Javascript er for øyeblikket deaktivert i nettleseren din. Enkelte funksjoner på dette nettstedet vil ikke fungere når JavaScript er deaktivert.
Registrer deg med dine spesifikke opplysninger og det spesifikke legemidlet du er interessert i, så matcher vi informasjonen du oppgir med artikler i vår omfattende database og sender deg en PDF-kopi på e-post umiddelbart.
Ban-Lan-Gen-granuler demper dekstran-natriumsulfat-indusert kronisk tilbakefallende kolitt hos mus ved å modulere tarmmikrobiota og gjenopprette intestinal SCFA-avledet GLP-1-produksjon
Jiao Peng, 1-3, * Li Xi, 4, * Zheng Lin, 3, 5 Duan Lifang, 1 Gao Zhengxian, 2, 5 Diehu, 1 Li Jie, 6 Li Xiaofeng, 6 Shen Xiangchun, 5 Xiao Haitao21 Peking University Shenzhen Hospital Avdeling for farmasi, Shenzhen, Folkerepublikken Kina; 2 Shenzhen University Health Science Center School of Pharmacy, Shenzhen, Folkerepublikken Kina; 3 Guizhou Medical University Engineering Technology Research Center of Ethnic Medicine and Traditional Chinese Medicine Development and Application Ministry of Education, Guizhou Provincial Key Laboratory of Pharmacy, Guizhou Medical University, Guiyang, Folkerepublikken Kina; 4 Institutt for gastroenterologi, Peking University Shenzhen Hospital, Shenzhen, Folkerepublikken Kina; 5 Farmasøytisk fakultet, Guizhou Medical University, Statens nøkkellaboratorium for medisinplanters funksjon og anvendelse, Guiyang; 6 Institutt for laboratoriemedisin, Peking University Shenzhen Hospital, Shenzhen, Kina [email protected] Shen Xiangchun, Farmasøytisk fakultet, Guizhou Medical University, Guizhou, Folkerepublikken Kina, 550004, E-post [email protected] Formål: GLP-1-basert terapi er et nytt behandlingsalternativ for inflammatorisk tarmsykdom. Ban-Lan-Gen (BLG)-granuler er en kjent antiviral TCM-formulering som viser potensiell antiinflammatorisk aktivitet i behandlingen av ulike inflammatoriske tilstander. Imidlertid er dens antiinflammatoriske effekt på kolitt og dens virkningsmekanisme fortsatt uklar. METODER: Å etablere dekstran-natriumsulfat (DSS)-indusert kronisk tilbakefallende kolitt hos mus. Sykdomsaktivitetsindekser, histologiske markører for skade og proinflammatoriske cytokinnivåer ble utført for å vurdere den beskyttende effekten av BLG. Effektene av BLG på tarmmikrobiotaen og tarmen ble karakterisert ved serum GLP-1-nivåer og kolonisk Gcg-, GPR41- og GRP43-ekspresjon, tarmmikrobiotasammensetning, fekale SCFA-nivåer og GLP-1-frigjøring fra Primære musekoloniske epitelceller SCFA-avledet GLP-1-produksjon. Resultater: BLG-behandling reduserte betydelig vekttap, DAI, kolonforkorting, kolonvevsskade og proinflammatoriske cytokinnivåer av TNF-α, IL-1β og IL-6 i kolonvevet. I tillegg kan BLG-behandling betydelig gjenopprette kolon Gcg-, GPR41- og GRP43-ekspresjon og serum GLP-1-nivåer hos kolittmus, og ved å øke SCFA-produserende bakterier som Akkermansia og Prevotellaceae_UCG-001, og redusere forekomsten av bakterier som Eubacterium_xylanophilum_group, Ruminococcaceae_UCG-014, Intestinimonas og Oscillibacter. I tillegg kan BLG-behandling øke nivået av SCFA i avføringen til kolittmus betydelig. Samtidig viste in vitro-eksperimenter også at avføringsekstraktet fra BLG-behandlede mus i stor grad kan stimulere de primære små murine kolonepitelcellene som skiller ut GLP-1. Konklusjoner: Disse funnene tyder på at BLG har en anti-kolitt-effekt. BLG har potensial til å bli utviklet som en terapi, i det minste delvis ved å modulere tarmmikrobiota og gjenopprette intestinal SCFA-derivert GLP-1-produksjon. Lovende legemidler for kronisk tilbakefallende kolitt. Nøkkelord: kolitt, Ban-Lan-Gen-granuler, tarmmikrobiota, kortkjedede fettsyrer, GLP-1
Ulcerøs kolitt (UC) er en langvarig inflammatorisk sykdom i tykktarm og endetarm, karakterisert ved tilbakevendende diaré, magesmerter, vekttap og mukopurulent blodig avføring.1 Nylig har forekomsten av UC økt i land med tidligere lav forekomst, inkludert Kina, med den økende populariteten til vestlig livsstil.2 Denne økningen skaper store problemer for folkehelsen og har alvorlige implikasjoner for pasienters arbeidsevne og livskvalitet. Det er verdt å merke seg at patogenesen til UC fortsatt er stort sett uklar, men det er generelt akseptert at genetikk, miljøfaktorer, tarmmikrobiotaen og immunsystemet alle bidrar til utviklingen av UC.3 Selv nå finnes det ingen kur for UC, og målet med behandlingen er klinisk å kontrollere kliniske symptomer, indusere og opprettholde remisjon, fremme slimhinnetilheling og redusere tilbakefall. Klassiske behandlinger inkluderer aminosalicylater, kortikosteroider, immunsuppressive midler og biologiske legemidler. Imidlertid kan ikke disse legemidlene oppnå ønsket effekt på grunn av deres ulike bivirkninger.4 Nylig har mange casestudier vist at tradisjonell kinesisk medisin (TCM) har vist et stort potensial for å hjelpe å lindre UC med lav toksisitet, noe som tyder på at utviklingen av nye TCM-terapier er en lovende behandlingsstrategi for UC.5-7
