Immunmodulerende metabolitter er et sentralt trekk ved tumormikromiljøet (TME), men med noen få unntak forblir identiteten deres stort sett ukjent. Her analyserte vi tumorer og T-celler fra tumorer og ascites hos pasienter med høygradig serøs karsinom (HGSC) for å avdekke metabolomet til disse forskjellige TME-kompartmentene. Ascites og tumorceller har omfattende metabolittforskjeller. Sammenlignet med ascites er de tumorinfiltrerende T-cellene betydelig anriket på 1-metylnikotinamid (MNA). Selv om nivået av MNA i T-celler er forhøyet, er uttrykket av nikotinamid-N-metyltransferase (et enzym som katalyserer overføringen av metylgrupper fra S-adenosylmetionin til nikotinamid) begrenset til fibroblaster og tumorceller. Funksjonelt induserer MNA T-celler til å utskille det tumorfremmende cytokinet tumornekrosefaktor alfa. Derfor bidrar TME-avledet MNA til immunreguleringen av T-celler og representerer et potensielt immunterapimål for behandling av kreft hos mennesker.
Tumoravledede metabolitter kan ha en betydelig hemmende effekt på antitumorimmunitet, og stadig flere bevis viser at de også kan tjene som en viktig drivkraft for sykdomsprogresjon (1). I tillegg til Warburg-effekten har nyere arbeid begynt å karakterisere den metabolske tilstanden til tumorceller og dens forhold til immuntilstanden i tumormikromiljøet (TME). Studier på musemodeller og humane T-celler har vist at glutaminmetabolisme (2), oksidativ metabolisme (3) og glukosemetabolisme (4) kan virke uavhengig av hverandre på ulike immuncelleundergrupper. Flere metabolitter i disse signalveiene hemmer antitumorfunksjonen til T-celler. Det er bevist at blokkeringen av koenzymet tetrahydrobiopterin (BH4) kan skade proliferasjonen av T-celler, og økningen av BH4 i kroppen kan forsterke antitumorimmunresponsen mediert av CD4 og CD8. I tillegg kan den immunsuppressive effekten av kynurenin gjenopprettes ved administrering av BH4 (5). Ved isocitratdehydrogenase (IDH)-mutant glioblastom hemmer utskillelsen av enantiometabolsk (R)-2-hydroksyglutarat (R-2-HG) T-celleaktivering, proliferasjon og cytolyseaktivitet (6). Nylig har det blitt vist at metylglyoksal, et biprodukt av glykolyse, produseres av suppressorceller av myeloid opprinnelse, og T-celleoverføring av metylglyoksal kan hemme effektor-T-cellefunksjon. Ved behandling kan nøytralisering av metylglyoksal overvinne aktiviteten til myeloid-deriverte suppressorceller (MDSC) og synergistisk forbedre checkpoint-blokadebehandling i musemodeller (7). Disse studiene understreker samlet sett den viktige rollen til TME-deriverte metabolitter i reguleringen av T-cellefunksjon og -aktivitet.
T-celledysfunksjon har blitt rapportert mye ved eggstokkreft (8). Dette skyldes delvis de metabolske egenskapene som er forbundet med hypoksi og unormal tumorvaskulatur (9), noe som resulterer i omdannelse av glukose og tryptofan til biprodukter som melkesyre og kynurenin. Overdreven ekstracellulær laktat reduserer produksjonen av interferon-γ (IFN-γ) og driver differensieringen av myelosuppressive undergrupper (10, 11). Inntak av tryptofan hemmer direkte T-celleproliferasjon og hemmer T-cellereseptorsignalering (12-14). Til tross for disse observasjonene ble mye arbeid rundt immunmetabolisme utført i in vitro T-cellekultur ved bruk av optimaliserte medier, eller begrenset til homologe musemodeller in vivo, og ingen av disse gjenspeiler fullt ut heterogeniteten til menneskelige kreftformer og fysiologisk makro- og mikromiljø.
