Takk for at du besøker Nature.com. Nettleserversjonen du bruker har begrenset støtte for CSS. For best mulig opplevelse anbefaler vi at du bruker en oppdatert nettleser (eller slår av kompatibilitetsmodus i Internet Explorer). I mellomtiden, for å sikre fortsatt støtte, vil vi vise nettstedet uten stiler og JavaScript.
I motsetning til virveldyr antas insekter å mangle hann-pregede kjønnssteroidhormoner. Hos Anopheles gambiae ser det ut til at ecdyson-steroidet 20-hydroksyecdyson (20E) har utviklet seg for å kontrollere eggutvikling når det syntetiseres av hunner2 og for å indusere en paringsrefraktær periode når det overføres seksuelt av hanner3. Siden eggutvikling og paring er essensielle reproduksjonsegenskaper, kan det å forstå hvordan hunnmygg hos Anopheles integrerer disse hormonelle signalene legge til rette for utformingen av nye malariakontrollprogrammer. Her avslører vi at disse reproduksjonsfunksjonene reguleres av forskjellige kjønnssteroider gjennom et komplekst nettverk av ecdysteroid-aktiverende/inaktiverende enzymer. Vi identifiserte et hannspesifikt oksidert ecdyson, 3-dehydro-20E (3D20E), som beskytter foreldreskapet ved å stenge ned hunnens seksuelle mottakelighet etter seksuell overføring og aktivering ved defosforylering. Det er verdt å merke seg at 3D20E-overføring også induserte uttrykket av reproduksjonsgener som opprettholder eggutvikling under Plasmodium-infeksjon, noe som sikrer helsen til infiserte hunner. Hunn-avledet 20E fremkaller ikke en seksuell respons. men lar parende individer legge egg etter at 20E-hemmende kinaser er hemmet. Identifiseringen av dette hannspesifikke insektsteroidhormonet og dets rolle i å regulere kvinnelig seksuell mottakelighet, fruktbarhet og interaksjon med Plasmodium antyder potensialet for å redusere reproduksjonssuksessen til malariaoverførende mygg.
Malariatilfeller og dødsfall er økende igjen4 på grunn av utbredt insektmiddelresistens hos Anopheles-mygg, den eneste vektoren for menneskelige malariaparasitter. Paringsbiologien til disse myggene er et spesielt attraktivt mål for nye malariakontrolltiltak fordi hunnene bare parer seg én gang5. Å gjøre denne ene paringshendelsen steril ville ha et stort potensial for å redusere myggbestandene i felten.
Kvinner blir seksuelt umyndige etter å ha mottatt steroidhormoner i høy titer fra menn. Studier har vist at utløseren for vanskeligheter med videre paring er 20-hydroksyecdyson (20E), et steroidhormon bedre kjent som en regulator av mytesyklusen i larvestadiet. Hannenes evne til å syntetisere og overføre 20E har utviklet seg spesifikt hos Anopheles-arter som er en del av underslekten Cellia7, som er distribuert i Afrika og inkluderer de farligste vektorene for malaria, inkludert Anopheles gambiae. Dette er spesielt bemerkelsesverdig fordi hunner i disse artene også produserer 20E etter hvert blodmåltid, og 20E driver oogenesesyklusen (se ref. 8). Imidlertid er det lite kjent om hvordan hunner integrerer signaler fra to forskjellige kilder til ecdyson (overføring hos hannene og induksjon av blodføding) uten å kompromittere deres egen evne til å pare seg. Faktisk, hvis 20E produsert av hunnene utløser seksuell intoleranse, vil dette føre til infertilitet hos individer som spiser jomfruer, en veldig vanlig oppførsel hos disse myggene5.
En mulig forklaring er at hanner av A. gambiae overfører et modifisert hannspesifikt ekdyson, som aktiverer en signalkaskade i den kvinnelige reproduksjonskanalen, noe som resulterer i ustabilitet i paringen. Selv om virveldyr har flere steroidhormoner, som østrogen og androgen (gjennomgått i ref. 9), har vi så vidt vi vet ikke identifisert androgene steroider hos insekter.
Vi satte oss fore å bestemme repertoaret av steroidhormoner i den hannlige accessoriske kjertel (MAG) hos kjønnsmodne A. gambiae på jakt etter mulige modifiserende steroider. Ved å bruke høytrykksvæskekromatografi kombinert med tandemmassespektrometri (HPLC-MS/MS) i stedet for den mindre spesifikke metoden som tidligere ble brukt, oppdaget vi ecdyson (E) og 20E i dette vevet, noe som bekreftet tidligere resultat. Prøven var imidlertid dominert av oksiderte fosforylerte steroider, i samsvar med formelen 3-dehydro-20E-22-fosfat (3D20E22P)12 (figur 1). Andre former inkluderer 3-dehydro-20E (3D20E) og 20E-22-fosfat (20E22P). HPLC-MS/MS-signalintensiteten til 3D20E22P var to størrelsesordener høyere enn den defosforylerte formen, 3D20E, og tre størrelsesordener høyere enn for E og 20E (figur 1). Selv om det i andre deler av kroppen og ... nedre reproduksjonstrakt (LRT; Utvidede data fig. 1a). Vi analyserte også ekdysteroider hos nylig lukkede (<1 dag gamle) hanner og hunner og oppdaget kun 3D20E og 3D20E22P i MAG; E, 20E og 20E22P var tilstede hos begge kjønn (Utvidede data fig. 1b). Disse dataene antyder at voksne hanner av A. gambiae produserer høye titere av modifiserende hormoner i sine MAG-er som ikke syntetiseres av hunner.
MAG og hunnlig LRT (inkludert atrier, sædblærer og parovarium) ble dissekert fra 4 dager gamle (4 dager gamle) jomfruelige hanner og jomfruelige og parede hunner (0,5, 3 og 12 hpm). Ecdyson i disse vevene ble analysert ved HPLC-MS/MS (gjennomsnitt ± sem; uparet t-test, tosidig, korrigert for falsk oppdagelsesrate (FDR); NS, ikke signifikant; *P < 0,05, **P < 0,01. 3D20E: 3 timer vs. 0,5 timer, P = 0,035; 12 timer vs. 3 timer, P = 0,0015; 12 timer vs. 0,5 timer, P = 0,030. 3D20E22P: 3 timer vs. 0,5 timer, P = 0,25; 12 timer vs. 3 timer, P = 0,0032; 12 timer vs. 0,5 timer, P = 0,015). Dataene er fra tre biologiske replikater. Topparealet for hvert ecdyson av interesse ble beregnet og normalisert etter antall mygg. Ecdyson er representert med farge som følger: E, grønn; 20E, oransje; 20E22P, lilla; 3D20E, blå; 3D20E22P, rosa. Innsettet øker skalaen på y-aksen for å vise lavere ecdysonnivåer.