Banlangen Granules (BLG) er et tradisjonelt kinesisk medisinsk preparat laget av vannekstraktet fra Banlangen-roten.8 I tillegg til sin antivirale effekt, viser BLG potensiell antiinflammatorisk aktivitet i behandlingen av ulike inflammatoriske tilstander.9,10 I tillegg har glukosinolater (R,S-goitrin, progoitrin, epiprorubin og glukosid blitt isolert og identifisert fra vandige ekstrakter av Radix isatidis) og nukleosider (hypoksantin, adenosin, uridin og guanosin) og indigoalkaloider som indigo og indirubin.11,12 Tidligere studier har godt dokumentert at forbindelsene adenosin, uridin og indirubin viser potente anti-kolitt-effekter i forskjellige dyremodeller av kolitt.13-17 Imidlertid har ingen evidensbaserte studier blitt utført for å evaluere effekten av BLG ved kolitt. I den foreliggende studien undersøkte vi den beskyttende effekten av BLG på dekstran-natriumsulfat (DSS)-indusert kronisk tilbakefallende kolitt hos C57BL/6-mus. og fant at oral administrering av BLG signifikant dempet DSS-indusert kronisk tilbakefallende koloninflammasjon hos mus. Dens reguleringsmekanismer er assosiert med modulering av tarmmikrobiota og gjenoppretting av tarmavledet glukagonlignende peptid-1 (GLP-1) produksjon.
BLG-granulat (sukkerfritt, NMPA-godkjent Z11020357; Beijing Tongrentang Technology Development Co., Ltd., Beijing, Kina; batchnummer: 20110966) ble kjøpt fra apotek. DSS (molekylvekt: 36 000–50 000 Dalton) ble kjøpt fra MP Biologicals (Santa Ana, USA). Sulfasalazin (SASP) (≥ 98 % renhet), hematoksylin og eosin ble kjøpt fra Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). Mus TNF-α, IL-1β og IL-6 luminex Elisa-analysesett ble kjøpt fra R&D Systems (Minneapolis, MN, USA). Eddiksyre, propionsyre og smørsyre ble kjøpt fra Aladdin Industries (Shanghai, Kina). 2-etylsmørsyre ble kjøpt fra Merck KGaA (Darmstadt, Tyskland).
6–8 uker gamle hannmus av typen C57BL/6 (kroppsvekt 18–22 g) ble kjøpt fra Beijing Wetahe Laboratory Animal Technology Co., Ltd. (Beijing, Kina) og plassert i et miljø på 22 ± 2 °C med en 12-timers lys/mørke-syklus. Musene ble fôret med et standard gnagerkosthold med fri tilgang til drikkevann i én uke for å akklimatisere seg til det nye miljøet. Musene ble deretter tilfeldig delt inn i fire grupper: kontrollgruppe, DSS-modellgruppe, SASP-behandlet gruppe (200 mg/kg, oralt) og BLG-behandlet gruppe (1 g/kg, oralt). Som vist i figur 1A, ble eksperimentell kronisk tilbakefallende kolitt indusert hos mus ved tre sykluser med 1,8 % DSS i 5 dager, etterfulgt av destillert vann i 7 dager, ifølge vår tidligere studie.18 Mus i SASP- og BLG-behandlede grupper ble behandlet med henholdsvis SASP og BLG hver dag fra dag 0. I følge foreløpige eksperimenter ble dosen av BLG ble satt til 1 g/kg. I mellomtiden ble dosen av SASP satt til 200 mg/kg i henhold til litteraturen.4 Kontroll- og DSS-modellgruppene fikk samme vannvolum gjennom hele eksperimentet.
Figur 1 BLG lindrer DSS-indusert kronisk tilbakefallende kolitt hos mus. (A) Eksperimentell design av kronisk tilbakefallende kolitt og behandling, (B) endring i kroppsvekt, (C) sykdomsaktivitetsindeks (DAI)-skåre, (D) kolonlengde, (E) representativt bilde av kolon, (F) H&E-farging av kolon (forstørrelse, ×100) og (G) histologisk skåre. Data presenteres som gjennomsnitt ± SEM (n = 6). ##p < 0,01 eller ###p < 0,001 vs kontrollgruppe (Con); *p < 0,05 eller **p < 0,01 eller ***p < 0,001 vs DSS-gruppe.
Kroppsvekt, avføringskonsistens og rektal blødning ble registrert daglig. Sykdomsaktivitetsindeksen (DAI) ble bestemt ved å kombinere poengsummer for kroppsvekt, avføringskonsistens og rektal blødning som beskrevet tidligere.19 Ved slutten av eksperimentet ble alle mus avlivet, og blod, avføring og tykktarm ble samlet inn for videre eksperimenter.
