Propionsyre (PPA), et soppdrepende middel og vanlig kosttilskudd, har vist seg å forårsake unormal nevroutvikling hos mus ledsaget av gastrointestinal dysfunksjon, som kan være forårsaket av tarmdysbiose. En sammenheng mellom PPA-eksponering i kosten og dysbiose i tarmmikrobiota har blitt foreslått, men har ikke blitt direkte undersøkt. Her undersøkte vi PPA-assosierte endringer i tarmmikrobiotaens sammensetning som kan føre til dysbiose. Tarmmikrobiomer hos mus fôret med et ubehandlet kosthold (n = 9) og et PPA-beriket kosthold (n = 13) ble sekvensert ved hjelp av langsiktig metagenomisk sekvensering for å vurdere forskjeller i mikrobiell sammensetning og bakterielle metabolske veier. PPA i kosten var assosiert med en økning i forekomsten av betydelige taxa, inkludert flere Bacteroides-, Prevotella- og Ruminococcus-arter, hvorav medlemmer tidligere har vært implisert i PPA-produksjon. Mikrobiomene til PPA-eksponerte mus hadde også flere veier relatert til lipidmetabolisme og steroidhormonbiosyntese. Våre resultater indikerer at PPA kan endre tarmmikrobiotaen og dens tilhørende metabolske veier. Disse observerte endringene fremhever at konserveringsmidler som er klassifisert som trygge for konsum, kan påvirke sammensetningen av tarmmikrobiotaen og dermed menneskers helse.
Det menneskelige mikrobiomet blir ofte omtalt som «kroppens siste organ» og spiller en viktig rolle i menneskers helse (Baquero og Nombela, 2012). Spesielt tarmmikrobiomet er anerkjent for sin systemomfattende innflytelse og rolle i mange viktige funksjoner. Kommensale bakterier er rikelig til stede i tarmen, og okkuperer flere økologiske nisjer, utnytter næringsstoffer og konkurrerer med potensielle patogener (Jandhyala et al., 2015). Ulike bakterielle komponenter i tarmmikrobiotaen er i stand til å produsere essensielle næringsstoffer som vitaminer og fremme fordøyelsen (Rowland et al., 2018). Bakteriemetabolitter har også vist seg å påvirke vevsutvikling og forbedre metabolske og immunologiske veier (Heijtz et al., 2011; Yu et al., 2022). Sammensetningen av det menneskelige tarmmikrobiomet er ekstremt mangfoldig og avhenger av genetiske og miljømessige faktorer som kosthold, kjønn, medisiner og helsetilstand (Kumbhare et al., 2019).
Mors kosthold er en kritisk komponent i foster- og nyfødtutvikling og en antatt kilde til forbindelser som kan påvirke utviklingen (Bazer et al., 2004; Innis, 2014). En slik forbindelse av interesse er propionsyre (PPA), et biprodukt av kortkjedede fettsyrer oppnådd fra bakteriell fermentering og et mattilsetningsstoff (den Besten et al., 2013). PPA har antibakterielle og soppdrepende egenskaper og brukes derfor som konserveringsmiddel i mat og i industrielle applikasjoner for å hemme mugg- og bakterievekst (Wemmenhove et al., 2016). PPA har forskjellige effekter i forskjellige vev. I leveren har PPA antiinflammatoriske effekter ved å påvirke cytokinuttrykk i makrofager (Kawasoe et al., 2022). Denne regulerende effekten har også blitt observert i andre immunceller, noe som fører til nedregulering av betennelse (Haase et al., 2021). Imidlertid har den motsatte effekten blitt observert i hjernen. Tidligere studier har vist at PPA-eksponering induserer autismelignende atferd hos mus (El-Ansary et al., 2012). Andre studier har vist at PPA kan indusere gliose og aktivere proinflammatoriske veier i hjernen (Abdelli et al., 2019). Fordi PPA er en svak syre, kan den diffundere gjennom tarmepitelet inn i blodet og dermed krysse restriktive barrierer, inkludert blod-hjerne-barrieren samt morkaken (Stinson et al., 2019), noe som fremhever viktigheten av PPA som en regulatorisk metabolitt produsert av bakterier. Selv om den potensielle rollen til PPA som en risikofaktor for autisme for tiden er under etterforskning, kan effektene på individer med autisme strekke seg utover å indusere nevral differensiering.
Gastrointestinale symptomer som diaré og forstoppelse er vanlige hos pasienter med nevroutviklingsforstyrrelser (Cao et al., 2021). Tidligere studier har vist at mikrobiomet hos pasienter med autismespekterforstyrrelser (ASD) er forskjellig fra friske individer, noe som tyder på tilstedeværelsen av dysbiose i tarmmikrobiota (Finegold et al., 2010). Tilsvarende er mikrobiomets egenskaper hos pasienter med inflammatoriske tarmsykdommer, fedme, Alzheimers sykdom osv. også forskjellige fra friske individer (Turnbaugh et al., 2009; Vogt et al., 2017; Henke et al., 2019). Imidlertid er det til dags dato ikke fastslått noen årsakssammenheng mellom tarmmikrobiomet og nevrologiske sykdommer eller symptomer (Yap et al., 2021), selv om flere bakteriearter antas å spille en rolle i noen av disse sykdomstilstandene. For eksempel er Akkermansia, Bacteroides, Clostridium, Lactobacillus, Desulfovibrio og andre slekter mer rikelig i mikrobiotaen til pasienter med autisme (Tomova et al., 2015; Golubeva et al., 2017; Cristiano et al., 2018; Zurita et al., 2020). Det er verdt å merke seg at medlemsarter av noen av disse slektene er kjent for å ha gener assosiert med PPA-produksjon (Reichardt et al., 2014; Yun og Lee, 2016; Zhang et al., 2019; Baur og Dürre, 2023). Gitt de antimikrobielle egenskapene til PPA, kan det å øke forekomsten være gunstig for veksten av PPA-produserende bakterier (Jacobson et al., 2018). Dermed kan et PFA-rikt miljø føre til endringer i tarmmikrobiotaen, inkludert gastrointestinale patogener, som kan være potensielle faktorer som fører til gastrointestinale symptomer.
Et sentralt spørsmål i mikrobiomforskning er om forskjeller i mikrobiell sammensetning er en årsak til eller et symptom på underliggende sykdommer. Det første skrittet mot å belyse det komplekse forholdet mellom kosthold, tarmmikrobiomet og nevrologiske sykdommer er å vurdere effekten av kosthold på mikrobiell sammensetning. For dette formålet brukte vi long-read metagenomisk sekvensering for å sammenligne tarmmikrobiomene til avkom av mus fôret med et PPA-rikt eller PPA-utarmet kosthold. Avkommet fikk samme kosthold som mødrene sine. Vi antok at et PPA-rikt kosthold ville resultere i endringer i tarmens mikrobielle sammensetning og mikrobielle funksjonelle veier, spesielt de som er relatert til PPA-metabolisme og/eller PPA-produksjon.