Et vanlig trekk ved eggstokkreft er spredning i buken og forekomst av ascites. Opphopning av cellevæske i ascites er assosiert med avansert sykdom og dårlig prognose (15). Ifølge rapporter er dette unike kammeret hypoksisk, har høye nivåer av vaskulær endotelvekstfaktor (VEGF) og indoleamin 2,3-dioksygenase (IDO), og er infiltrert av T-regulatoriske celler og myeloide hemmende celler (15-18). Det metabolske miljøet til ascites kan være forskjellig fra selve svulsten, så omprogrammeringen av T-celler i peritonealrommet er uklar. I tillegg kan de viktigste forskjellene og heterogeniteten mellom ascites og metabolitter som er tilstede i svulstmiljøet hindre infiltrasjon av immunceller og deres funksjon på svulster, og ytterligere forskning er nødvendig.
For å løse disse problemene utviklet vi en sensitiv celleseparasjons- og væskekromatografi-tandemmassespektrometri (LC-MS/MS)-metode for å studere forskjellige celletyper (inkludert CD4+- og CD8+-T-celler) samt innenfor og mellom svulster. Metabolittene spenner over celler i samme ascites- og svulstmiljø som pasienten. Vi bruker denne metoden i forbindelse med høydimensjonal flowcytometri og enkeltcellet RNA-sekvensering (scRNA-seq) for å gi et svært oppløst portrett av den metabolske statusen til disse nøkkelpopulasjonene. Denne metoden avdekket en betydelig økning i nivået av 1-metylnikotinamid (MNA) i tumor-T-celler, og in vitro-eksperimenter viste at den immunmodulerende effekten av MNA på T-cellefunksjonen tidligere var ukjent. Generelt sett avslører denne metoden de gjensidige metabolske interaksjonene mellom svulster og immunceller, og gir unik innsikt i immunreguleringsmetabolitter, noe som kan være nyttig for behandling av T-cellebasert immunterapi for eggstokkreft.
Vi brukte høydimensjonal flowcytometri for å samtidig kvantifisere glukoseopptak [2-(N-(7-nitrofenyl-2-oksa-1,3-diaza-4-yl)amino)-2-deoksyglukose (2-NBDG) og mitokondriell aktivitet [MitoTracker Deep Red (MT DR)] (7, 19, 20) er typiske markører som side om side skiller immunceller og tumorcellepopulasjoner (tabell S2 og figur S1A). Denne analysen viste at sammenlignet med T-celler har ascites og tumorceller høyere glukoseopptaksnivåer, men har mindre forskjeller i mitokondriell aktivitet. Gjennomsnittlig glukoseopptak av tumorceller [CD45-EpCAM (EpCAM)+] er tre til fire ganger så høyt som for T-celler, og gjennomsnittlig glukoseopptak av CD4+ T-celler er 1,2 ganger så høyt som for CD8+ T-celler, noe som indikerer at tumorinfiltrerende lymfocytter (TIL) har forskjellige metabolske krav selv i samme TME (figur 1A). I kontrast er mitokondrieaktiviteten i tumorceller lik den til CD4+ T-celler, og mitokondrieaktiviteten til begge celletypene er høyere enn den til CD8+ T-celler (figur 1B). Generelt sett viser disse resultatene det metabolske nivået. Den metabolske aktiviteten til tumorceller er høyere enn den til CD4+ T-celler, og den metabolske aktiviteten til CD4+ T-celler er høyere enn den til CD8+ T-celler. Til tross for disse effektene på tvers av celletyper, er det ingen konsistent forskjell i den metabolske statusen til CD4+ og CD8+ T-celler eller deres relative andeler i ascites sammenlignet med tumorer (figur 1C). I kontrast økte andelen EpCAM+ celler i tumoren i CD45-cellefraksjonen sammenlignet med ascites (figur 1D). Vi observerte også en klar metabolsk forskjell mellom EpCAM+ og EpCAM- cellekomponenter. EpCAM+ (tumor) celler har høyere glukoseopptak og mitokondrieaktivitet enn EpCAM- celler, noe som er mye høyere enn den metabolske aktiviteten til fibroblaster i tumorceller i TME (figur 1, E og F).