Tykktarmsvev ble formalinfiksert og innstøpt i parafin. 5-mikronsnitt ble laget og farget med hematoksylin-eosin (H&E), deretter blindet og scoret som tidligere beskrevet.19
Totalt RNA fra tykktarmsvev ble ekstrahert med Trizol-reagens (Invitrogen, Carlsbad, CA), etterfulgt av cDNA-ekstraksjon med revers transkriptase (TaKaRa, Kusatsu, Shiga, Japan). Kvantitativ PCR ble utført ved bruk av et sanntids-PCR-system med SYBR Green Master (Roche, Basel, Sveits). Målgentranskripter ble normalisert til β-aktin, og data ble analysert ved bruk av 2-ΔΔCT-metoden. Genprimersekvensene er vist i tabell 1.
Primær isolering og dyrking av epitelceller fra mus i tykktarmen ble utført som tidligere beskrevet.20 Kort fortalt ble tykktarmene fra 6–8 uker gamle mus først skåret ut etter avliving ved cervikal dislokasjon, deretter åpnet i lengderetningen, behandlet med Hanks Balanced Salt Solution (HBSS, uten kalsium og magnesium) og kuttet i 0,5–1 mm små biter. Deretter ble vev fordøyd med 0,4 mg/ml kollagenase XI (Sigma, Poole, Storbritannia) i fritt DMEM-medium og sentrifugert ved 300 xg i 5 minutter ved romtemperatur. Resuspender pelleten i DMEM-medium (supplert med 10 % føtalt bovint serum, 100 enheter/ml penicillin og 100 µg/ml streptomycin) ved 37 °C og ført gjennom et nylonnett (porestørrelse ~250 µm). Alikvoter av tykktarmsepitelceller ble plassert i skåler med glassbunn og inkubert med eddiksyre, propionsyre, smørsyre og muse- avføringsekstrakter i 2 timer ved 37 °C, 5 % CO2.
Tykktarmsvev ble homogenisert med PBS, og nivåene av cytokinene IL-6, TNF-α og IL-1β i tykktarmsvev ble detektert ved bruk av luminex ELISA-analysesett (R&D systems, Minneapolis, MN, USA). På samme måte ble GLP-1-nivåer i serum og kulturmedium fra primære murine kolonepitelceller bestemt med et ELISA-sett (Bioswamp, Wuhan, Kina) i henhold til produsentens instruksjoner.
Totalt DNA fra avføring ble ekstrahert ved hjelp av et DNA-ekstraksjonssett (Tiangen, Kina). Kvaliteten og mengden av DNA ble målt i forholdstallene 260 nm/280 nm og 260 nm/230 nm, henholdsvis. Deretter ble de spesifikke primerne 338F (ACTCCTACGGGAGGCAGCAG) og 806R (GGACTACHVGGGTWTCTAAT) brukt til å amplifisere V3-V4-regionene i 16S rRNA-genet i forskjellige regioner, ved å bruke hvert ekstraherte DNA som mal. PCR-produktene ble renset ved hjelp av QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN, Tyskland), kvantifisert ved sanntids-PCR og sekvensert ved hjelp av IlluminaMiseq PE300-sekvenseringsplattformen (Illumina Inc., CA, USA). For bioinformatisk analyse ble databehandling utført i henhold til tidligere rapporterte protokoller.21,22 Kort sagt, bruk Cutadapt (V1.9.1) for å filtrere rå ekspressfiler. OTU-er ble gruppert ved hjelp av UPARSE (versjon 7.0.1001) med en likhetsgrense på 97 %, og UCHIME ble brukt til å fjerne kimære sekvenser. Analyse og klassifisering av fellesskapssammensetning ble utført ved hjelp av RDP-klassifikatoren (http://rdp.cme.msu.edu/) basert på SILVA ribosomalt RNA-gendatabasen.
Nivåene av kortkjedede fettsyrer (eddiksyre, propionsyre og smørsyre) ble målt som tidligere beskrevet av Tao et al., med noen modifikasjoner.23 Kort fortalt ble 100 mg avføring først suspendert i 0,4 ml avionisert vann, etterfulgt av 0,1 ml 50 % svovelsyre og 0,5 ml 2-etylsmørsyre (intern standard), deretter homogenisert og varmet opp til 4 °C. Sentrifuger ved 12 000 o/min i 15 minutter ved C. Supernatanten ble ekstrahert med 0,5 ml eter og injisert i GC for analyse. For gasskromatografi (GC)-analyse ble prøvene analysert ved hjelp av en GC-2010 Plus gasskromatograf (Shimadzu, Inc.) utstyrt med en flammeioniseringsdetektor (FID). Separasjon ble oppnådd ved hjelp av en ZKAT-624-kolonne, 30 m × 0,53 mm × 0,3 μm (Lanzhou Zhongke Antai Analytical Technology Co., Ltd., Kina). Data ble innhentet ved hjelp av GC-løsningsprogramvare (Shimadzu, Inc.). Delingsforholdet var 10:1, bærergassen var nitrogen, og strømningshastigheten var 6 ml/min. Injeksjonsvolumet var 1 μL. Injektor- og detektortemperaturen var 300 °C. Ovnstemperaturen ble holdt på 140 °C i 13,5 minutter, deretter økt til 250 °C med en hastighet på 120 °C/min; temperaturen ble holdt i 5 minutter.