Denne studien brukte FVB/N-Tg(GFAP-GFP)14Mes/J transgene mus (Jackson Laboratories) som overuttrykker grønt fluorescerende protein (GFP) under kontroll av den glia-spesifikke GFAP-promotoren i henhold til retningslinjene fra University of Central Florida Institutional Animal Care and Use Committee (UCF-IACUC) (Animal Use Permit Number: PROTO202000002). Etter avvenning ble musene plassert individuelt i bur med 1–5 mus av hvert kjønn per bur. Musene ble fôret ad libitum med enten et renset kontrolldiett (modifisert åpen standarddiett, 16 kcal % fett) eller et natriumpropionat-supplert diett (modifisert åpen standarddiett, 16 kcal % fett, inneholdende 5000 ppm natriumpropionat). Mengden natriumpropionat som ble brukt tilsvarte 5000 mg PFA/kg total fôrvekt. Dette er den høyeste konsentrasjonen av PPA som er godkjent for bruk som konserveringsmiddel i matvarer. For å forberede seg til denne studien ble foreldremusene fôret med begge diettene i 4 uker før paring, og dette fortsatte gjennom hele dammusens drektighet. Avkommus [22 mus, 9 kontrollmus (6 hanner, 3 hunner) og 13 PPA (4 hanner, 9 hunner)] ble avvent og deretter fortsatt på samme diett som dammusene i 5 måneder. Avkommusene ble avlivet ved 5 måneders alder, og tarmavføringsinnholdet ble samlet og først lagret i 1,5 ml mikrosentrifugerør ved -20 °C og deretter overført til en -80 °C fryser inntil verts-DNA var tømt og mikrobielle nukleinsyrer ble ekstrahert.
Verts-DNA ble fjernet i henhold til en modifisert protokoll (Charalampous et al., 2019). Kort fortalt ble avføringsinnholdet overført til 500 µl InhibitEX (Qiagen, Cat#/ID: 19593) og lagret frossent. Behandle maksimalt 1–2 avføringspellets per ekstraksjon. Avføringsinnholdet ble deretter mekanisk homogenisert ved hjelp av en plastpistel inne i røret for å danne en oppslemming. Sentrifuger prøvene ved 10 000 RCF i 5 minutter, eller til prøvene har pelletert seg, aspirer deretter supernatanten og resuspender pelleten i 250 µl 1× PBS. Tilsett 250 µl 4,4 % saponinløsning (TCI, produktnummer S0019) til prøven som et vaskemiddel for å løsne eukaryote cellemembraner. Prøvene ble blandet forsiktig til de var glatte, og inkubert ved romtemperatur i 10 minutter. For å ødelegge eukaryote celler ble deretter 350 μl nukleasefritt vann tilsatt prøven, inkubert i 30 sekunder, og deretter ble 12 μl 5 M NaCl tilsatt. Prøvene ble deretter sentrifugert ved 6000 RCF i 5 minutter. Aspirer supernatanten og resuspender pelleten i 100 μl 1X PBS. For å fjerne verts-DNA, tilsett 100 μl HL-SAN-buffer (12,8568 g NaCl, 4 ml 1M MgCl2, 36 ml nukleasefritt vann) og 10 μl HL-SAN-enzym (ArticZymes P/N 70910-202). Prøvene ble grundig blandet ved pipettering og inkubert ved 37 °C i 30 minutter ved 800 rpm på en Eppendorf™ ThermoMixer C. Etter inkubasjon ble de sentrifugert ved 6000 RCF i 3 minutter og vasket to ganger med 800 µl og 1000 µl 1X PBS. Til slutt ble pelleten resuspendert i 100 µl 1X PBS.
Totalt bakteriellt DNA ble isolert ved bruk av New England Biolabs Monarch Genomic DNA Purification Kit (New England Biolabs, Ipswich, MA, katalognummer T3010L). Standard driftsprosedyren som følger med settet er noe modifisert. Inkuber og hold nukleasefritt vann ved 60 °C før operasjon for endelig eluering. Tilsett 10 µl proteinase K og 3 µl RNase A til hver prøve. Tilsett deretter 100 µl cellelysebuffer og bland forsiktig. Prøvene ble deretter inkubert i en Eppendorf™ ThermoMixer C ved 56 °C og 1400 o/min i minst 1 time og opptil 3 timer. Inkuberte prøver ble sentrifugert ved 12 000 RCF i 3 minutter, og supernatanten fra hver prøve ble overført til et separat 1,5 ml mikrosentrifugerør som inneholdt 400 µl bindingsløsning. Rørene ble deretter pulsvirvlet i 5–10 sekunder med intervaller på 1 sekund. Overfør hele væskeinnholdet i hver prøve (omtrent 600–700 µL) til en filterpatron plassert i et gjennomstrømningsrør. Rørene ble sentrifugert ved 1000 RCF i 3 minutter for å tillate initial DNA-binding og deretter sentrifugert ved 12 000 RCF i 1 minutt for å fjerne gjenværende væske. Prøvekolonnen ble overført til et nytt oppsamlingsrør og deretter vasket to ganger. For den første vasken, tilsett 500 µL vaskebuffer til hvert rør. Snu røret 3–5 ganger og sentrifuger deretter ved 12 000 RCF i 1 minutt. Kast væsken fra oppsamlingsrøret og plasser filterpatronen tilbake i det samme oppsamlingsrøret. For den andre vasken, tilsett 500 µL vaskebuffer til filteret uten å snu det. Prøvene ble sentrifugert ved 12 000 RCF i 1 minutt. Overfør filteret til et 1,5 ml LoBind®-rør og tilsett 100 µL forvarmet nukleasefritt vann. Filtrene ble inkubert ved romtemperatur i 1 minutt og deretter sentrifugert ved 12 000 RCF i 1 minutt. Elutert DNA ble lagret ved -80 °C.
DNA-konsentrasjonen ble kvantifisert ved hjelp av et Qubit™ 4.0 fluorometer. DNA ble fremstilt ved hjelp av Qubit™ 1X dsDNA High Sensitivity Kit (katalognr. Q33231) i henhold til produsentens instruksjoner. Lengdefordelingen av DNA-fragmenter ble målt ved hjelp av en Aglient™ 4150 eller 4200 TapeStation. DNA ble fremstilt ved hjelp av Agilent™ Genomic DNA Reagents (katalognr. 5067-5366) og Genomic DNA ScreenTape (katalognr. 5067-5365). Bibliotekforberedelse ble utført ved hjelp av Oxford Nanopore Technologies™ (ONT) Rapid PCR Barcoding Kit (SQK-RPB004) i henhold til produsentens instruksjoner. DNA ble sekvensert ved hjelp av en ONT GridION™ Mk1-sekvenserer med en Min106D-strømningscelle (R 9.4.1). Sekvenseringsinnstillingene var: baseberegning med høy nøyaktighet, minimum q-verdi på 9, strekkodeoppsett og strekkodetrim. Prøvene ble sekvensert i 72 timer, hvoretter basiskalldata ble sendt inn for videre behandling og analyse.