For å undersøke om 3D20E22P og 3D20E overføres under paring, dissekerte vi hunnlige LRT-er på forskjellige tidspunkter etter paring. Selv om ecdyson ikke ble funnet hos jomfruer, observerte vi betydelige mengder 3D20E22P i LRT-en umiddelbart etter paring (0,5 timer etter paring, tpm), som minket over tid, mens 3D20E-nivåene økte betydelig (fig. 1). Ved å bruke kjemisk syntetisert 3D20E som standard, bestemte vi at nivåene av dette steroidhormonet i parings-LRT-er var minst 100 ganger høyere enn 20E (utvidet datatabell 1). Dermed er 3D20E22P det viktigste hannlige ecdysonet som overføres til den kvinnelige LRT-en under paring, og dets defosforylerte form, 3D20E, blir svært rikelig kort tid etter paring. Dette antyder en viktig rolle for sistnevnte ecdyson i hunners biologi etter paring.
Etter å ha generert et nytt RNA-sekvenseringsdatasett (RNA-seq) (fig. 2a), ved hjelp av en spesialbygd bioinformatikk-pipeline, søkte vi etter ecdysone kinase (EcK), ecdysone oksidase (EO) og ecdysone som koder for 20E-modifisert fosfatase-gen. EPP) uttrykkes i reproduktive vev. Vi identifiserte ett kandidat-EPP-gen og to potensielle EcK-gener (EcK1 og EcK2), men klarte ikke å finne et godt kandidat-EO-gen. Det er verdt å merke seg at individuelle EPP-gener ble uttrykt på høye nivåer (98,9. persentil) i gambiske MAG-er, men ikke i kvinnelige LRT-er (fig. 2b), i motsetning til våre forventninger siden defosforylering av 3D20E22P skjedde i dette kvinnelige vevet. Derfor tror vi at mannlig EPP kan overføres under paring. Vi brukte faktisk stabil isotopmerking in vivo for å maskere det kvinnelige proteinet etter paring, et enzym identifisert av MS i det kvinnelige atriumet (fig. 2c og tilleggstabell 1). Tilstedeværelsen av EPP i MAG og paret (men ikke jomfruelig) hunn-LRT ble også bekreftet ved bruk av spesifikke antistoffer (fig. 2d).
a, En spesialbygd bioinformatisk pipeline for å søke i reproduksjonsvevet til hvert kjønn etter gener som koder for EcK-er, EO-er og EPP-er. Tallene ved siden av pilene indikerer antall mannlige og kvinnelige kandidater på hvert trinn. Denne analysen identifiserte ett EPP-gen (EPP) og ett EcK-gen (EcK1) som uttrykkes hos hanner, og ett EcK-gen (EcK2) som uttrykkes hos begge kjønn, men ikke gir et kandidat-EO-gen. b, Varmekart som sammenligner kandidatgenuttrykk i jomfruelig (V) og paringsvev (M) Anopheles gambiae og Anopheles albicans. Spca, befruktning; MAG-er, tilbehørskjertler hos hanner; andre deler av kroppen, inkludert bryster, vinger, ben, fettlegemer og indre organer hos begge kjønn, og eggstokker hos hunner. EcK2 er høyt uttrykt i både MAG og atrier i Gambia, mens EPP bare finnes i MAG.c, Proteomisk analyse av translokasjon av mannlig ejakulatgruppe til kvinnelige atrier ved 3, 12 og 24 hpm, som viser de 67 mest forekommende proteinene. Hunnene ble oppdrettet på en diett som inneholdt 15N for å merke (og maskere) alle proteiner. Umerkede hanner ble paret med merkede hunner, og hunnlige LRT-er ble dissekert ved 3, 12 og 24 hpm for proteomisk analyse (se tilleggstabell 1 for en fullstendig liste over ejakulasjonsproteiner). Innsatt, EPP, Eck1 og EcK2 ble påvist i MAG hos jomfruelige hanner ved proteomisk analyse av disse vevene.d, EPP ble påvist ved western blot i MAG og LRT hos parede hunner, men ikke hos jomfruelige hunner eller hanner eller resten av kvinnekroppen. Membraner ble samtidig undersøkt med anti-aktin (belastningskontroll) og anti-EPP-antistoffer. Alle menn er jomfruer. Se tilleggsfigur 1 for data fra gelkilden. Western blots ble utført to ganger med lignende resultater.
EPPs ekdysteroidfosfofosfataseaktivitet ble verifisert etter inkubasjon ved HPLC-MS/MS med 3D20E22P isolert fra MAG (utvidede data fig. 2a). Videre, da vi stilnet EPP ved RNA-mediert interferens (RNAi), oppdaget vi en sterk reduksjon i fosfataseaktivitet i reproduksjonsvevet til disse hannene (fig. 3a), og hunner paret med EPP-stilte hanner viste signifikant lavere andel defosforylert 3D20E (fig. 3b) til tross for delvis gensilencing (utvidede data fig. 2b, c). I motsetning til dette oppdaget vi ikke signifikante endringer i 20E22P/20E-forholdet hos de samme myggene, noe som kan tyde på at enzymet er spesifikt for 3D20E22P (fig. 3b).
a, Redusert fosfataseaktivitet i MAG forårsaket av EPP-silencing ved bruk av dobbelttrådet EPP RNA (dsEPP) eller dobbelttrådet GFP RNA (dsGFP) kontroller. Tjue MAG-pooler ble brukt i hvert replikat (P = 0,0046, paret t-test, tosidig), representert med separate prikker. b, Hunner paret med EPP-silenced hanner hadde en betydelig lavere andel defosforylert 3D20E ved 3 hpm (P = 0,0043, uparet t-test, tosidig), mens 20E-nivåene var upåvirket (P = 0,063, uparet). t-test, tosidig). Data presenteres som gjennomsnitt ± sem fra tre grupper med 13, 16 og 19 hunner hver.c, Hunner paret med EPP-silenced hanner hadde signifikant høyere rater for reparing (P = 0,0002, Fishers eksakte test, tosidig). Hunnene ble først tvunget til å pare seg for å sikre paringsstatusen sin; To dager senere ble de kontaktet med andre hanner med transgen sæd for å vurdere repareringsrater ved kvantitativ PCR-deteksjon av transgenet.d. Blodforede hunner paret med EPP-silenced hanner hadde betydelig redusert fruktbarhet (P < 0,0001; Mann-Whitney-test, tosidig) og litt redusert antall egg (P = 0,088, Mann-Whitney-test, tosidig), mens gytehastigheten ikke ble påvirket (P = 0,94, Fishers eksakte test, tosidig). I alle paneler representerer n antall biologisk uavhengige myggprøver.NS, ikke signifikant.*P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001, ****P < 0,001.