Data presenteres som gjennomsnitt ± standardfeil for gjennomsnittet (SEM). Datasignifikans ble vurdert ved enveis ANOVA etterfulgt av Duncans multiple range test. GraphPad Prism 5.0-programvare (GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA) ble brukt for alle beregninger, og p < 0,05 ble ansett som statistisk signifikant.
Det er velkjent at UC er en kronisk tilbakefallende kolittsykdom med alvorlige magesmerter, diaré og blødninger. Derfor ble DSS-indusert kronisk tilbakefallende kolitt hos mus etablert for å evaluere anti-kolitt-effekten av BLG (fig. 1A). Sammenlignet med kontrollgruppen hadde mus i DSS-modellgruppen betydelig redusert kroppsvekt og høyere DAI, og disse endringene var betydelig reversert etter 24 dager med BLG-behandling (figur 1B og C). Forkorting av tykktarmen er et viktig kjennetegn på UC. Som vist i figur 1D og E, var tykktarmslengden til mus som fikk DSS betydelig forkortet, men ble lindret av BLG-behandling. Deretter ble histopatologisk analyse utført for å vurdere kolonbetennelse. H&E-fargede bilder og patologiske skårer viste at DSS-administrasjon signifikant forstyrret kolonarkitekturen og resulterte i kryptødeleggelse, mens BLG-behandling betydelig reduserte kryptødeleggelse og patologiske skårer (figur 1F og G). Det er verdt å merke seg at den beskyttende effekten av BLG i en dose på 1 g/kg var sammenlignbar med SASP i en dose på 200 mg/kg. Samlet sett tyder disse funnene på at BLG er effektivt i å redusere alvorlighetsgraden av DSS-indusert kronisk tilbakefallende kolitt hos mus.
TNF-α, IL-1β og IL-6 er viktige inflammatoriske markører for koloninflammasjon. Som vist i figur 2A, induserte DSS en signifikant økning i genuttrykket av TNF-α, IL-1β og IL-6 i tykktarmen sammenlignet med kontrollgruppen. Administrasjon av BLG kan reversere disse DSS-medierte endringene betydelig. Deretter brukte vi ELISA for å bestemme nivåene av de inflammatoriske cytokinene TNF-α, IL-1β og IL-6 i tykktarmsvev. Resultatene viste også at kolonnivåene av TNF-α, IL-1β og IL-6 var signifikant økt hos mus behandlet med DSS, mens BLG-behandling lindret disse økningene (figur 2B).
Figur 2 BLG hemmer genuttrykk og produksjon av de proinflammatoriske cytokinene TNF-α, IL-1β og IL-6 i tykktarmen hos DSS-behandlede mus. (A) Kolonisk genuttrykk av TNF-α, IL-1β og IL-6; (B) koloniske proteinnivåer av TNF-α, IL-1β og IL-6. Data presenteres som gjennomsnitt ± SEM (n = 4–6). #p < 0,05 eller ##p < 0,01 eller ###p < 0,001 vs kontrollgruppe (Con); *p < 0,05 eller **p < 0,01 vs DSS-gruppe.
Tarmdysbiose er kritisk i patogenesen til UC.24 For å undersøke om BLG modulerer tarmmikrobiotaen til DSS-behandlede mus, ble 16S rRNA-sekvensering utført for å analysere bakteriesamfunnet i tarminnholdet. Venn-diagrammet viser at de tre gruppene deler 385 OTU-er. Samtidig hadde hver gruppe unike OTU-er (fig. 3A). Videre viste Chao1-indeksen og Shannon-indeksen vist i figur 3B og C at samfunnsmangfoldet i tarmmikrobiotaen var redusert hos BLG-behandlede mus, ettersom Shannon-indeksen var betydelig redusert i den BLG-behandlede gruppen. Hovedkomponentanalyse (PCA) og hovedkoordinatanalyse (PCoA) ble brukt til å bestemme klyngemønstre blant de tre gruppene og viste at samfunnsstrukturen til DSS-behandlede mus var tydelig separert etter BLG-behandling (figur 3D og E). Disse dataene antyder at BLG-behandling betydelig påvirket samfunnsstrukturen til mus med DSS-indusert kolitt.
Figur 3 BLG endrer mangfoldet av tarmmikrobiota hos mus med DSS-indusert kolitt. (A) Venn-diagram av OTU, (B) Chao1-indeks, (C) Shannons rikhetsindeks, (D) Principal Component Analysis (PCA)-skåreplott av OTU, (E) OTU Principal Coordinate Analysis (PCoA)-skårefigur. Data presenteres som gjennomsnitt ± SEM (n = 6). **p < 0,01 vs DSS-gruppe.