Bioinformatisk prosessering ble utført ved hjelp av tidligere beskrevne metoder (Greenman et al., 2024). FASTQ-filene som ble innhentet fra sekvensering ble delt inn i mapper for hver prøve. Før bioinformatisk analyse ble dataene behandlet ved hjelp av følgende prosess: først ble FASTQ-filene fra prøvene slått sammen til én enkelt FASTQ-fil. Deretter ble avlesninger kortere enn 1000 bp filtrert ved hjelp av Filtlong v. 0.2.1, hvor den eneste endrede parameteren var –min_length 1000 (Wick, 2024). Før videre filtrering ble avlesningskvaliteten kontrollert ved hjelp av NanoPlot v. 1.41.3 med følgende parametere: –fastq –plots dot –N50 -o(De Coster og Rademakers, 2023). Avlesningene ble justert til muse-referansegenomet GRCm39 (GCF_000001635.27) ved bruk av minimap2 v. 2.24-r1122 for å fjerne vertsforurensede avlesninger med følgende parametere: -L -ax map-ont(Lee, 2018). De genererte justeringsfilene ble konvertert til BAM-format ved hjelp av samtools view -b (Danecek et al., 2021) i samtools v. 1.16.1. Ujusterte avlesninger ble deretter identifisert ved hjelp av samtools view -b -f 4, noe som indikerer at disse avlesningene ikke tilhørte vertsgenomet. Ujusterte avlesninger ble konvertert tilbake til FASTQ-format ved hjelp av samtools bam2fq med standardparametere. NanoPlot ble kjørt på nytt på de ytterligere filtrerte avlesningene ved hjelp av innstillingene beskrevet tidligere. Etter filtrering ble metagenomiske data samlet ved hjelp av metaflye v. 2.8.2-b1689 med følgende parametere: –nano-raw–meta (Kolmogorov et al., 2020). La de resterende parameterne stå på standardverdiene. Etter montering ble filtrerte avlesninger kartlagt til monteringen ved hjelp av minimap2, og parameteren -ax map-ont ble brukt til å generere en justeringsfil i SAM-format. Monteringen ble først forbedret ved hjelp av racon v. 1.4.20 med følgende parametere: -m 8 -x -6 -g -8 -w 500 -u (Vaser et al., 2017). Etter at racon var fullført, ble den ytterligere forbedret med medaka v. 1.7.2, ved hjelp av medaka_consesus, med alle parametere unntatt -m-parameteren beholdt standardverdiene. Parameteren -m er satt til r941_min_hac_g507 for å spesifisere flytcellekjemien og det høynøyaktige basekallet som brukes for dataene våre (nanoporetech/medaka, 2024). De filtrerte dataene (heretter referert til som mikrobielle data) og den endelige rensede monteringen ble brukt til påfølgende analyse.
For taksonomisk klassifisering ble lesninger og sammensatte contigs klassifisert ved hjelp av Kraken2 v. 2.1.2 (Wood et al., 2019). Generer rapporter og utdatafiler for henholdsvis lesninger og sammenstillinger. Bruk alternativet –use-names for å analysere lesninger og sammenstillinger. Alternativene –gzip-compressed og –paired er spesifisert for lesesegmenter. Relativ forekomst av taxa i metagenomer ble estimert ved hjelp av Bracken v. 2.8 (Lu et al., 2017). Vi opprettet først en kmer-database som inneholder 1000 baser ved hjelp av bracken-build med følgende parametere: -d-k 35 -l 1000 Når den er bygget, kjører bracken basert på rapporten generert av kraken2 og filtrerer dataene ved hjelp av følgende alternativer: -d -I -O-p 1000 -l

Blant disse velges P, G eller S avhengig av klassifiseringsnivået som analyseres. For å minimere virkningen av falske positive klassifiseringer ble det brukt en minimumsterskel for relativ forekomst på 1e-4 (1/10 000 avlesninger). Før statistisk analyse ble de relative forekomstene rapportert av Bracken (fraction_total_reads) transformert ved hjelp av centered log-ratio (CLR)-transformasjonen (Aitchison, 1982). CLR-metoden ble valgt for datatransformasjon fordi den er skalainvariant og tilstrekkelig for ikke-sparsomme datasett (Gloor et al., 2017). CLR-transformasjonen bruker den naturlige logaritmen. Telledataene rapportert av Bracken ble normalisert ved hjelp av relativ log-uttrykk (RLE) (Anders og Huber, 2010). Figurer ble generert ved hjelp av en kombinasjon av matplotlib v. 3.7.1, seaborn v. 3.7.2 og sekvensielle logaritmer (Gloor et al., 2017). 0.12.2 og stantanotasjoner v. 0.5.0 (Hunter, 2007; Waskom, 2021; Charlier et al., 2022). Bacillus/Bacteroidetes-forholdet ble beregnet for hver prøve ved hjelp av normaliserte bakterietall. Verdiene rapportert i tabellene er avrundet til 4 desimaler. Simpson-diversitetsindeksen ble beregnet ved hjelp av alpha_diversity.py-skriptet som finnes i KrakenTools v. 1.2-pakken (Lu et al., 2022). Bracken-rapporten er gitt i skriptet, og Simpson-indeksen «Si» er gitt for -an-parameteren. Signifikante forskjeller i forekomst ble definert som gjennomsnittlige CLR-forskjeller ≥ 1 eller ≤ -1. En gjennomsnittlig CLR-forskjell på ±1 indikerer en 2,7-ganger økning i forekomsten av en prøvetype. Tegnet (+/-) indikerer om taksonet er mer rikelig i henholdsvis PPA-prøven og kontrollprøven. Signifikans ble bestemt ved hjelp av Mann-Whitney U-testen (Virtanen et al., 2020). Statsmodels v. 0.14 (Benjamini og Hochberg, 1995; Seabold og Perktold, 2010) ble brukt, og Benjamini-Hochberg-prosedyren ble anvendt for å korrigere for multippel testing. En justert p-verdi ≤ 0,05 ble brukt som terskelverdi for å bestemme statistisk signifikans.