Deretter vurderte vi om ecdyson-defosforylering er viktig for å indusere paringsresistens hos hunner. Det er verdt å merke seg at hunner paret med EPP-utarmede hanner paret seg på nytt med en mye høyere frekvens (44,9 %) enn kontrollhunner (10,4 %) når de ble eksponert for ytterligere (transgene) hanner (fig. 3c). Vi observerte også en betydelig reduksjon i fruktbarhet (fig. 3d, venstre) og en liten reduksjon i antall egg lagt av disse hunnene (fig. 3d, midten), mens prosentandelen egg lagt av hunner (en annen respons fremkalt hos hunner ved paring) ikke ble påvirket (fig. 3d, høyre). Gitt den observerte spesifisiteten til EPP for 3D20E22P, tyder disse resultatene på at aktiveringen av 3D20E av EPP overført under paring kan ha en viktig rolle i å slå av hunnens mottakelighet for videre paring, en atferd som tidligere ble tilskrevet seksuell overføring av 20E. Derfor påvirker dette hannspesifikke hormonet også sterkt hunnens fruktbarhet.
Deretter sammenlignet vi aktivitetene til 20E og 3D20E i injeksjonseksperimenter hos kjønnsmodne jomfruer ved bruk av kjemisk syntetisert 3D20E (fig. 4a–c) og kommersielt tilgjengelig 20E. Vi observerte at 3D20E var betydelig mer effektivt enn 20E i å slå av hunnenes følsomhet for paring ved begge konsentrasjoner (fig. 4d). Det er verdt å merke seg at halvparten av det fysiologiske nivået av 3D20E i LRT (1066 pg etter injeksjon vs. 2022 pg etter paring) induserte en andel refraktære hunner som var 20 ganger høyere enn det fysiologiske nivået av 20E (361 pg etter injeksjon) 24 timer etter injeksjon ved den høyeste konsentrasjonen 18 pg etter paring; Utvidet datatabell 1). Dette resultatet er i samsvar med antagelsen om at seksuell overføring av 20E ikke forårsaker paringsrefraktære perioder, og peker videre på 3D20E som en viktig faktor for å sikre foreldre-barn-forholdet. 3D20E var også betydelig mer aktiv enn 20E i eggleggingstester hos jomfruhunner (fig. 4e), noe som tyder på at den normale eggleggingsraten vi observerte etter delvis EPP-silencing skyldtes tilstedeværelsen av gjenværende 3D20E-aktivitet fortsatt produsert av paringsinduserte hunnfaktorer.
(a, b) 3D20E kjemisk syntetisert fra 20E (a) med svært høy konvertering/effektivitet (data presentert som gjennomsnitt ± sem fra tre uavhengige syntesereaksjoner) (b).c, Massespekteret (nederste halvdel) samsvarer nøyaktig med ecdyson funnet i paret hunn-LRT (øverste halvdel).d, Sammenlignet med 20E (0,63 µg, P = 0,02; 0,21 µg, P < 0,0001; Fishers eksakte test, tosidig) og 10 % etanol (0,63 µg, P < 0,0001; 0,21 µg, P < 0,0001; Fishers eksakte test, tosidig), mens 20E var signifikant høyere enn kontrollen bare ved høyere doser (0,63 µg, P = 0,0002; 0,21 µg, P = 0,54; Fishers eksakte test, tosidig).e, 3D20E Injeksjon induserte signifikant høyere gyteringsrater hos jomfruhunner enn kontroller som fikk 10 % etanol (0,21 µg, P < 0,0001; 0,13 µg, P = 0,0003; Fishers eksakte test, tosidig), mens 20E sammenlignet med kontroller. Bare ved høyere doser (0,21 µg, P = 0,022; 0,13 µg, P = 0,0823; Fishers eksakte test, tosidig). 3D20E induserte signifikant høyere gyteringsrater enn 20E ved høyere doser (0,21 µg, P = 0,0019; 0,13 µg, P = 0,075; Fishers eksakte test, tosidig). I alle paneler representerer n antall biologisk uavhengige myggprøver. NS, ikke signifikant. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001, ****P < 0,001. Dataene er fra tre replikater.
I tidligere studier har vi fastslått at seksuell overføring av steroidhormoner induserer uttrykket av MISO (Mating-Induced Stimulator of Oogenesis 11), et kvinnelig reproduksjonsgen som beskytter hunner av A. gambiae mot P. falciparum-infeksjon. Helsekostnader forårsaket av 13, den dødeligste menneskelige malariaparasitten. Gitt viktigheten av MISO for den reproduktive formen til Anopheles i malaria-endemiske områder, bestemte vi oss for å bestemme hvilket hormon 3D20E eller 20E som utløser uttrykket av dette genet. Vi fant at mens 20E-injeksjon spesifikt eller mer potent induserte noen nukleære hormonreseptorer (HR), som HR3 og HR4, og typiske nedstrøms steroidmål, som de yolkogene genene Vg14, 15, 16, ble MISO sterkere indusert av 3D20E (Utvidede data fig. 3). Dermed ser det ut til at seksuell overføring av dette androgene steroidhormonet induserer mekanismer som beskytter hunner mot kostnadene ved parasittinfeksjon. Videre påvirker 3D20E differensielt begge isoformene av E-reseptoren EcR, som induserer EcR-A og undertrykker EcR-B, og som i enda sterkere grad utløser andre paringsinduserende gener, inkludert HPX15, som påvirker hunnens fertilitet. Dette kan forklare den betydelige infertiliteten som observeres hos hunner paret med EPP-stillede hanner (Utvidede data fig. 3). Disse dataene antyder eksistensen av nedstrøms signalveier som fortrinnsvis aktiveres av to ecdysonhormoner som kan ligge til grunn for kjønnsspesifikk funksjon.