For å vurdere spesifikke endringer i den fekale mikrobiotaen analyserte vi sammensetningen av tarmmikrobiotaen på alle taksonomiske nivåer. Som vist i figur 4A, var hovedfylaene i alle gruppene Firmicutes og Bacteroidetes, etterfulgt av Verrucomicrobia. De relative forekomstene av Firmicutes og Firmicutes/Bacteroidetes-forholdene var signifikant økt i de fekale mikrobielle samfunnene til DSS-behandlede mus sammenlignet med kontrollmus, og disse endringene ble signifikant reversert etter BLG-behandling. Spesielt økte BLG-behandling signifikant den relative forekomsten av Verrucobacterium i avføringen til mus med DSS-indusert kolitt. På husholdningsnivå var fekale mikrobielle samfunn okkupert av Lachnospiriaceae, Muribaculaceae, Akkermansiaceae, Ruminococcaceae og Prevotellaceae (fig. 4B). Sammenlignet med DSS-gruppen økte reduksjonen av BLG forekomsten av Akkermansiaceae, men reduserte forekomsten av Lachnospiraceae og Ruminococcaceae. Spesielt på slektsnivå, Den fekale mikrobiotaen var okkupert av Lachnospira_NK4A136_gruppen, Akkermansia og Prevotellaceae_UCG-001 (fig. 4C). Dette funnet viste også at BLG-behandling effektivt reverserte ubalansen i mikrobiotaen som respons på DSS-utfordring, karakterisert ved en reduksjon i Eubacterium_xylanophilum_gruppen, Ruminococcaceae_UCG-014, Intestinimonas og Oscillibacter, og en økning i Akkermansia og Prevotellaceae_UCG-001.
Figur 4 BLG endrer forekomsten av tarmmikrobiota hos DSS-induserte kolittmus. (A) Forekomst av tarmmikrobiota på rekkenivå; (B) Forekomst av tarmmikrobiota på familienivå; (C) Forekomst av tarmmikrobiota på slektsnivå. Data presenteres som gjennomsnitt ± SEM (n = 6). #p < 0,05 eller ###p < 0,001 vs kontrollgruppe (Con); *p < 0,05 eller **p < 0,01 eller ***p < 0,001 vs DSS-gruppe.
Tatt i betraktning at kortkjedede fettsyrer (SCFA-er) er de viktigste metabolittene til Akkermansia og Prevotellaceae_UCG-001, mens acetat, propionat og butyrat er de mest forekommende SCFA-ene i tarmlumen,25-27 er vi fortsatt i studien vår. Som vist i figur 5, var konsentrasjonene av acetat, propionat og butyrat i feces betydelig redusert i gruppen som ble behandlet med DSS, mens BLG-behandling i stor grad kunne undertrykke denne reduksjonen.
Figur 5. BLG øker nivåene av kortkolsyrer (SCFA) i avføringen til mus med DSS-indusert kolitt. (A) Eddiksyreinnhold i avføring; (B) propionsyreinnhold i avføring; (C) smørsyreinnhold i avføring. Data presenteres som gjennomsnitt ± SEM (n = 6). #p < 0,05 eller ##p < 0,01 vs kontrollgruppe (Con); *p < 0,05 eller **p < 0,01 vs DSS-gruppe.
Vi beregnet videre Pearson-korrelasjonskoeffisienten mellom differensiell SCFA på slektsnivå og fekal mikrobiota. Som vist i figur 6, var Akkermansia positivt korrelert med produksjonen av propionsyre (Pearson = 0,4866) og smørsyre (Pearson = 0,6192). I motsetning til dette var både Enteromonas og Oscillobacter negativt assosiert med acetatproduksjon, med Pearson-koeffisienter på henholdsvis 0,4709 og 0,5104. På samme måte var Ruminococcaceae_UCG-014 negativt korrelert med produksjonen av propionsyre (Pearson = 0,4508) og smørsyre (Pearson = 0,5842).
Figur 6 Pearson-korrelasjonsanalyse mellom differensielle kortsluttede fettsyrer (SCFA) og kolonmikrober. (A) Enteromonas med eddiksyre; (B) Hjernerystelsesbasill med eddiksyre; (C) Akkermansia vs. propionsyre; (D) Ruminococcus_UCG-014 med propionsyre; (E) Akkermansia med smørsyre; (F) Ruminococcus _UCG-014 med smørsyre.
Glukagonlignende peptid-1 (GLP-1) er et celletypespesifikt posttranslasjonsprodukt av proglukagon (Gcg) med antiinflammatoriske egenskaper.28 Som vist i figur 7, induserte DSS en signifikant reduksjon i Gcg mRNA-ekspresjon. Kolon- og BLG-behandling kunne reversere den DSS-induserte Gcg-reduksjonen betydelig sammenlignet med kontrollgruppen (figur 7A). Samtidig var nivået av GLP-1 i serum betydelig redusert i DSS-behandlede gruppen, og BLG-behandling kunne i stor grad forhindre denne reduksjonen (figur 7B). Siden kortkjedede fettsyrer kan stimulere GLP-1-sekresjon gjennom aktivering av G-proteinkoblet reseptor 43 (GRP43) og G-proteinkoblet reseptor 41 (GRP41), undersøkte vi også GPR41 og GRP43 i tykktarmen hos kolittmus og fant at kolon-mRNA-ekspresjonen av GRP43 og GPR41 var betydelig redusert etter DSS-utfordring, og BLG-behandling kunne effektivt redde disse reduksjonene (figur 7C og D).