Genannotering og relativ forekomstestimering ble utført ved hjelp av en modifisert versjon av protokollen beskrevet av Maranga et al. (Maranga et al., 2023). Først ble contigs kortere enn 500 bp fjernet fra alle sammenstillinger ved hjelp av SeqKit v. 2.5.1 (Shen et al., 2016). De utvalgte sammenstillingene ble deretter kombinert til et pan-metagenom. Åpne leserammer (ORF-er) ble identifisert ved hjelp av Prodigal v. 1.0.1 (en parallellversjon av Prodigal v. 2.6.3) med følgende parametere: -d-f gff-i -O-T 24 -p meta -C 10000 (Hyett et al., 2012; Jaenicke, 2024). De resulterende nukleotidfilene ble deretter filtrert ved hjelp av Python for å fjerne alle ufullstendige gener. CD-HIT v. 4.8.1 ble deretter brukt til å gruppere genene med følgende parametere: cd-hit-est -i -O-c 0,95 -s 0,85 -aS 0,9 -n 10 -d 256 -M 350000 -T 24 -l 100 -g 1 (Fu et al., 2012). Den genererte ikke-redundante genkatalogen ble brukt til å estimere genforekomst og annotering. Relativ genforekomst ble estimert ved hjelp av KMA v. 1.4.9 (Clausen et al., 2018). Først opprettes en indeksfil ved hjelp av KMA-indeksen med følgende parametere: -i -ODeretter ble KMA kjørt med følgende parametere ved å bruke indeksen generert sammen med de mikrobielle avlesningene for hver prøve som beskrevet i avsnittet om bioinformatikkrørledningen: -i -O-t_db-bcNano -bc 0.7 -ef -t 24. Deretter ble gentellingene normalisert ved hjelp av CLR, og hovedkomponentanalyse (PCA)-klassen fra Sci-kit learn ble brukt (Pedregosa et al., 2011). Den predikerte genannotasjonen ble utført på den ikke-redundante genkatalogen ved hjelp av emapper.py-skriptet fra eggNOG v. 2.1.12 og eggNOG-databasen versjon 5.0.2 med følgende parametere: –itype CDS –cpu 24 -i– Datakatalog–go_evidence Ikke-elektronisk – utdata– Utdatakatalog–mål_ortologer alle –seed_ortholog_evalue 0,001 –seed_ortholog_score 60 –spørreomslag 20 –subjektomslag 0 –oversett –overskriv –temp_dir(Cantalapiedra et al., 2021). KMA-resultatene ble screenet for å velge gener med tilstrekkelig maldekning og malidentitet (≥ 90 %) og forekomst (dybde ≥ 3). KMA-dybderesultatene ble transformert ved hjelp av CLR som beskrevet ovenfor. KMA-resultatene ble deretter sammenlignet med contig-ID-ene fra de funksjonelle annotasjons- og klassifiseringsresultatene ved hjelp av contig-kilden for hvert gen. Som med taxa ble signifikante forskjeller i genforekomst definert som gener med en gjennomsnittlig CLR-forskjell ≥ 1 eller ≤ -1, med et fortegn (+/-) som indikerer at genet var mer rikelig i henholdsvis PPA- eller kontrollprøvene.
Gener ble først gruppert i henhold til Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) ortolog (KO) identifikatorer tildelt av eggNOG for å sammenligne genbaneforekomster. Gener uten knockouts eller gener med flere knockouts ble fjernet før analyse. Den gjennomsnittlige forekomsten av hver KO per prøve ble deretter beregnet og statistisk analyse ble utført. PPA-metabolismegener ble definert som ethvert gen som ble tildelt en rad ko00640 i KEGG_Pathway-kolonnen, noe som indikerer en rolle i propionatmetabolisme i henhold til KEGG. Gener identifisert som assosiert med PPA-produksjon er listet opp i tilleggstabell 1 (Reichardt et al., 2014; Yang et al., 2017). Permutasjonstester ble utført for å identifisere PPA-metabolisme- og produksjonsgener som var betydelig mer rikelig i hver prøvetype. Ett tusen permutasjoner ble utført for hvert analyserte gen. En p-verdi på 0,05 ble brukt som en grense for å bestemme statistisk signifikans. Funksjonelle annoteringer ble tildelt individuelle gener innenfor en klynge basert på annoteringene til representative gener innenfor klyngen. Taxa assosiert med PPA-metabolisme og/eller PPA-produksjon kunne identifiseres ved å matche contig-ID-er i Kraken2-utdatafilene med de samme contig-ID-ene som ble beholdt under funksjonell annotering ved bruk av eggNOG. Signifikanstesting ble utført ved bruk av Mann-Whitney U-testen beskrevet tidligere. Korreksjon for multippel testing ble utført ved bruk av Benjamini-Hochberg-prosedyren. En p-verdi på ≤ 0,05 ble brukt som en grense for å bestemme statistisk signifikans.
Mangfoldet i tarmmikrobiomet hos mus ble vurdert ved hjelp av Simpsons mangfoldsindeks. Ingen signifikante forskjeller ble observert mellom kontroll- og PPA-prøvene når det gjelder slekts- og artsmangfold (p-verdi for slekt: 0,18, p-verdi for art: 0,16) (figur 1). Mikrobiell sammensetning ble deretter sammenlignet ved hjelp av prinsipal komponentanalyse (PCA). Figur 2 viser grupperingen av prøver etter deres fyla, noe som indikerer at det var forskjeller i artssammensetningen av mikrobiomene mellom PPA- og kontrollprøvene. Denne grupperingen var mindre uttalt på slektsnivå, noe som tyder på at PPA påvirker visse bakterier (tilleggsfigur 1).
Figur 1. Alfa-mangfold av slekter og artssammensetning i musens tarmmikrobiom. Boksplott som viser Simpson-mangfoldsindekser for slekter (A) og arter (B) i PPA- og kontrollprøver. Signifikans ble bestemt ved hjelp av Mann-Whitney U-testen, og multippel korreksjon ble utført ved hjelp av Benjamini-Hochberg-prosedyren. ns, p-verdien var ikke signifikant (p>0,05).
Figur 2. Resultater av hovedkomponentanalyse av musens tarmmikrobiomsammensetning på artsnivå. Hovedkomponentanalyseplottet viser fordelingen av prøvene på tvers av de to første hovedkomponentene. Farger indikerer prøvetype: PPA-eksponerte mus er lilla og kontrollmus er gule. Hovedkomponent 1 og 2 er plottet på henholdsvis x-aksen og y-aksen, og uttrykkes som deres forklarte variansforhold.
Ved bruk av RLE-transformerte telledata ble det observert en signifikant reduksjon i median Bacteroidetes/Bacilli-forhold hos kontroll- og PPA-mus (kontroll: 9,66, PPA: 3,02; p-verdi = 0,0011). Denne forskjellen skyldtes høyere forekomst av Bacteroidetes hos PPA-mus sammenlignet med kontrollmus, selv om forskjellen ikke var signifikant (gjennomsnittlig kontroll-CLR: 5,51, gjennomsnittlig PPA-CLR: 6,62; p-verdi = 0,054), mens forekomsten av Bacteroidetes var lik (gjennomsnittlig kontroll-CLR: 7,76, gjennomsnittlig PPA-CLR: 7,60; p-verdi = 0,18).
