol (1:2) + 5 mM ammoniumacetat] og bestått elektrosprayionisering (ESI)-MRM/MS-analyse av sfingolipidarter (TSQ Vantage). I dette tilfellet ble MS-data innhentet i negativ ionemodus.
Som nevnt tidligere ble lipiddelen av GPI-ankeret separert fra den [3H]-inositol-merkede GPI-AP (16). Lipidene ble separert ved tynnsjiktskromatografi ved bruk av et løsningsmiddelsystem (55:45:10 kloroform-metanol-0,25 % KCl) og visualisert ved bruk av FLA-7000 (Fujifilm).
Cellene som uttrykte Gas1-GFP (600×107) ble vasket to ganger med TNE-buffer, og knust med glasskuler, og deretter sentrifugert for å fjerne cellerester og glasskuler. Supernatanten ble deretter sentrifugert ved 17 000 g i 1 time ved 4 °C. Pelleten ble vasket i TNE og inkubert med 1 U PI-PLC (Invitrogen) i TNE som inneholdt 0,2 % digitalis-saponin i 1 time ved 37 °C. Etter enzymbehandlingen ble membranen fjernet ved sentrifugering ved 17 000 g ved 4 °C i 1 time. For å immunutfelle Gas1-GFP ble supernatanten inkubert med GFP-Trap_A (ChromoTek) ved 4 °C over natten. Den rensede Gas1-GFP separert ved SDS-PAGE ble farget med Coomassie briljantblått. Gas1-GFP-fargingsbåndet ble kuttet av fra det grå området rundt akvedukten, og etter alkylering med jodacetamid og reduksjon med ditiotreitol ble det utført in-gel-fordøyelse med trypsin. Ekstraher og tørk tryptiske peptider og peptider med GPI-glykaner. Det tørkede peptidet ble løst opp i 20 μl vann. Injiser en porsjon (8μl) i LC-en. En oktadecylsilan (ODS)-kolonne (Develosil 300ODS-HG-5; indre diameter 150 mm × 1,0 mm; Nomura Chemical, Aichi Prefecture, Japan) ble brukt til å separere peptider under spesifikke gradientforhold. Den mobile fasen er løsningsmiddel A (0,08 % maursyre) og løsningsmiddel B (0,15 % maursyre i 80 % acetonitril). Et Accela HPLC-system (Thermo Fisher Scientific, Boston, Massachusetts) ble brukt til å eluere kolonnen med løsningsmiddel A i løpet av 55 minutter med en strømningshastighet på 50 μl min-1 i 5 minutter, og deretter ble konsentrasjonen av løsningsmiddel B økt til 40 %. (USA). Eluatet ble kontinuerlig introdusert i ESI-ionekilden, og de tryptiske peptidene og peptidene med GPI-glykaner ble analysert med LTQ Orbitrap XL (hybrid lineær ionefelle-orbitrap massespektrometer; Thermo Fisher Scientific). I MS-oppsettet ble spenningen til kapillærkilden satt til 4,5 kV, og temperaturen på overføringskapillæren ble holdt ved 300 °C. Kapillærspenningen og rørlinsespenningen ble satt til henholdsvis 15 V og 50 V. MS-data ble innhentet i positiv ionmodus (oppløsning på 60 000; massenøyaktighet på 10 deler per million) i et masseområde på 300/m/z masse/ladningsforhold (m/z) 3000. MS/MS-dataene innhentes gjennom ionefellen i LTQ Orbitrap XL [de tre første sifrene som dataene er avhengige av, kollisjonsindusert dissosiasjon (CID)].
MD-simuleringer ble utført ved hjelp av GROMACS (52)-programvare og MARTINI 2-kraftfeltet (53-55). CHARMM GUI Membrane Builder (56, 57) ble deretter brukt til å konstruere et dobbeltlag som inneholdt dioleoylfosfatidylkolin (DOPC) og Cer C18 eller DOPC og Cer C26. Topologien og koordinatene til Cer C26 er avledet fra DXCE ved å fjerne de ekstra kulene fra sfingosinhalen. Bruk prosessen beskrevet nedenfor for å balansere dobbeltlaget og kjør det, og bruk deretter de siste koordinatene til systemet til å bygge et system som inneholder Emp24. Transmembrandomenet til gjæren Emp24 (restene 173 til 193) ble konstruert som en α-heliks ved hjelp av det visuelle MD (VMD)-verktøyets molekylære struktur (58). Etter å ha fjernet de overlappende lipidene, ble proteinet grovgranulert og satt inn i dobbeltlaget ved hjelp av CHARMM GUI. Det endelige systemet inneholder 1202 DOPC og 302 Cer C26 eller 1197 DOPC og 295 Cer C18 og Emp24. Ioniser systemet til en konsentrasjon på 0,150 M. Fire uavhengige replikater ble gjort for to dobbeltlagssammensetninger.