Deretter testet vi funksjonen til de to EcK-genene som er identifisert i vår bioinformatiske pipeline. Å dempe EcK1 eller EcK2 resulterte i betydelig dødelighet hos menn (Utvidede data fig. 4a), noe som tyder på at fosforylering av ecdyson, og dermed inaktivering, er viktig for overlevelse. Fordi EcK2 ble uttrykt på høyere nivåer enn EcK1 og ble detektert i MAG-er ved proteomikk (fig. 2b, c og tilleggstabell 2), validerte vi dens ecdysteroidkinaseaktivitet ved å inkubere den med 20E, noe som resulterte i fosforylering av 20E22P (Utvidede data figur 2).4b). Ved bruk av 3D20E som substrat, klarte vi ikke å detektere det fosforylerte produktet 3D20E22P (Utvidede data fig. 4c), noe som tyder på at 20E snarere enn 3D20E kan være det foretrukne målet for EcK2.
I følge vår RNA-sekvenseringsanalyse ble EcK2 også høyt uttrykt i LRT hos jomfruhunner, hvor det ble slått av etter paring (fig. 2b). Vi bekreftet disse dataene og bestemte at EcK2-ekspresjon ikke ble påvirket av blodføding (utvidede data fig. 5a). Ved å utvide våre første MS-eksperimenter bestemte vi at toppen av 20E22P var nært relatert til toppen av 20E (22–26 timer etter blodmåltid; utvidede data fig. 5b). Silensing av EcK2 hos jomfruhunner resulterte i en tredobling i det relative forholdet mellom 20E og 20E22P 26 timer etter blodmåltid (utvidede data figur 2c og 5c), noe som bekrefter at EcK2 også fosforylerer 20E hos hunner. Det er verdt å merke seg at EcK2-uttømte jomfruer opprettholdt full seksuell mottakelighet (utvidede data fig. 5d,e), noe som ytterligere tyder på at hunnproduksjon av 20E ikke induserer paringsrefraktære perioder. Imidlertid hadde disse hunnene betydelig økte eggleggingsrater sammenlignet med kontrollgruppen, med mer enn 30 % av jomfruene som la egg (Utvidede data fig. 5f). Hvis dobbelttrådet Eck2 RNA (dsEcK2)-injeksjoner ble utført etter blodforing, forekom ikke gyting, og da hadde 20E-toppen på grunn av blodinntak sunket. Totalt sett støtter disse resultatene en modell om at 20E produsert etter blodsuging kan indusere gyting, men bare når gyteblokkeringen (EcK2 og muligens andre faktorer) slås av ved paring. Verken 20E- eller 3D20E-injeksjoner hemmet EcK2-ekspresjon hos jomfruer (Utvidede data fig. 5g), noe som tyder på at andre faktorer medierer hemmingen av denne kinasen. Imidlertid var 20E-nivåene etter blodforing ikke tilstrekkelige til å indusere ubehag ved paring, men ble effektivt utløst av høye titere av seksuelt overført 3D20E.
Resultatene våre gir viktig innsikt i mekanismene som regulerer reproduksjonssuksessen til A. gambiae. En modell har dukket opp der hanner har utviklet seg til å syntetisere høye titere av 3D20E, et hannspesifikt modifisert ekdyson som sikrer avstamning ved å desensibilisere hunnene for videre paring. Samtidig har disse malariavektorene også utviklet et effektivt system for å aktivere 3D20E hos hunner som respons på seksuell overføring av hannspesifikk EPP. Så vidt vi vet, er dette det første eksemplet på et hann- og hunndominert steroidhormonsystem som utfører en unik og kritisk funksjon hos insekter. Hannspesifikk ekdysonfunksjon har blitt postulert, men ikke definitivt demonstrert. For eksempel er en i stor grad motbevist hypotese 18 at disse funksjonene kan utføres av 20E-forløperen E1. Det er velkjent at i Drosophila utløses monandri av seksuell overføring av små kjønnspeptider 19,20 som samhandler med nevroner som innerverer den kvinnelige reproduksjonskanalen gjennom spesifikke kjønnspeptidreseptorer 21,22. Ytterligere arbeid er nødvendig for å bestemme nedstrøms signalering. kaskader kontrollert av 3D20E hos A. gambiae-hunner og for å avgjøre om disse kaskadene kan bevares mellom mygg og Drosophila.
Gitt den viktige rollen 3D20E spiller på hunners fertilitet og atferd identifisert i vår studie, gir veiene som fører til 3D20E-syntese og -aktivering nye muligheter for fremtidige myggkontrollstrategier, som generering av konkurrerende sterile hanner i sterile insektteknologistrategier for bruk til vill utsetting eller for å imitere 3D20E i jomfruelig lek. Den hannspesifikke funksjonen til 3D20E kan ha utviklet seg da A. gambiae og andre Cellia-arter tilegnet seg evnen til å koagulere sæden sin til paringsplugger, da dette muliggjør effektiv overføring av et stort antall hormoner og hormonaktiverende enzymer. 3D20E-evolusjon som implementerer monandry, gir igjen en mekanisme for hunner (gjennom høyt uttrykk av MISO) til å favorisere deres reproduktive kondisjon i områder med høy malariaprevalens, noe som indirekte bidrar til Plasmodium-overføring. Gitt at hunn-20E har vist seg å ha betydelige effekter på overlevelse og vekst av P. falciparum hos hunn-Anopheles-mygg,24 er både mannlige og kvinnelige steroidhormonveier nå viktige aspekter ved mygg-parasitt-interaksjoner.
A. gambiae G3-stammer ble oppdrettet under standard insektforhold (26–28 °C, 65–80 % relativ fuktighet, 12:12 timers lys/mørke-fotoperiode). Larvene ble fôret med pulverisert fiskefôr (TetraMin Tropical Flakes, Koi Pellets og Tetra Pond Sticks i forholdet 7:7:2). Voksne mygg ble fôret ad libitum med 10 % dekstroseløsning og ukentlig humant blod (studieblodkomponenter). Jomfrumygg ble innhentet ved å separere kjønnene på puppestadiet etter å ha undersøkt endene med mikroskopi. Hanner som bærer DsRed-transgenet har blitt beskrevet tidligere.
Tvangsparingseksperimenter ble utført i henhold til tidligere beskrevne protokoller. For naturlig paring ble 4 dager gamle jomfruhunner holdt i et forhold på 1:3 med kjønnsmodne jomfruhanner i to netter. For eksperimenter der hanner ble injisert med dsEPP, falt samtidig plassering i bur sammen med dag 3–4 etter injeksjon, da fosfataseaktiviteten var maksimalt dempet (Utvidede data fig. 2b).