Analyse av forekomsten av taksonomiske medlemmer av tarmmikrobiomet viste at 1 rekke og 77 arter skilte seg signifikant mellom PPA- og kontrollprøvene (tilleggstabell 2). Forekomsten av 59 arter i PPA-prøvene var betydelig høyere enn i kontrollprøvene, mens forekomsten av bare 16 arter i kontrollprøvene var høyere enn i PPA-prøvene (figur 3).
Figur 3. Differensiell forekomst av taxa i tarmmikrobiomet hos PPA- og kontrollmus. Vulkanplott viser forskjeller i forekomsten av slekter (A) eller arter (B) mellom PPA- og kontrollprøver. Grå prikker indikerer ingen signifikant forskjell i taxaforekomst. Fargede prikker indikerer signifikante forskjeller i forekomst (p-verdi ≤ 0,05). De 20 største taxaene med de største forskjellene i forekomst mellom prøvetyper er vist i henholdsvis rødt og lyseblått (kontroll- og PPA-prøver). Gule og lilla prikker var minst 2,7 ganger mer forekomstfulle i kontroll- eller PPA-prøver enn i kontroller. Svarte prikker representerer taxa med signifikant forskjellig forekomst, med gjennomsnittlige CLR-forskjeller mellom -1 og 1. P-verdier ble beregnet ved hjelp av Mann-Whitney U-testen og korrigert for multippel testing ved hjelp av Benjamini-Hochberg-prosedyren. Fet gjennomsnittlig CLR-forskjell indikerer signifikante forskjeller i forekomst.
Etter å ha analysert tarmmikrobiell sammensetning, utførte vi en funksjonell annotering av mikrobiomet. Etter å ha filtrert ut gener av lav kvalitet, ble totalt 378 355 unike gener identifisert på tvers av alle prøvene. Den transformerte forekomsten av disse genene ble brukt til hovedkomponentanalyse (PCA), og resultatene viste en høy grad av gruppering av prøvetyper basert på deres funksjonelle profiler (figur 4).
Figur 4. PCA-resultater ved bruk av den funksjonelle profilen til musens tarmmikrobiom. PCA-plottet viser fordelingen av prøvene på tvers av de to første hovedkomponentene. Farger indikerer prøvetype: PPA-eksponerte mus er lilla og kontrollmus er gule. Hovedkomponentene 1 og 2 er plottet på henholdsvis x-aksen og y-aksen, og uttrykkes som deres forklarte variansforhold.
Vi undersøkte deretter forekomsten av KEGG-knockouts i forskjellige prøvetyper. Totalt 3648 unike knockouts ble identifisert, hvorav 196 var signifikant mer rikelig i kontrollprøver og 106 var mer rikelig i PPA-prøver (figur 5). Totalt 145 gener ble detektert i kontrollprøver og 61 gener i PPA-prøver, med signifikant ulik forekomst. Baner relatert til lipid- og aminosukkermetabolisme var signifikant mer beriket i PPA-prøver (tilleggstabell 3). Baner relatert til nitrogenmetabolisme og svovelrelésystemer var signifikant mer beriket i kontrollprøver (tilleggstabell 3). Forekomsten av gener relatert til aminosukker/nukleotidmetabolisme (ko:K21279) og inositolfosfatmetabolisme (ko:K07291) var signifikant høyere i PPA-prøver (figur 5). Kontrollprøver hadde signifikant flere gener relatert til benzoatmetabolisme (ko:K22270), nitrogenmetabolisme (ko:K00368) og glykolyse/glukoneogenese (ko:K00131) (figur 5).
Fig. 5. Differensiell forekomst av KO-er i tarmmikrobiomet hos PPA- og kontrollmus. Vulkanplottet viser forskjellene i forekomsten av funksjonelle grupper (KO-er). Grå prikker indikerer KO-er hvis forekomst ikke var signifikant forskjellig mellom prøvetyper (p-verdi > 0,05). Fargede prikker indikerer signifikante forskjeller i forekomst (p-verdi ≤ 0,05). De 20 KO-ene med de største forskjellene i forekomst mellom prøvetyper er vist i rødt og lyseblått, som tilsvarer henholdsvis kontroll- og PPA-prøver. Gule og lilla prikker indikerer KO-er som var minst 2,7 ganger mer forekomster i henholdsvis kontroll- og PPA-prøver. Svarte prikker indikerer KO-er med signifikant forskjellig forekomst, med gjennomsnittlige CLR-forskjeller mellom -1 og 1. P-verdier ble beregnet ved hjelp av Mann-Whitney U-testen og justert for multiple sammenligninger ved hjelp av Benjamini-Hochberg-prosedyren. NaN indikerer at KO-en ikke tilhører en signalvei i KEGG. Fet gjennomsnittlig CLR-forskjellsverdier indikerer signifikante forskjeller i forekomst. For detaljert informasjon om traséene som de listede KO-ene tilhører, se tilleggstabell 3.
Blant de kommenterte genene hadde 1601 gener signifikant forskjellig forekomst mellom prøvetypene (p ≤ 0,05), hvor hvert gen var minst 2,7 ganger mer rikelig. Av disse genene var 4 gener mer rikelig i kontrollprøvene og 1597 gener var mer rikelig i PPA-prøvene. Fordi PPA har antimikrobielle egenskaper, undersøkte vi forekomsten av PPA-metabolisme- og produksjonsgener mellom prøvetypene. Blant de 1332 PPA-metabolismerelaterte genene var 27 gener signifikant mer rikelig i kontrollprøvene og 12 gener var mer rikelig i PPA-prøvene. Blant de 223 PPA-produksjonsrelaterte genene var 1 gen signifikant mer rikelig i PPA-prøvene. Figur 6A demonstrerer videre den høyere forekomsten av gener involvert i PPA-metabolisme, med betydelig høyere forekomst i kontrollprøvene og store effektstørrelser, mens figur 6B fremhever individuelle gener med betydelig høyere forekomst observert i PPA-prøver.