Figur 7 BLG øker serum GLP-1-nivåer og kolonisk Gcg-, GPR41- og GRP43 mRNA-ekspresjon hos DSS-behandlede mus. (A) Gcg mRNA-ekspresjon i tykktarmsvev; (B) GLP-1-nivå i serum; (C) GPR41 mRNA-ekspresjon i tykktarmsvev; (D) GPR43 mRNA-ekspresjon i tykktarmsvev. Data presenteres som gjennomsnitt ± SEM (n = 5–6). #p < 0,05 eller ##p < 0,01 vs kontrollgruppe (Con); *p < 0,05 vs DSS-gruppe.
Siden BLG-behandling kunne øke serum GLP-1-nivåer, kolon Gcg mRNA-ekspresjon og fekale SCFA-nivåer hos DSS-behandlede mus, undersøkte vi videre acetat, propionat og butyrat, samt fra kontrollmus (F-Con), DSS-kolitt (F-Con)-DSS) og BLG-behandlede kolitt (F-BLG) på frigjøring av GLP-1 fra primære murine kolonepitelceller. Som vist i figur 8A, stimulerte primære muse-kolonepitelceller behandlet med henholdsvis 2 mM eddiksyre, propionsyre og smørsyre signifikant GLP-1-frigjøring, i samsvar med tidligere studier.29,30 På samme måte stimulerte alle F-Con, F-DSS og F-BLG (tilsvarende 0,25 g avføring) i stor grad frigjøringen av GLP-1 fra primære murine kolonepitelceller. Det er verdt å merke seg at mengden GLP-1 som ble frigjort av F-DSS-behandlede primære muse-kolonepitelceller var mye lavere enn for F-Con. og F-BLG-behandlede primære musekoloniske epitelceller. (Figur 8B). Disse dataene tyder på at BLG-behandling betydelig gjenopprettet intestinal SCFA-avledet GLP-1-produksjon.
Figur 8 BLG-avledet SCFA stimulerer GLP-1-frigjøring fra primære murine kolonepitelceller. (A) Eddiksyre, propionsyre og smørsyre stimulerte frigjøringen av GLP-1 fra primære murine kolonepitelceller; (B) fekale ekstrakter F-Con, F-DSS og F-BLG stimulerte primære murine kolonepitelceller Mengde frigjort GLP-1. Alikvoter av kolonepitelceller ble plassert i petriskåler med glassbunn og behandlet med henholdsvis 2 mM eddiksyre, propionsyre, smørsyre og fekale ekstrakter F-Con, F-DSS og F-BLG (tilsvarende 0,25 g avføring). 2 timer ved 37 °C, henholdsvis 5 % CO2. Mengden GLP-1 frigjort fra primære murine kolonepitelceller ble detektert ved ELISA. Data presenteres som gjennomsnitt ± SEM (n = 3). #p < 0,05 eller ##p < 0,01 vs. blank eller F-Con; *p < 0,05 vs. F-DSS.
Forkortelser: Ace, eddiksyre; Pro, propionsyre; imidlertid smørsyre; F-Con, avføringsekstrakt fra kontrollmus; F-DSS, avføringsekstrakt fra kolittmus; F-BLG, fra BLG-behandlet kolon. Avføringsekstrakter fra inflammatoriske mus.
UC er oppført av Verdens helseorganisasjon som en refraktær sykdom, og er i ferd med å bli en global fare; Effektive metoder for å forutsi, forebygge og behandle sykdommen er imidlertid fortsatt begrenset. Derfor er det et presserende behov for å utforske og utvikle nye trygge og effektive terapeutiske strategier for UC. Tradisjonelle kinesiske medisinpreparater er et lovende alternativ fordi mange tradisjonelle kinesiske medisinpreparater har vist seg å være effektive i behandlingen av UC i den kinesiske befolkningen gjennom århundrene, og de er alle biologiske, organiske stoffer og naturlige materialer som stort sett er ufarlige for mennesker og dyr.31,32 Denne studien hadde som mål å søke etter et trygt og effektivt tradisjonelt kinesisk medisinpreparat for behandling av UC og å utforske dets virkningsmekanisme. BLG er en velkjent kinesisk urteformel som brukes til å behandle influensa.8,33 Arbeid i vårt laboratorium og andre har vist at indigo, et bearbeidet tradisjonelt kinesisk medisinprodukt fra samme råmateriale som BLG, viser betydelig effekt i behandlingen av UC hos mennesker og dyr.4,34 Imidlertid er anti-kolitt-effektene av BLG og dens effekter Mekanismen uklar. I den nåværende studien viser resultatene våre at BLG effektivt demper DSS-indusert kolonbetennelse, som er assosiert med modulering av tarmfunksjon. mikrobiota og gjenoppretting av GLP-1-produksjon fra tarmen.