(A og B) Median fluorescensintensitet (MFI) for glukoseopptak (2-NBDG) (A) og mitokondriell aktivitet til CD4+ T-celler (MitoTracker mørkerød) (B) Representative grafer (venstre) og tabulerte data (høyre), CD8+ T-celler og EpCAM+ CD45-tumorceller fra ascites og tumor. (C) Forholdet mellom CD4+ og CD8+ celler (av CD3+ T-celler) i ascites og tumor. (D) Andel av EpCAM+ tumorceller i ascites og tumor (CD45−). (E og F) EpCAM + CD45-tumor og EpCAM-CD45-matriks glukoseopptak (2-NBDG) (E) og mitokondriell aktivitet (MitoTracker mørkerød) (F) representative grafer (venstre) og tabulerte data (høyre) Ascites og tumorceller. (G) Representative grafer av CD25-, CD137- og PD1-ekspresjon ved hjelp av flowcytometri. (H og I) CD25-, CD137- og PD1-ekspresjon på CD4+ T-celler (H) og CD8+ T-celler (I). (J og K) Naive fenotyper, sentralhukommelse (Tcm), effektorhukommelse (Teff) og effektorhukommelse (Tem) basert på ekspresjon av CCR7 og CD45RO. Representative bilder (venstre) og tabelldata (høyre) av CD4+ T-celler (J) og CD8+ T-celler (K) i ascites og svulster. P-verdier bestemt ved paret t-test (*P<0,05, **P<0,01 og ***P<0,001). Linjen representerer samsvarende pasienter (n = 6). FMO, fluorescens minus én; MFI, median fluorescensintensitet.
Videre analyse avdekket andre signifikante forskjeller mellom den fenotypiske statusen til T-celler med høy oppløsning. Aktivert (figur 1, G til I) og effektorhukommelse (figur 1, J og K) i svulster er mye hyppigere enn ascites (andel av CD3+ T-celler). Tilsvarende viste analyse av fenotypen ved uttrykk av aktiveringsmarkører (CD25 og CD137) og deplesjonsmarkører [programmert celledødsprotein 1 (PD1)] at selv om de metabolske egenskapene til disse populasjonene er forskjellige (figur S1, B til E), ble det ikke observert noen signifikante metabolske forskjeller konsekvent mellom naive, effektor- eller hukommelsesundergrupper (figur S1, F til I). Disse resultatene ble bekreftet ved bruk av maskinlæringsmetoder for automatisk å tilordne cellefenotyper (21), noe som ytterligere avdekket tilstedeværelsen av et stort antall benmargsceller (CD45+ / CD3- / CD4+ / CD45RO+) i pasientens ascites (figur S2A). Blant alle de identifiserte celletypene viste denne myeloide cellepopulasjonen det høyeste glukoseopptaket og mitokondrieaktiviteten (figur S2, B til G). Disse resultatene fremhever de sterke metabolske forskjellene mellom de mange celletypene som finnes i ascites og svulster hos HGSC-pasienter.
Hovedutfordringen med å forstå de metabonomiske egenskapene til TIL er behovet for å isolere T-celleprøver med tilstrekkelig renhet, kvalitet og kvantitet fra svulster. Nyere studier har vist at sorterings- og kuleberikelsesmetoder basert på flowcytometri kan føre til endringer i cellulære metabolittprofiler (22-24). For å overvinne dette problemet optimaliserte vi kuleberikelsesmetoden for å isolere og isolere TIL fra kirurgisk resektert menneskelig eggstokkreft før analyse ved LC-MS/MS (se Materialer og metoder; figur 2A). For å vurdere den samlede effekten av denne protokollen på metabolittendringer, sammenlignet vi metabolittprofilene til T-celler aktivert av friske donorer etter ovennevnte kuleseparasjonstrinnet med celler som ikke ble kuleseparert, men forble på is. Denne kvalitetskontrollanalysen fant at det er en høy korrelasjon mellom disse to forholdene (r = 0,77), og den tekniske repeterbarheten til gruppen av 86 metabolitter har høy repeterbarhet (figur 2B). Derfor kan disse metodene utføre nøyaktig metabolittanalyse i celler som gjennomgår celletypeanrikning, og dermed gi den første plattformen med høy oppløsning for å identifisere spesifikke metabolitter i HGSC, og dermed gjøre det mulig for folk å få en dypere forståelse av cellespesifisiteten til seksuell metabolisme-programmet.