Fig. 6. Differensiell forekomst av PPA-relaterte gener i musens tarmmikrobiom. Vulkanplott viser forskjellene i forekomsten av gener assosiert med PPA-metabolisme (A) og PPA-produksjon (B). Grå prikker indikerer gener hvis forekomst ikke var signifikant forskjellig mellom prøvetyper (p-verdi > 0,05). Fargede prikker indikerer signifikante forskjeller i forekomst (p-verdi ≤ 0,05). De 20 genene med de største forskjellene i forekomst er vist i henholdsvis rødt og lyseblått (kontroll- og PPA-prøver). Forekomsten av gule og lilla prikker var minst 2,7 ganger større i kontroll- og PPA-prøver enn i kontrollprøver. Svarte prikker representerer gener med signifikant forskjellig forekomst, med gjennomsnittlige CLR-forskjeller mellom -1 og 1. P-verdier ble beregnet ved hjelp av Mann-Whitney U-testen og korrigert for multiple sammenligninger ved hjelp av Benjamini-Hochberg-prosedyren. Gener tilsvarer representative gener i den ikke-redundante genkatalogen. Gennavn består av KEGG-symbolet som betegner et KO-gen. Fet gjennomsnittlig CLR-forskjell indikerer signifikant forskjellige forekomster. En bindestrek (-) indikerer at det ikke finnes noe symbol for genet i KEGG-databasen.
Taxa med gener relatert til PPA-metabolisme og/eller -produksjon ble identifisert ved å matche den taksonomiske identiteten til contigene med contig-ID-en til genet. På slektsnivå ble det funnet at 130 slekter hadde gener relatert til PPA-metabolisme, og 61 slekter hadde gener relatert til PPA-produksjon (tilleggstabell 4). Imidlertid viste ingen slekter signifikante forskjeller i forekomst (p > 0,05).
På artsnivå ble det funnet at 144 bakteriearter hadde gener assosiert med PPA-metabolisme, og 68 bakteriearter hadde gener assosiert med PPA-produksjon (tilleggstabell 5). Blant PPA-metabolisatorene viste åtte bakterier signifikant økning i forekomst mellom prøvetyper, og alle viste signifikante endringer i effekt (tilleggstabell 6). Alle identifiserte PPA-metabolisatorer med signifikante forskjeller i forekomst var mer rikelig i PPA-prøver. Klassifisering på artsnivå avdekket representanter for slekter som ikke skilte seg signifikant mellom prøvetyper, inkludert flere Bacteroides- og Ruminococcus-arter, samt Duncania dubois, Myxobacterium enterica, Monococcus pectinolyticus og Alcaligenes polymorpha. Blant de PPA-produserende bakteriene viste fire bakterier signifikante forskjeller i forekomst mellom prøvetyper. Arter med signifikante forskjeller i forekomst inkluderte Bacteroides novorossi, Duncania dubois, Myxobacterium enteritidis og Ruminococcus bovis.
I denne studien undersøkte vi effektene av PPA-eksponering på tarmfloraen hos mus. PPA kan fremkalle forskjellige responser hos bakterier fordi det produseres av visse arter, brukes som matkilde av andre arter, eller har antimikrobielle effekter. Derfor kan tilsetning av det til tarmmiljøet via kosttilskudd ha forskjellige effekter avhengig av toleranse, mottakelighet og evnen til å bruke det som næringskilde. Sensitive bakteriearter kan elimineres og erstattes av de som er mer resistente mot PPA eller i stand til å bruke det som matkilde, noe som fører til endringer i sammensetningen av tarmfloraen. Resultatene våre viste signifikante forskjeller i mikrobiell sammensetning, men ingen effekt på det totale mikrobielle mangfoldet. De største effektene ble observert på artsnivå, med over 70 taxa som var signifikant forskjellige i mengde mellom PPA og kontrollprøver (tilleggstabell 2). Videre evaluering av sammensetningen av PPA-eksponerte prøver viste større heterogenitet av mikrobielle arter sammenlignet med ueksponerte prøver, noe som tyder på at PPA kan forbedre bakterievekstegenskaper og begrense bakteriepopulasjoner som kan overleve i PPA-rike miljøer. Dermed kan PPA selektivt indusere endringer snarere enn å forårsake utbredt forstyrrelse av tarmfloraens mangfold.
Matkonserveringsmidler som PPA har tidligere vist seg å endre mengden av komponenter i tarmmikrobiomet uten å påvirke det totale mangfoldet (Nagpal et al., 2021). Her observerte vi de mest slående forskjellene mellom Bacteroidetes-arter innenfor rekken Bacteroidetes (tidligere kjent som Bacteroidetes), som var betydelig anriket hos PPA-eksponerte mus. Økt mengde Bacteroides-arter er assosiert med økt slimnedbrytning, noe som kan øke risikoen for infeksjon og fremme betennelse (Cornick et al., 2015; Desai et al., 2016; Penzol et al., 2019). En studie fant at nyfødte hannmus behandlet med Bacteroides fragilis viste sosial atferd som minner om autismespekterforstyrrelse (ASD) (Carmel et al., 2023), og andre studier har vist at Bacteroides-arter kan endre immunaktiviteten og føre til autoimmun inflammatorisk kardiomyopati (Gil-Cruz et al., 2019). Arter som tilhører slektene Ruminococcus, Prevotella og Parabacteroides var også signifikant forhøyet hos mus eksponert for PPA (Coretti et al., 2018). Enkelte Ruminococcus-arter er assosiert med sykdommer som Crohns sykdom gjennom produksjon av proinflammatoriske cytokiner (Henke et al., 2019), mens Prevotella-arter som Prevotella humani er assosiert med metabolske sykdommer som hypertensjon og insulinfølsomhet (Pedersen et al., 2016; Li et al., 2017). Til slutt fant vi at forholdet mellom Bacteroidetes (tidligere kjent som Firmicutes) og Bacteroidetes var betydelig lavere hos PPA-eksponerte mus enn hos kontrollmus på grunn av en høyere total forekomst av Bacteroidetes-arter. Dette forholdet har tidligere vist seg å være en viktig indikator på intestinal homeostase, og forstyrrelser i dette forholdet har vært assosiert med ulike sykdomstilstander (Turpin et al., 2016; Takezawa et al., 2021; An et al., 2023), inkludert inflammatoriske tarmsykdommer (Stojanov et al., 2020). Samlet sett ser det ut til at arter av rekken Bacteroidetes er sterkest påvirket av forhøyet PPA i kosten. Dette kan skyldes en høyere toleranse for PPA eller evnen til å bruke PPA som energikilde, noe som har vist seg å være sant for minst én art, Hoylesella enocea (Hitch et al., 2022). Alternativt kan eksponering for PPA hos mor forbedre fosterutviklingen ved å gjøre tarmen til museavkom mer utsatt for Bacteroidetes-kolonisering. Vår studiedesign tillot imidlertid ikke en slik vurdering.