Myggvev, gjenværende kadavere (resten av kroppen) eller hele kroppen ble dissekert i 100 % metanol og homogenisert med en perlepumpe (2 mm glasskuler, 2400 o/min, 90 sek). Vevsmengder og metanolvolumer var som følger: resten av kroppen, 50 i 1000 µl; MAG, 50–100 µl; hunn-LRT, 25–50 µl. Bunnfallet ble utsatt for en andre metanolekstraksjon med samme volum metanol. Cellerester ble fjernet ved sentrifugering. Metanolen fra begge ekstraksjonene ble kombinert og tørket under nitrogenstrøm, deretter resuspendert i følgende volumer med 80 % metanol i vann: resten av kroppen, 50 µl; MAG-er og hunn-LRT, 30 µl.
Prøvene ble analysert på et massespektrometer (ID-X, Thermo Fisher) koblet til et LC-instrument (Vanquish, Thermo Fisher). 5 µl prøve ble injisert på en 3 µm, 100 × 4,6 mm kolonne (Inspire C8, Dikma) holdt ved 25 °C. De mobile fasene for LC var A (vann, 0,1 % maursyre) og B (acetonitril, 0,1 % maursyre). LC-gradienten var som følger: 5 % B i 1 minutt, deretter økt til 100 % B over 11 minutter. Etter 8 minutter ved 100 %, re-ekvilibrer kolonnen ved 5 % B i 4 minutter. Strømningshastigheten var 0,3 ml min-1. Ionisering i MS-kilden oppnås ved oppvarmet elektrosprayionisering i positive og negative moduser.
Massespektrometeret måler data i m/z-området fra 350 til 680 med 60 000 oppløsning i full MS-modus. MS/MS-data ble innhentet på [M + H]+ (alle mål), [M - H2O + H]+ (alle mål) og [M - H]- (fosforylerte mål). MS/MS-data ble brukt til å bekrefte ekdysonegenskapene til mål som det ikke fantes noen standard for. For å identifisere ikke-målrettede ekdysteroider ble MS/MS-data for alle HPLC-topper med >15 % relativ forekomst analysert. Kvantifiser ved hjelp av standardkurver laget fra rene standarder (20E, 3D20E) for å beregne absolutte mengder eller fortynninger av én spesifikk prøve (alle andre mål) for å beregne deres ekvivalens med mengdene funnet i én hann. For 3D20E ble kvantifisering utført ved hjelp av summen av følgende addukter: [M + TFA]-, [M + COOH]-, [M + Na]+, [M + Cl]-, [M + NO3]-. Data ble ekstrahert og kvantifisert ved hjelp av Tracefinder (versjon 4.1). MS/MS-data ble analysert ved hjelp av Xcalibur (versjon 4.4). MS-spektrene til E, 20E og 3D20E ble sammenlignet med de respektive standardene. 3D20E22P ble analysert ved derivatisering med Girards reagens. 20E22P ble analysert ved m/z-forhold.
3D20E22P ble renset fra MAG. Rensing ble utført i analytisk skala ved bruk av en ultralydsvæskekromatograf (Acquity, Waters) med en kvadrupolmassebasert detektor (QDa, Acquity, Waters) under de samme LC-betingelsene som HPLC-MS/MS-analysen. Fraksjonsinnsamling ble utløst da m/z-verdien som tilsvarer 3D20E22P ble detektert ved samme retensjonstid som tidligere bestemt. Renheten til de ekstraherte forbindelsene ble deretter kontrollert ved HPLC-MS/MS som beskrevet ovenfor.
Totalt RNA ble ekstrahert fra 10–12 reproduktive vev eller andre deler av kroppen (uten hode) ved bruk av TRI-reagens (Thermo Fisher) i henhold til produsentens instruksjoner. RNA ble behandlet med TURBO DNase (Thermo Fisher). cDNA ble syntetisert ved bruk av Moloney murine leukemivirus revers transkriptase (M-MLV RT; Thermo Fisher) i henhold til produsentens instruksjoner. Primere for kvantitativ PCR for revers transkripsjon (RT-qPCR; Extended Data Table 2) ble tidligere publisert24 eller designet ved bruk av Primer-BLAST26, med preferanse gitt til produkter med en størrelse på 70–150 bp og som spenner over ekson-ekson-forbindelser, eller primerparprimere separate eksoner. cDNA-prøver fra tre til fire biologiske replikater ble fortynnet fire ganger i vann for RT-qPCR. Kvantifisering ble utført i 15 µl replikatreaksjoner som inneholdt 1× PowerUp SYBR Green Master Mix (Thermo Fisher), primere og 5 µl fortynnet cDNA. Reaksjonene ble kjørt på en QuantStudio 6 Pro sanntids- PCR-system (Thermo Fisher) og data ble samlet inn og analysert ved hjelp av Design and Analysis (versjon 2.4.3). Som vist i denne studien, ble relative mengder normalisert til ribosomalgenet RpL19 (AGAP004422), hvis uttrykk ikke endret seg signifikant ved blodtilførsel 27 eller paring 3.
RNA-kvaliteten ble kontrollert ved hjelp av en Agilent Bioanalyzer 2100 Bioanalyzer (Agilent). Illumina parvise biblioteker ble utarbeidet og kjørt ved Broad Institute of MIT og Harvard. Sekvenseringsavlesninger ble justert til A. gambiae-genomet (PEST-stamme, versjon 4.12) ved hjelp av HISAT2 (versjon 2.0.5) med standardparametere. Avlesninger med kartleggingskvalitet (MAPQ)-score <30 ble fjernet ved hjelp av Samtools (versjon 1.3.1). Antall avlesninger kartlagt til gener ble telt ved hjelp av htseq-count (versjon 0.9.1) med standardparametere. Normaliserte avlesningstall ble beregnet og differensiell genuttrykk analysert ved hjelp av DESeq2-pakken (versjon 1.28.1) i R (versjon 4.0.3).