(A) Skjematisk diagram av berikelse av magnetiske kuler. Før analyse ved LC-MS/MS vil cellene gjennomgå tre påfølgende runder med berikelse av magnetiske kuler eller forbli på is. (B) Effekten av berikelsestype på mengden metabolitter. Gjennomsnittet av tre målinger for hver berikelsestype ± SE. Den grå linjen representerer et 1:1-forhold. Intra-klasse korrelasjon (ICC) av gjentatte målinger vist i akseetiketten. NAD, nikotinamid-adenin-dinukleotid. (C) Skjematisk diagram av arbeidsflyten for pasientmetabolittanalyse. Ascites eller svulster samles inn fra pasienter og kryokonserveres. En liten del av hver prøve ble analysert ved hjelp av flowcytometri, mens de resterende prøvene gjennomgikk tre runder med berikelse for CD4+-, CD8+- og CD45--celler. Disse cellefraksjonene ble analysert ved hjelp av LC-MS/MS. (D) Varmekart over standardisert metabolittforekomst. Dendrogrammet representerer Wards gruppering av euklidske avstander mellom prøver. (E) Hovedkomponentanalyse (PCA) av metabolittkartet til prøven, som viser tre replikater av hver prøve, prøver fra samme pasient er forbundet med en linje. (F) PCA for metabolittprofilen til prøven betinget av pasienten (dvs. ved bruk av delvis redundans); prøvetypen er begrenset av det konvekse skallet. PC1, hovedkomponent 1; PC2, hovedkomponent 2.
Deretter anvendte vi denne anrikningsmetoden for å analysere 99 metabolitter i CD4+-, CD8+- og CD45-cellefraksjonene i primære ascites og svulster hos seks HGSC-pasienter (figur 2C, figur S3A og tabell S3 og S4). Populasjonen av interesse utgjør 2 % til 70 % av den opprinnelige store prøven av levende celler, og andelen celler varierer sterkt mellom pasienter. Etter separering av kulene utgjør den anrikede fraksjonen av interesse (CD4+, CD8+ eller CD45-) i gjennomsnitt mer enn 85 % av alle levende celler i prøven. Denne anrikningsmetoden lar oss analysere cellepopulasjoner fra metabolisme i menneskelig tumorvev, noe som er umulig å gjøre fra store prøver. Ved hjelp av denne protokollen bestemte vi at l-kynurenin og adenosin, disse to godt karakteriserte immunsuppressive metabolittene, var forhøyet i tumor-T-celler eller tumorceller (figur S3, B og C). Derfor demonstrerer disse resultatene nøyaktigheten og evnen til vår celleseparasjons- og massespektrometriteknologi til å finne biologisk viktige metabolitter i pasientvev.