Metagenomisk innholdsvurdering avdekket signifikante forskjeller i forekomsten av gener assosiert med PPA-metabolisme og -produksjon, der PPA-eksponerte mus viste en høyere forekomst av gener ansvarlige for PPA-produksjon, mens mus som ikke var PPA-eksponerte viste en høyere forekomst av gener ansvarlige for PAA-metabolisme (figur 6). Disse resultatene antyder at effekten av PPA på mikrobiell sammensetning kanskje ikke utelukkende skyldes bruken, ellers burde forekomsten av gener assosiert med PPA-metabolisme ha vist en høyere forekomst i tarmmikrobiomet hos PPA-eksponerte mus. En forklaring er at PPA medierer bakteriell forekomst primært gjennom sine antimikrobielle effekter snarere enn gjennom bruk av bakterier som næringsstoff. Tidligere studier har vist at PPA hemmer veksten av Salmonella Typhimurium på en doseavhengig måte (Jacobson et al., 2018). Eksponering for høyere konsentrasjoner av PPA kan selektere for bakterier som er resistente mot dens antimikrobielle egenskaper og ikke nødvendigvis er i stand til å metabolisere eller produsere den. For eksempel viste flere Parabacteroides-arter betydelig høyere forekomst i PPA-prøver, men ingen gener relatert til PPA-metabolisme eller -produksjon ble påvist (tilleggstabeller 2, 4 og 5). Videre er PPA-produksjon som et fermenteringsbiprodukt vidt fordelt blant forskjellige bakterier (Gonzalez-Garcia et al., 2017). Høyere bakteriemangfold kan være årsaken til den høyere forekomsten av gener relatert til PPA-metabolisme i kontrollprøver (Averina et al., 2020). Videre ble det bare spådd at 27 (2,14 %) av 1332 gener var gener assosiert utelukkende med PPA-metabolisme. Mange gener assosiert med PPA-metabolisme er også involvert i andre metabolske veier. Dette viser ytterligere at forekomsten av gener involvert i PPA-metabolisme var høyere i kontrollprøvene; disse genene kan fungere i veier som ikke resulterer i PPA-utnyttelse eller -dannelse som et biprodukt. I dette tilfellet viste bare ett gen assosiert med PPA-generering signifikante forskjeller i forekomst mellom prøvetyper. I motsetning til gener assosiert med PPA-metabolisme, ble markørgener for PPA-produksjon valgt fordi de er direkte involvert i den bakterielle veien for PPA-produksjon. Hos PPA-eksponerte mus ble det funnet at alle arter hadde betydelig økt forekomst og kapasitet til å produsere PPA. Dette støtter forutsigelsen om at PPA-er ville selektere PPA-produsenter og derfor forutsi at PPA-produksjonskapasiteten ville øke. Genforekomst korrelerer imidlertid ikke nødvendigvis med genuttrykk; selv om forekomsten av gener assosiert med PPA-metabolisme er høyere i kontrollprøver, kan uttrykkhastigheten være forskjellig (Shi et al., 2014). For å bekrefte forholdet mellom forekomsten av PPA-produserende gener og PPA-produksjon, er det behov for studier av uttrykket av gener involvert i PPA-produksjon.
Funksjonell annotering av PPA- og kontrollmetagenomene avdekket noen forskjeller. PCA-analyse av geninnhold avdekket diskrete klynger mellom PPA- og kontrollprøver (figur 5). Klynging innenfor prøven avdekket at kontrollgeninnholdet var mer mangfoldig, mens PPA-prøvene klynget seg sammen. Klynging etter geninnhold var sammenlignbar med klynging etter artssammensetning. Dermed er forskjeller i forekomst av pathways konsistente med endringer i forekomsten av spesifikke arter og stammer i dem. I PPA-prøver var to pathways med betydelig høyere forekomst relatert til aminosukker/nukleotid-sukkermetabolisme (ko:K21279) og flere lipidmetabolisme-pathways (ko:K00647, ko:K03801; tilleggstabell 3). Gener assosiert med ko:K21279 er kjent for å være assosiert med slekten Bacteroides, en av slektene med et betydelig høyere antall arter i PPA-prøvene. Dette enzymet kan unngå immunresponsen ved å uttrykke kapsulære polysakkarider (Wang et al., 2008). Dette kan forklare økningen i Bacteroidetes observert hos PPA-eksponerte mus. Dette komplementerer den økte fettsyresyntesen som observeres i PPA-mikrobiomet. Bakterier bruker FASIIko:K00647 (fabB)-signalveien for å produsere fettsyrer, noe som kan påvirke vertens metabolske veier (Yao og Rock, 2015; Johnson et al., 2020), og endringer i lipidmetabolismen kan spille en rolle i nevroutviklingen (Yu et al., 2020). En annen vei som viser økt forekomst i PPA-prøver var steroidhormonbiosyntese (ko:K12343). Det er økende bevis for at det er et omvendt forhold mellom tarmmikrobiotas evne til å påvirke hormonnivåer og å bli påvirket av hormoner, slik at forhøyede steroidnivåer kan ha helsekonsekvenser nedstrøms (Tetel et al., 2018).
Denne studien er ikke uten begrensninger og hensyn. En viktig forskjell er at vi ikke utførte fysiologiske vurderinger av dyrene. Derfor er det ikke mulig å konkludere direkte med om endringer i mikrobiomet er assosiert med noen sykdom. En annen faktor er at musene i denne studien ble fôret med samme diett som mødrene sine. Fremtidige studier kan avgjøre om bytte fra et PPA-rikt kosthold til et PPA-fritt kosthold forbedrer effekten på mikrobiomet. En begrensning ved vår studie, som mange andre, er den begrensede utvalgsstørrelsen. Selv om gyldige konklusjoner kan trekkes, ville et større utvalgsstørrelse gi større statistisk styrke når man analyserer resultatene. Vi er også forsiktige med å trekke konklusjoner om en sammenheng mellom endringer i tarmmikrobiomet og noen sykdom (Yap et al., 2021). Forstyrrende faktorer, inkludert alder, kjønn og kosthold, kan påvirke sammensetningen av mikroorganismer betydelig. Disse faktorene kan forklare inkonsekvensene som er observert i litteraturen angående sammenhengen mellom tarmmikrobiomet og komplekse sykdommer (Johnson et al., 2019; Lagod og Naser, 2023). For eksempel har medlemmer av slekten Bacteroidetes vist seg å enten være økt eller redusert hos dyr og mennesker med ASD (Angelis et al., 2013; Kushak et al., 2017). Tilsvarende har studier av tarmsammensetning hos pasienter med inflammatoriske tarmsykdommer funnet både økninger og reduksjoner i de samme taxaene (Walters et al., 2014; Forbes et al., 2018; Upadhyay et al., 2023). For å begrense virkningen av kjønnsskjevhet, prøvde vi å sikre lik representasjon av kjønnene, slik at forskjellene mest sannsynlig var drevet av kosthold. En utfordring med funksjonell annotering er fjerning av redundante gensekvenser. Vår genklyngemetode krever 95 % sekvensidentitet og 85 % lengdelikhet, samt 90 % justeringsdekning for å eliminere falsk klynging. I noen tilfeller observerte vi imidlertid COG-er med de samme annotasjonene (f.eks. MUT) (fig. 6). Ytterligere studier er nødvendige for å avgjøre om disse ortologene er distinkte, assosiert med spesifikke slekter, eller om dette er en begrensning ved genklyngemetoden. En annen begrensning ved funksjonell annotering er potensiell feilklassifisering; bakteriegenet mmdA er et kjent enzym involvert i propionatsyntese, men KEGG assosierer det ikke med propionats metabolske vei. I motsetning til dette er scpB- og mmcD-ortologene beslektet. Det store antallet gener uten angitte knockout-er kan føre til manglende evne til å identifisere PPA-relaterte gener når man vurderer genforekomst. Fremtidige studier vil dra nytte av metatranskriptomanalyse, som kan gi en dypere forståelse av de funksjonelle egenskapene til tarmmikrobiotaen og koble genuttrykk til potensielle nedstrømseffekter. For studier som involverer spesifikke nevroutviklingsforstyrrelser eller inflammatoriske tarmsykdommer, er det behov for fysiologiske og atferdsmessige vurderinger av dyr for å koble endringer i mikrobiomets sammensetning til disse lidelsene. Ytterligere studier som transplanterer tarmmikrobiomet til bakteriefrie mus, vil også være nyttige for å avgjøre om mikrobiomet er en driver eller et kjennetegn på sykdom.