Det er velkjent at UC er karakterisert av tilbakefallende perioder med typiske kliniske trekk, som vekttap, diaré, rektal blødning og omfattende skade på tykktarmsslimhinnen.35 Kronisk tilbakefallende kolitt ble derfor administrert ved å administrere tre sykluser med 1,8 % DSS i fem dager, etterfulgt av syv dager med drikkevann. Som vist i figur 1B, indikerte fluktuerende vekttap og DAI-score vellykket induksjon av kronisk tilbakefallende kolitt. Mus i gruppen behandlet med BLG viste oppovergående bedring fra dag 8, som var signifikant forskjellig fra dag 24. De samme endringene ble også observert i DAI-score, noe som tyder på en forbedring i den kliniske forbedringen av kolitt. Når det gjelder tykktarmsskade og inflammatorisk status, ble tykktarmslengde, tykktarmsvevsskade og genuttrykk og produksjon av de proinflammatoriske cytokinene TNF-α, IL-1β og IL-6 i tykktarmsvev også betydelig forbedret etter BLG-behandling. Samlet sett viser disse resultatene tydelig at BLG er effektivt i behandlingen av kronisk tilbakefallende kolitt hos mus.
Hvordan utøver BLG sine farmakologiske effekter? Tallrike tidligere studier har vist at tarmfloraen spiller en nøkkelrolle i patogenesen til UC, og mikrobiombaserte og mikrobiommålrettede terapier har dukket opp som en svært attraktiv strategi for behandling av UC. I denne studien viste vi at BLG-behandling resulterte i betydelige endringer i tarmfloraens sammensetning, noe som tyder på at den beskyttende effekten av BLG mot DSS-indusert kolitt er relatert til modulering av tarmfloraen. Denne observasjonen er i samsvar med antagelsen om at omprogrammering av homeostasen til tarmfloraen er en viktig tilnærming for å forstå effekten av TCM-preparater.36,37 Det er verdt å merke seg at Akkermansia er en gramnegativ og strengt anaerob bakterie som lever i slimlaget i tarmen, som bryter ned muciner, produserer propionsyre, stimulerer differensiering av slimceller og opprettholder slimhinnens barriereintegritet.26 Flere kliniske og dyredata tyder på at Akkermansia er sterkt assosiert med sunn slimhinne38 og oral administrering av Akkermansia spp. kan forbedre slimhinnebetennelse betydelig.39 Våre nåværende data tyder på at den relative forekomsten av Akkermansia økes betydelig etter BLG-behandling. I tillegg er Prevotellaceae_UCG-001 en SCFA-produserende bakterie.27 Flere studier viste at Prevotellaceae_UCG-001 ble funnet i lav relativ forekomst i avføringen til dyr med kolitt.40,41 Våre nåværende data viser også at BLG-behandling kan øke den relative forekomsten av Prevotellaceae_UCG-001 betydelig i tykktarmen til DSS-behandlede mus. I motsetning til dette er Oscillibacter en mesofil, strengt anaerob bakterie.42 rapporterte at den relative forekomsten av Oscillibacter var betydelig økt hos UC-mus og var signifikant positivt korrelert med IL-6- og IL-1β-nivåer og patologiske poengsummer.43,44 Det er verdt å merke seg at BLG-behandling reduserte den relative forekomsten av Oscillibacter i avføringen til DSS-behandlede mus betydelig. Det er verdt å merke seg at disse BLG-endrede bakteriene var de mest SCFA-produserende bakteriene. Tallrike tidligere studier har vist de potensielle gunstige effektene av SCFA-er. på betennelse i tykktarmen og beskyttelse av tarmepitelets integritet.45,46 Våre nåværende data observerte også at konsentrasjonene av SCFA-acetat, propionat og butyrat i DSS-behandlet avføring var kraftig økt hos BLG-behandlede mus. Samlet sett viser disse funnene tydelig at BLG-behandling effektivt kan forsterke DSS-induserte SCFA-produserende bakterier hos mus med kronisk tilbakefallende kolitt.
GLP-1 er et inkretin som hovedsakelig produseres i ileum og tykktarm, og spiller en viktig rolle i å forsinke tømming av magesekken og senke postprandial blodsukker.47 Det finnes bevis som tyder på at dipeptidylpeptidase (DPP)-4, en GLP-1-reseptoragonist og en GLP-1-nanomedisin effektivt kan lindre tarmbetennelse hos mus.48-51 Som rapportert i tidligere studier, var høye SCFA-konsentrasjoner assosiert med plasma-GLP-1-nivåer hos mennesker og mus. 52 Våre nåværende data viser at etter BLG-behandling økte serum-GLP-1-nivåene og Gcg mRNA-ekspresjonen betydelig. På samme måte økte GLP-1-sekresjonen betydelig i tykktarmskulturer etter stimulering med fekale ekstrakter fra BLG-behandlede kolittmus sammenlignet med stimulering med fekale ekstrakter fra DSS-behandlede kolittmus. Hvordan påvirker SCFA-er frigjøringen av GLP-1? Gwen Tolhurst et al. rapporterte at SCFA kan stimulere GLP-1-sekresjon gjennom GRP43 og GPR41.29 Våre nåværende data viser også at BLG-behandling øker mRNA-ekspresjonen av GRP43 og GPR41 betydelig i tykktarmen hos DSS-behandlede mus. Disse dataene antyder at BLG-behandling kan gjenopprette SCFA-fremmet GLP-1-produksjon ved å aktivere GRP43 og GPR41.