Lipid-dobbeltlaget balanseres ved hjelp av CHARMM GUI-prosessen, som innebærer å minimere og deretter balansere 405 000 trinn, hvor posisjonsbegrensningene gradvis reduseres og elimineres, og tidstrinnet økes fra 0,005 ps til 0,02 ps. Etter ekvilibrering produserer den 6 µs med et tidstrinn på 0,02 ps. Etter å ha satt inn Emp24, bruk den samme CHARMM GUI-prosessen for å minimere og balansere systemet, og kjør deretter i 8 sekunder i produksjon.
For alle systemer kontrolleres trykket under balanseringsprosessen av Berendsen-barostaten (59), og under produksjonsprosessen kontrolleres trykket av Parrinello-Rahman-barostaten (60). I alle tilfeller er gjennomsnittstrykket 1 bar, og det brukes et semi-isotropisk trykkkoblingsskjema. I balanserings- og produksjonsprosessen brukes en termostat (61) med hastighetskalibrering for å koble temperaturen til henholdsvis protein-, lipid- og løsningsmiddelpartikler. Under hele operasjonen er måltemperaturen 310 K. Den ikke-bindende interaksjonen beregnes ved å generere en paringsliste ved hjelp av Verlet-skjemaet med en buffertoleranse på 0,005. Coulomb-leddet beregnes ved hjelp av reaksjonsfeltet og en grenseavstand på 1,1 nm. Vander Waals-leddet bruker et grenseavstandsskjema med en grenseavstand på 1,1 nm, og Verlet-grenseavstandsskjemaet brukes for potensiell drift (62).
Ved bruk av VMD er grensebølgelengden mellom DOPC-fosfatkuler eller ceramid AM1-kuler og proteinet 0,7 nm, og antallet lipider som interagerer med proteinet beregnes. Beregn depletjons-anrikningsfaktoren (DE) som i (63) i henhold til følgende formel: DE-faktor = (mengden totale lipider i proteinet 0,7) i proteinet 0,7 (mengden Cer i totale lipider)
Den rapporterte verdien er oppnådd som et gjennomsnitt, og feilsøylene er fire uavhengige kopier av SE. Den statistiske signifikansen av DE-faktoren beregnes ved t-test [(gjennomsnittligDE-faktor-1)/SE]. Beregn p-verdien fra den ensidige fordelingen.
GROMACS-verktøyet ble brukt til å beregne det 2D laterale tetthetskartet for systemet som inneholder Emp24 innenfor de siste 250 ns av sporet. For å få anriknings-/uttømmingskartet for ceramid, deles tetthetskartet for Cer på summen av kartet for Cer og DOPC, og deretter deles det på konsentrasjonen av Cer i kroppen. Samme fargekartskala brukes.
For tilleggsmateriale til denne artikkelen, se http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/50/eaba8237/DC1
Dette er en artikkel med åpen tilgang distribuert under vilkårene i Creative Commons Attribution-Non-Commercial License, som tillater bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, så lenge den endelige bruken ikke er for kommersiell vinning og forutsetningen er at det originale verket er korrekt. Referanse.
Merk: Vi ber deg bare om å oppgi e-postadressen din, slik at personen du anbefaler til siden vet at du vil at de skal se e-posten, og at den ikke er spam. Vi vil ikke registrere noen e-postadresser.
Dette spørsmålet brukes til å teste om du er en besøkende og forhindre automatisk spaminnsending.
Sofia Rodriguez-Gallardo, Kazuo Kurokawa, Susana Sabido-Bozo, Alejandro Cortez · Gomez (Alejandro Cortes-Gomez), Atsuko Ikeda (Atsuko Ikeda), Valeria Zoni (Valeria Zoni), Auxiliadora Aguilera-Romero, Ana Maria Perez -Linero, Miho Sergio L Wagho, Miho Sergio L Wagho. (Miho Waga), Misako Arman (Misako Arman), Miyako Riman (Miyako Riman), Prow Akira, Stefano Fanny, Akihiko Nakano, Manuel Muniz
3D-bilder i sanntid med høy oppløsning avslører viktigheten av ceramidkjedelengde for proteinsortering i selektive utgangssteder.
Sofia Rodriguez-Gallardo, Kazuo Kurokawa, Susana Sabido-Bozo, Alejandro Cortez · Gomez (Alejandro Cortes-Gomez), Atsuko Ikeda (Atsuko Ikeda), Valeria Zoni (Valeria Zoni), Auxiliadora Aguilera-Romero, Ana Maria Perez -Linero, Miho Sergio L Wagho, Miho Sergio L Wagho. (Miho Waga), Misako Arman (Misako Arman), Miyako Riman (Miyako Riman), Prow Akira, Stefano Fanny, Akihiko Nakano, Manuel Muniz
3D-bilder i sanntid med høy oppløsning avslører viktigheten av ceramidkjedelengde for proteinsortering i selektive utgangssteder.
©2020 American Association for the Advancement of Science. alle rettigheter forbeholdt. AAAS er partner av HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef og COUNTER. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.