Oppsummert viste vi at PPA i kosten fungerer som en faktor i å endre sammensetningen av tarmmikrobiotaen. PPA er et FDA-godkjent konserveringsmiddel som finnes mye i ulike matvarer, og som ved langvarig eksponering kan føre til forstyrrelse av den normale tarmfloraen. Vi fant endringer i forekomsten av flere bakterier, noe som tyder på at PPA kan påvirke sammensetningen av tarmmikrobiotaen. Endringer i mikrobiotaen kan føre til endringer i nivåene av visse metabolske veier, noe som kan føre til fysiologiske endringer som er relevante for vertens helse. Ytterligere studier er nødvendige for å avgjøre om effekten av PPA i kosten på mikrobiell sammensetning kan føre til dysbiose eller andre sykdommer. Denne studien legger grunnlaget for fremtidige studier av hvordan PPA-effekter på tarmsammensetning kan påvirke menneskers helse.
Datasettene som presenteres i denne studien er tilgjengelige i nettbaserte datalagre. Datalagsnavnet og tiltredelsesnummeret er: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/, PRJNA1092431.
Denne dyrestudien ble godkjent av University of Central Florida Institutional Animal Care and Use Committee (UCF-IACUC) (tillatelsesnummer for dyr: PROTO202000002). Denne studien er i samsvar med lokale lover, forskrifter og institusjonelle krav.
NG: Konseptualisering, datakuratering, formell analyse, undersøkelse, metodologi, programvare, visualisering, skriving (originalutkast), skriving (gjennomgang og redigering). LA: Konseptualisering, datakuratering, metodologi, ressurser, skriving (gjennomgang og redigering). SH: Formell analyse, programvare, skriving (gjennomgang og redigering). SA: Undersøkelse, skriving (gjennomgang og redigering). Sjefsdommer: Undersøkelse, skriving (gjennomgang og redigering). SN: Konseptualisering, prosjektadministrasjon, ressurser, veiledning, skriving (gjennomgang og redigering). TA: Konseptualisering, prosjektadministrasjon, veiledning, skriving (gjennomgang og redigering).
Forfatterne erklærte at de ikke har mottatt økonomisk støtte til forskningen, forfatterskapet og/eller publiseringen av denne artikkelen.
Forfatterne erklærer at forskningen ble utført uten kommersielle eller økonomiske forbindelser som kunne tolkes som en potensiell interessekonflikt. Ikke aktuelt.
Alle meninger som uttrykkes i denne artikkelen er utelukkende forfatternes egne og gjenspeiler ikke nødvendigvis synspunktene til deres institusjoner, utgivere, redaktører eller anmeldere. Produkter som evalueres i denne artikkelen, eller påstander fra produsentene, garanteres eller godkjennes ikke av utgiveren.
Tilleggsmateriale til denne artikkelen finner du på nett: https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/frmbi.2024.1451735/full#supplementary-material
Abdelli LS, Samsam A, Nasser SA (2019). Propionsyre induserer gliose og nevroinflammasjon ved å regulere PTEN/AKT-signalveien ved autismespekterforstyrrelser. Vitenskapelige rapporter 9, 8824–8824. doi: 10.1038/s41598-019-45348-z
Aitchison, J. (1982). Statistisk analyse av sammensetningsdata. JR Stat Soc Ser B Methodol. 44, 139–160. doi: 10.1111/j.2517-6161.1982.tb01195.x
Ahn J, Kwon H, Kim YJ (2023). Firmicutes/Bacteroidetes-forholdet som risikofaktor for brystkreft. Journal of Clinical Medicine, 12, 2216. doi: 10.3390/jcm12062216
Anders S., Huber W. (2010). Differensialuttrykksanalyse av sekvenstellingsdata. Nat Prev. 1–1, 1–10. doi: 10.1038/npre.2010.4282.1
Angelis, MD, Piccolo, M., Vannini, L., Siragusa, S., Giacomo, AD, Serrazanetti, DI, et al. (2013). Avføringsmikrobiota og metabolomet hos barn med autisme og gjennomgripende utviklingsforstyrrelse, ikke spesifisert på annen måte. PloS One 8, e76993. doi: 10.1371/journal.pone.0076993
Averina OV, Kovtun AS, Polyakova SI, Savilova AM, Rebrikov DV, Danilenko VN (2020). Bakterielle nevrometabolske egenskaper ved tarmmikrobiotaen hos små barn med autismespekterforstyrrelser. Journal of Medical Microbiology 69, 558–571. doi: 10.1099/jmm.0.001178
Baquero F., Nombela K. (2012). Mikrobiomet som et menneskelig organ. Clinical Microbiology and Infection 18, 2–4. doi: 10.1111/j.1469-0691.2012.03916.x
Baur T., Dürre P. (2023). Ny innsikt i fysiologien til propionsyreproduserende bakterier: Anaerotignum propionicum og Anaerotignum neopropionicum (tidligere Clostridium propionicum og Clostridium neopropionicum). Microorganisms 11, 685. doi: 10.3390/microorganisms11030685
Bazer FW, Spencer TE, Wu G, Cudd TA, Meininger SJ (2004). Mors ernæring og fosterutvikling. J Nutr. 134, 2169–2172. doi: 10.1093/jn/134.9.2169
Benjamini, Y., og Hochberg, J. (1995). Kontroll av falsk-positiv-raten: En praktisk og effektiv tilnærming til multippel testing. JR Stat Soc Ser B Methodol. 57, 289–300. doi: 10.1111/j.2517-6161.1995.tb02031.x