BLG er et langtids reseptfritt legemiddel i Kina. Den maksimalt tolererte dosen av BLG hos Kunming-mus er 80 g/kg, og ingen akutt toksisitet er observert.53 For tiden er den anbefalte dosen av BLG (uten sukker) hos mennesker 9–15 g/dag (3 ganger daglig). Studien vår viste at BLG ved 1 g/kg lindret DSS-indusert kronisk tilbakefallende kolitt hos mus. Denne dosen er nær BLG-dosen som brukes klinisk. Studien vår fant også at virkningsmekanismen, i det minste delvis, medieres av endringer i tarmmikrobiotaen, spesielt SCFA-produserende bakterier, som Akkermansia og Prevotellaceae_UCG-001, for å gjenopprette tarmavledet GLP-1-produksjon. Disse funnene tyder på at BLG fortjener ytterligere vurdering som et potensielt terapeutisk middel for klinisk kolittbehandling. Imidlertid gjenstår den nøyaktige mekanismen for hvordan det modulerer tarmmikrobiotaen, å bekrefte hos mus med mikrobiota-defekter og fekal bakterietransplantasjon.
Ess, eddiksyre; men, smørsyre; BLG, pandan; DSS, dekstran-natriumsulfat; DAI, sykdomsaktivitetsindeks; DPP, dipeptidylpeptidase; FID, flammeioniseringsdetektor; F-Con, kontroll Fekale ekstrakter fra mus; F-DSS, fekale ekstrakter fra DSS-kolittmus; F-BLG, fekale ekstrakter fra BLG-behandlede kolittmus; GLP-1, glukagonlignende peptid-1; Gcg, glukagon; gasskromatografi, gasskromatografi; GRP43, G-proteinkoblet reseptor 43; GRP41, G-proteinkoblet reseptor 41; H&E, hematoksylin-eosin; HBSS, Hanks' balanserte saltløsning; OTC, OTC; PCA, hovedkomponentanalyse; PCoA, hovedkoordinatanalyse; Pro, propionsyre; SASP, sulfasalazin; SCFA, kortkjedede fettsyrer; kinesisk medisin, tradisjonell kinesisk medisin; UC, ulcerøs kolitt.
Alle forsøksprotokoller ble godkjent av dyreetikkkomiteen ved Peking University Shenzhen-Hong Kong University of Science and Technology Medical Center (Shenzhen, Kina) i henhold til institusjonelle retningslinjer og dyreforskrifter (etikknummer A2020157).
Alle forfattere ga betydelige bidrag til konsept og design, datainnsamling eller dataanalyse og -tolkning; deltok i utarbeidelsen av artikkelen eller kritisk revisjon av viktig intellektuelt innhold; gikk med på å sende manuskriptet til det aktuelle tidsskriftet; godkjente endelig versjonen for publisering; var ansvarlige for alle aspekter av arbeidet.
Dette arbeidet ble støttet av National Natural Science Foundation of China (81560676 og 81660479), førsteklassesprosjektet til Shenzhen University (86000000210), Shenzhen Science and Technology Innovation Committee Fund (JCYJ20210324093810026), og Guangdong Provincial Medical Science and Technology Research Fund (A2020157 og A2020272), Guizhou Medical University Pharmacy Guizhou Province finansiert av Key Laboratory (YWZJ2020-01) og Peking University Shenzhen Hospital (JCYJ2018009).
1. Tang B, Zhu J, Zhang B, et al. Terapeutisk potensial for triptolid som et antiinflammatorisk middel ved dekstran-natriumsulfat-indusert eksperimentell kolitt hos mus. pre-immune.2020;11:592084.doi: 10.3389/fimmu.2020.592084
2. Kaplan GG. Den globale byrden av IBD: fra 2015 til 2025. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 2015;12:720–727.doi: 10.1038/nrgastro.2015.150
3. Peng J, Zheng TT, Li Xue mfl. Planteavledede alkaloider: lovende sykdomsmodifikatorer ved inflammatorisk tarmsykdom. Prepharmacology.2019;10:351.doi:10.3389/fphar.2019.00351
4. Xiao Haiteng, Peng Jie, Wen B, et al. Indigo Naturalis hemmer oksidativt stress i tykktarmen og Th1/Th17-responser ved DSS-indusert kolitt hos mus. Oxid Med Cell Longev. 2019;2019:9480945.doi: 10.1155/2019/9480945
5. Chen M, Ding Y, Tong Z. Effekt og sikkerhet av Sophora flavescens (Sophora flavescens) kinesisk urtemedisin i behandlingen av ulcerøs kolitt: klinisk bevis og potensielle mekanismer. Prepharmacology.2020;11:603476.doi:10.3389/fphar.2020.603476
6. Cao Fang, Liu Jie, Sha Benxing, Pan HF. Naturprodukter: eksperimentelt effektive legemidler for behandling av inflammatorisk tarmsykdom. Curr Pharmaceuticals. 2019;25:4893–4913.doi: 10.2174/1381612825666191216154224
7. Zhang C, Jiang M, Lu A. Refleksjoner rundt adjuvant behandling av ulcerøs kolitt med tradisjonell kinesisk medisin. Clinical Rev Allergy Immunization. 2013;44:274–283.doi: 10.1007/s12016-012-8328-9
8. Li Zhongteng, Li Li, Chen TT, et al. Effekt og sikkerhet av Banlangen-granulat i behandlingen av sesonginfluensa: en studieprotokoll for en randomisert kontrollert studie. trial.2015;16:126.doi: 10.1186/s13063-015-0645-x