Ecdyson-modifiserende genkandidater ble identifisert ved først å søke i A. gambiae-genomet ved hjelp av PSI-BLAST-algoritmen (https://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/executables/blast+/2.8.1/), ved bruk av standardverdier Parametere med følgende spørreproteinsekvenser: fra Bombyx mori (tiltredelsesnr. NP_001038956.1), Musca domestica (tiltredelsesnr. XP_005182020.1, XP_005175332.1 og XP_011294434.1) og Microplitis demolitor (tiltredelsesnr. XP_008552646.1 og XP_008552645.1) EcK fra B. mori (tiltredelsesnr. NP_001036900), Drosophila melanogaster (tiltredelsesnr. NP_651202), Apis mellifera (Tiltredelsesnr. XP_394838) og Acyrthosiphon pisum (tiltredelsesnr. XP_001947166); og EPP fra B. mori (tiltredelsesnr. XP_001947166) NP_001177919.1 og NP_001243996.1) og EO fra D. melanogaster (tiltredelsesnr. NP_572986.1) (trinn 1). Filtrer deretter treff basert på høy mRNA-ekspresjon (>100 fragmenter/kilobaseeksoner per million kartlagte avlesninger (FPKM) eller >85 %) i reproduktivt vev (kvinnelig LRT eller MAG) i Gambia (trinn 2). For å forbedre spesifisiteten valgte vi kandidatenzymer som også uttrykkes i reproduksjonsvevet til A. albimanus, en anopheles-art som ikke syntetiserer eller overfører ecdyson under paring. Kandidatgener ble filtrert basert på lav uttrykk (<100 FPKM eller <85. persentil) i reproduksjonsvev til A. albimanus (trinn 3). Som et siste filter (trinn 4) må kandidatgener tilfredsstille minst ett av følgende: (1) signifikant oppregulert etter paring (P < 0,05) i henhold til analysen av differensielt uttrykte gener og (2) i ikke-reproduksjonsvev (< 85 % eller <100 FPKM).
Vi modifiserte tidligere beskrevne metoder 28,29,30 for å oppnå isotopmerking av hele organismen. Kort fortalt ble villtype Saccharomyces cerevisiae type II (YSC2, Sigma) testet i gjærnitrogenbase (BD Difco, DF0335) som inneholdt (vekt/volum) 2 % glukose (G7528, Sigma), 1,7 % aminosyrefritt og ammoniumsulfatbasert kulturmedium) og 5 % 15N ammoniumsulfat (NLM-713, >99 %, Cambridge Isotope Laboratories) som eneste nitrogenkilde. Gjær ble gjenvunnet ved sentrifugering, og mygglarver ble fôret ad libitum frem til pupping. Tilskudd med fiskemel (0,5 mg per 300 larver) for å forhindre dødelighet i fjerde instar. Bare hunner ble deretter brukt i paringsforsøk med umerkede hanner for å analysere hannproteomet som ble overført under paring.
4–6 dager gamle 15N-merkede jomfruhunner ble tvunget til å pare seg med aldersmatchede, umerkede jomfruhanner. Vellykket paring ble bekreftet ved å detektere paringsplugger under epifluorescensmikroskopi. Ved 3, 12 og 24 timer i minuttet ble atriene til 45–55 parede hunner dissekert i 50 µl ammoniumbikarbonatbuffer (pH 7,8) og homogenisert med en støter. Homogenatet ble sentrifugert, og supernatanten ble blandet med 50 µl 0,1 % RapiGest (186001860, Waters) i 50 mM ammoniumbikarbonat. Supernatanten og pelleten fra hver prøve ble hurtigfrosset på tørris og sendt over natten til MacCoss-laboratoriet ved University of Washington, hvor prøveforberedelsen for LC-MS/MS ble fullført. Resuspender pelleten i 50 µl 0,1 % RapiGest i 50 mM ammoniumbikarbonat og soniker i et vannbad. Proteinkonsentrasjonen i pelleten og supernatanten ble målt ved hjelp av BCA-analyse, prøver ble redusert med 5 mM ditiotreitol (DTT; Sigma), alkylert med 15 mM jodacetamid (Sigma) og inkubert ved 37 °C (1:0:50) i 1 time med trypsinering: trypsin:substratforhold). RapiGest ble lysert ved tilsetning av 200 mM HCl, etterfulgt av inkubering ved 37 °C i 45 minutter og sentrifugering ved 14 000 rpm i 10 minutter ved 4 °C for å fjerne rusk. Prøvene ble vasket ved tomodus fastfaseekstraksjon (Oasis MCX-patroner, Waters) og resuspendert i 0,1 % maursyre for en endelig proteinkonsentrasjon på 0,33 µg µl-1. Umerkede MAG-proteomer ble analysert på lignende måte fra jomfruelige hanner. To analytiske replikater ble analysert for hver prøve. Deretter ble 1 µg av hver analysert ved bruk av en 25 cm smeltet silika 75 μm kolonne med en 4 cm smeltet silika Kasil1 (PQ) frittefelle pakket med Jupiter C12 reversfaseharpiks (Phenomenex) og 180-minutters væskekromatografi. Prøvefordøyelser – MS/MS ble kjørt på et Q-Exactive HF massespektrometer (Thermo Fisher) med et nanoACQUITY UPLC System (Waters). Datarelaterte innsamlingsdata generert for hver kjøring ble konvertert til mzML-format ved hjelp av Proteowizard (versjon 3.0.20287) og ved hjelp av Comet31 (versjon 3.2) mot FASTA-databasen som inneholder proteinsekvenser fra Anopheles gambiae (VectorBase versjon 54), Anopheles coluzzi. Et søk ble utført på Mali-NIH (VectorBase versjon 54), Saccharomyces cerevisiae (Uniprot, mars 2021), A. gambiae RNA-seq og trerammeoversettelser av kjente humane forurensninger. Peptidkart-matchede FDR-er ble bestemt ved hjelp av Percolator32 (versjon 3.05) med en terskel på 0,01, og peptider ble satt sammen til proteinidentifikasjoner ved hjelp av proteinparsimonium i Limelight33 (versjon 2.2.0). Relativ proteinforekomst ble estimert ved hjelp av den normaliserte spektralforekomstfaktoren (NSAF) beregnet for hvert protein i hver kjøring som tidligere beskrevet. NSAF i forhold til hvert protein ble gjennomsnittsberegnt på tvers av prøver fra to forskjellige biologiske replikater. 15N-merking maskerte vellykket det kvinnelige proteomet, selv om en liten mengde umerket protein kunne detekteres fra de merkede jomfruene. Vi registrerte deteksjon av hannproteinreduksjon (1-5 spektre) i rå hunnprøver bare i tekniske kjøringer, der råprøver ble kjørt etter hann-/paringsprøver, som et resultat av HPLC-"overføring". Av og til proteiner funnet som "forurensninger" fra merkede jomfruer er listet opp i tilleggstabell 1.
To antigene peptider, QTTDRVAPAPDQQQ (innenfor isotype PA) og MESDGTTPSGDSEQ (innenfor isotype PA og PB) i Genscript. De to peptidene ble kombinert, deretter konjugert til bærerproteinet KLH og injisert i newzealandske kaniner. Kaninene ble avlivet etter den fjerde injeksjonen, og totalt IgG ble isolert ved affinitetsrensing. IgG fra den mest EPP-spesifikke kaninen ble brukt til videre western blotting.
For western blots, MAG (n = 10, hvor n representerer antall biologisk uavhengige myggprøver) og hunn-LRT (n = 30) fra 4 dager gamle jomfruelige hanner og jomfruelige eller tvangsparede hunner (<10 etter paring), ble proteinekstraksjonsbuffer (50 mM Tris, pH 8,0; 1 % NP-40; 0,25 % natriumdeoksykolat; 150 mM NaCl; 1 mM EDTA; 1× proteasehemmercocktail (Roche)) tilsatt separat. Prøvene ble homogenisert umiddelbart etter disseksjon med en perlekule (2 mm glasskuler, 2400 rpm, 90 sek). Uløselig avfall ble fjernet ved sentrifugering ved 20 000 g ved 4 °C. Proteiner ble kvantifisert ved Bradford-analyse (Bio-Rad). Deretter ble 20 µg MAG-protein, 40 µg LRT-protein og 20 µg gjenværende bulkprotein denaturert og separert ved 10 % Bis-Tris NuPAGE ved bruk av MOPS-buffer. Proteiner ble overført til polyvinylidenfluoridmembraner ved bruk av iBlot2-overføringssystemet (Thermo Fisher). Membranene ble vasket to ganger i 1 × PBS-T (0,1 % Tween-20 i PBS) og deretter blokkert i Odyssey-blokkeringsbuffer (Li-Cor) i 1 time ved 22 °C. Membranene ble ristet over natten ved 4 °C med tilpasset polyklonalt primært antistoff fra kanin anti-EPP (1:700 i blokkeringsbuffer) og monoklonalt primært antistoff fra rotte anti-aktin MAC237 (Abeam; 1:4000). Membranene ble vasket med PBS-T og deretter inkubert med sekundære antistoffer (esel anti-kanin 800CW og geit anti-rotte 680LT (Li-Cor), begge 1:20 000) i blokkeringsbuffer som inneholdt 0,01 % SDS og 0,2 % Tween-20 i 1 time ved 22 ... °C. Membranene ble vasket med PBS-T og avbildet med en Odyssey CLx-skanner. Bildene ble samlet inn og behandlet i Image Studio (versjon 5.2). Et spesifikt bånd som korresponderer med EPP-RA-isoformen (82 kDa) ble ikke detektert.
De kodende regionene til EPP (som isoformen AGAP002463-RB som inneholder histidinfosfatasedomene, NCBI conserved domain search 34) og EcK2 (AGAP002181) ble klonet inn i pET-21a(+) plasmid (Novagen Millipore Sigma); Primere er listet opp i utvidet datatabell 2. Åtte GS4-linkere (i tandem) ble satt inn før den C-terminale 6xHis-taggen til pET-21a(+)-EcK2-konstruksjonen. Rekombinante proteiner ble produsert ved bruk av NEBExpress cellefri E. coli proteinsyntesereaksjon (New England BioLabs). Rekombinante proteiner ble renset ved bruk av NEBExpress Ni-spinnkolonner (New England BioLabs). Dihydrofolatreduktase (DHFR) kontrollprotein ble produsert ved bruk av DNA-mal fra NEBExpress Cell-Free E. coli Protein Synthesis Kit. Proteiner ble lagret i 50 % glyserol i PBS ved -20 °C i opptil 3 måneder.
Fosfataseaktiviteten til EPP og vevsekstrakter ble målt ved bruk av 4-nitrofenylfosfat (pNPP; Sigma-Aldrich). Reaksjonsbufferen inneholdt 25 mM Tris, 50 mM eddiksyre, 25 mM Bis-Tris, 150 mM NaCl, 0,1 mM EDTA og 1 mM DTT. Vevet ble homogenisert i reaksjonsbufferen, og celleavfall ble fjernet ved sentrifugering. Start reaksjonen ved å tilsette enzym eller vevsekstrakt til reaksjonsbufferen som inneholdt 2,5 mg ml-1 pNPP. Reaksjonsblandingen ble inkubert ved romtemperatur i mørket, og mengden pNP omdannet fra pNPP ble kvantifisert ved å måle absorbansen ved 405 nm på forskjellige tidspunkter.
For in vitro EcK-aktivitet ble proteinet inkubert med 0,2 mg 20E eller 3D20E i 200 µl buffer (pH 7,5) som inneholdt 10 mM HEPES–NaOH, 0,1 % BSA, 2 mM ATP og 10 mM MgCl2 i 2 timer ved 27 °C. Reaksjonen ble stoppet ved å tilsette 800 µl metanol, deretter avkjølt ved -20 °C i 1 time og deretter sentrifugert ved 20 000 g i 10 minutter ved 4 °C. Supernatanten ble deretter analysert ved HPLC-MS/MS. For å varmeinaktivere proteinene som ble brukt i kontrollgruppen, ble proteinene inkubert i 50 % glyserol i PBS i 20 minutter ved 95 °C.
For in vitro EPP-aktivitet ble proteinet inkubert med 3D20E22P (tilsvarende mengden funnet i 18 par MAG, renset ved HPLC-MS/MS) i 100 µl buffer (pH 7,5) inneholdende 25 mM Tris, 50 mM eddiksyre, 25 mM Bis-Tris, 150 mM NaCl, 0,1 mM EDTA og 1 mM DTT i 3 timer ved 27 °C. Reaksjonen ble stoppet ved å tilsette 400 µl metanol og avkjølt ved -20 °C i 1 time, deretter sentrifugert ved 20 000 g i 10 minutter ved 4 °C. Supernatanten ble analysert ved HPLC-MS/MS.
PCR-fragmenter for EPP (362 bp), EcK1 (AGAP004574, 365 bp) og EcK2 (556 bp) ble amplifisert fra cDNA fremstilt fra hodeløse myggkadavere av blandet kjønn. PCR-fragmentet av eGFP-kontrollen (495 bp) ble amplifisert fra den tidligere beskrevne pCR2.1-eGFP; PCR-primere er listet opp i utvidet datatabell 2. PCR-fragmentet ble satt inn mellom de inverterte T7-promotorene på pL4440-plasmidet. Plasmidkonstruksjoner ble gjenvunnet fra NEB 5-α-kompetent E. coli (New England Biolabs) og verifisert ved DNA-sekvensering før bruk (se tilleggsdata 1 for innsettingssekvens). Primere matchet med T7-promotoren (utvidet datatabell 2) ble brukt til å amplifisere innsettingen fra det pL4440-baserte plasmidet. PCR-produktstørrelsen ble bekreftet ved agarosegelelektroforese. dsRNA ble transkribert fra PCR-maler ved bruk av Megascript T7-transkriptionssettet (Thermo Fisher) og renset i henhold til produsentens instruksjoner med modifikasjonene som tidligere er beskrevet.
For dsRNA-injeksjon ble 1380 ng dsRNA (dsGFP, dsEcK1, dsEcK2, dsEPP) injisert i en konsentrasjon på 10 ng nl-1 i thorax hos voksne hanner eller hunner (Nanoject III, Drummond) innen 1 dag etter eklosjon. Gen-knockdown-nivåer ble bestemt i minst tre biologiske replikater ved RNA-ekstraksjon, cDNA-syntese og RT-qPCR. For ecdysone-injeksjon ble 4 dager gamle jomfruelige eller 6 dager gamle jomfruelige blodforede hunner injisert med 0,13, 0,21 eller 0,63 µg 20E eller 3D20E (Nanoject III, Drummond) i konsentrasjoner på henholdsvis 1,3, 2,1, avhengig av forsøksdesignet eller 6,3 ng nl-1. Injiser 100 nl 10 % (vol/vol) etanol i vann; 100 nl 3D20E22P i 10 % etanol (tilsvarende 75 % av mengden funnet i et par MAG-er). Mygg ble tilfeldig tildelt injeksjonsgruppen.
For gyteanalyser ble 3 dager gamle hunner fôret ad libitum med menneskeblod. Fjern delvis matede eller ikke-matede mygg. Avhengig av behandlingen ble hunnene plassert i separate gytekopper i fire netter minst 48 timer etter blodmåltidet. Egg ble telt under et stereoskop (Stemi 508, Zeiss); for parede hunner ble egg som klekket til larver ansett som befruktede.
For paringsforsøk fikk hunnene minst 2 dager, avhengig av behandlingen, til å utvikle resistens mot paring, og aldersmatchede villtype-hanner ble deretter introdusert i samme bur. To netter senere ble de befruktede hunnvesiklene dissekert, og genomisk DNA ble frigjort ved frysing-tining og sonikering i en buffer som inneholdt 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA og 25 mM NaCl (pH 8,2). Prøvene ble inkubert med Proteinase K (0,86 µg µl-1) i 15 minutter ved 55 °C, etterfulgt av 10 minutter ved 95 °C. Rå genomisk DNA-preparater ble fortynnet 10 ganger og utsatt for qPCR-deteksjon av Y-kromosomsekvenser; primere er listet opp i utvidet datatabell 2. Fravær av Y-kromosomsekvens indikerer ingen paring.
For re-paringsanalyser ble tvangsparede hunner undersøkt for tilstedeværelse av paringsplugger for å bekrefte paringsstatus og fikk 2 dager til å utvikle refraktæritet mot paring i fravær av hanner, som tidligere beskrevet36. Hanner som bar DsRed transgen sæd ble deretter introdusert i hunnbur. To netter senere ble de befruktende vesiklene dissekert fra hunnene, og genomisk DNA ble fremstilt som beskrevet ovenfor og utsatt for qPCR-deteksjon av DsRed-transgenet; primere er listet opp i utvidet datatabell 2. Fraværet av DsRed-transgenet indikerte at ingen re-paring forekom.
3D20E ble syntetisert som tidligere beskrevet 37. Kort fortalt ble 10 mg av 20E (Sigma-Aldrich) løst opp i 10 ml vann, etterfulgt av tilsetning av 30 mg platinasvart (i pulverform, Sigma-Aldrich). En svak strøm av O2 ble kontinuerlig boblet inn i reaksjonsblandingen, som ble omrørt ved romtemperatur. Etter 6 timer ble 30 ml metanol tilsatt for å stoppe reaksjonen. Blandingen ble sentrifugert for å fjerne katalysatorpartikler. Supernatanten ble inndampet til tørrhet i vakuum ved romtemperatur. Det tørkede reaksjonsproduktet ble løst opp i 10 % etanol og metanol for injeksjon for HPLC-MS/MS-analyse. Konverteringsraten (fra 20E til 3D20E) var omtrent 97 % (fig. 4b), og MS-spekteret til den syntetiserte 3D20E samsvarte med det som ble funnet hos parede hunner (fig. 4c).
Forklaringen inneholder spesifikke detaljer om de statistiske testene som ble utført. GraphPad (versjon 9.0) ble brukt til å utføre Fishers eksakte test, Mantel-Cox-test og Students t-test. Cochran-Mantel-Haenszel-tester ble utført ved hjelp av et tilpasset R-skript (tilgjengelig på https://github.com/duopeng/mantelhaen.test). Datafordelingen ble testet for normalitet ved hjelp av Shapiro-Wilk-testen med en signifikansgrense på 0,05. Når dataene ikke besto normalitetstesten, ble Mann-Whitney-testen utført. Overlevelsesdata ble analysert ved hjelp av Mantel-Cox-testen. DESeq2-pakken (versjon 1.28.1) ble brukt til å utføre RNA-seq-gennivådifferensialekspresjonsanalyse. Den horisontale linjen på grafen representerer medianen. En signifikansverdi på P = 0,05 ble brukt som terskel for alle tester.
For mer informasjon om studiedesignet, se sammendraget fra Nature Research Report som er lenket til denne artikkelen.
MS-proteomikkdata ble deponert i ProteomeXchange Consortium (http://proteomecentral.proteomexchange.org) gjennom PRIDE Partner Repository (https://www.ebi.ac.uk/pride/) med datasettidentifikatoren PXD032157.
RNA-sekvenseringsdatasettet er deponert i Gene Expression Comprehensive Library (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/) under serienummeret GSE198665.
Ytterligere datasett generert og/eller analysert i løpet av den nåværende studien kan innhentes fra de korresponderende forfatterne på rimelig forespørsel. Denne artikkelen inneholder kildedataene.
De Loof, A. Ekdysteroider: Neglisjerte insektkjønnssteroider? Mann: Black Box. Insect Science. 13, 325–338 (2006).
Redfern, CPF 20-hydroksyecdyson og eggstokkutvikling hos Anopheles stephens. J. Insect Physiology. 28, 97–109 (1982).