Vår analyse avdekket også en sterk metabolsk separasjon av celletyper innenfor og mellom pasienter (figur 2D og figur S4A). Spesielt, sammenlignet med andre pasienter, viste pasient 70 forskjellige metabolske egenskaper (figur 2E og figur S4B), noe som indikerer at det kan være betydelig metabolsk heterogenitet mellom pasienter. Det er verdt å merke seg at sammenlignet med andre pasienter (1,2 til 2 liter; tabell S1), var den totale mengden ascites samlet hos pasient 70 (80 ml) mindre. Kontrollen av heterogenitet mellom pasienter under hovedkomponentanalyse (for eksempel ved bruk av delvis redundansanalyse) viser konsistente endringer mellom celletyper, og celletypene og/eller mikromiljøet er tydelig aggregert i henhold til metabolittprofilen (figur 2F). Analysen av enkeltmetabolitter understreket disse effektene og avdekket signifikante forskjeller mellom celletyper og mikromiljø. Det er verdt å merke seg at den mest ekstreme observerte forskjellen er MNA, som vanligvis er anriket i CD45-celler og i CD4+ og CD8+ celler som infiltrerer svulsten (figur 3A). For CD4+-celler er denne effekten mest åpenbar, og MNA i CD8+-celler ser også ut til å være sterkt påvirket av miljøet. Dette er imidlertid ikke viktig, fordi bare tre av de seks pasientene kan evalueres for tumor CD8+-score. I tillegg til MNA, i forskjellige celletyper i ascites og svulster, er andre metabolitter som er dårlig karakterisert i TIL også differensielt rike (figur S3 og S4). Derfor avslører disse dataene et lovende sett med immunmodulerende metabolitter for videre forskning.
(A) Normalisert innhold av MNA i CD4+-, CD8+- og CD45--celler fra ascites og tumor. Boksplottet viser median (linje), interkvartilområde (rammehengsel) og dataområde, opptil 1,5 ganger interkvartilområdet (rammevinkel). Som beskrevet i pasientmaterialer og metoder, bruk pasientens limmaverdi for å bestemme P-verdien (*P<0,05 og **P<0,01). (B) Skjematisk diagram av MNA-metabolisme (60). Metabolitter: S-adenosyl-1-metionin; SAH, S-adenosin-1-homocystein; NA, nikotinamid; MNA, 1-metylnikotinamid; 2-PY, 1-metyl-2-pyridon-5-karboksamid; 4-PY, 1-metyl-4-pyridon-5-karboksamid; NR, nikotinamid-ribose; NMN, nikotinamidmononukleotid. Enzymer (grønn): NNMT, nikotinamid-N-metyltransferase; SIRT, sirtuiner; NAMPT, nikotinamid-fosforibosyltransferase; AOX1, aldehydoksidase 1; NRK, nikotinamid-ribosidkinase; NMNAT, nikotinamid-mononukleotid-adenylattransferase; Pnp1, purinnukleosid-fosforylase. (C) t-SNE av scRNA-sekvens av ascites (grå) og tumor (rød; n = 3 pasienter). (D) NNMT-ekspresjon i forskjellige cellepopulasjoner identifisert ved hjelp av scRNA-sekvens. (E) Ekspresjon av NNMT og AOX1 i SK-OV-3, humane embryonale nyre (HEK) 293T, T-celler og MNA-behandlede T-celler. Det foldede ekspresjonsmønsteret er vist i forhold til SK-OV-3. Ekspresjonsmønsteret med SEM er vist (n = 6 friske donorer). Ct-verdier større enn 35 anses som ikke-detekterbare (UD). (F) Ekspresjon av SLC22A1 og SLC22A2 i SK-OV-3, HEK293T, T-celler og T-celler behandlet med 8 mM MNA. Den foldede ekspresjonen er vist i forhold til SK-OV-3. Ekspresjonsmønsteret med SEM er vist (n = 6 friske donorer). Ct-verdier større enn 35 anses som udetekterbare (UD). (G) Celle-MNA-innhold i aktiverte friske donor-T-celler etter 72 timers inkubasjon med MNA. Ekspresjonsmønsteret med SEM er vist (n = 4 friske donorer).
MNA produseres ved å overføre metylgruppen fra S-adenosyl-1-metionin (SAM) til nikotinamid (NA) ved hjelp av nikotinamid-N-metyltransferase (NNMT; figur 3B). NNMT er overuttrykt i en rekke humane kreftformer og er assosiert med proliferasjon, invasjon og metastase (25-27). For å bedre forstå kilden til MNA i T-celler ved TME, brukte vi scRNA-seq for å karakterisere uttrykket av NNMT på tvers av celletyper i ascites og svulster hos tre HGSC-pasienter (tabell S5). Analyse av omtrent 6500 celler viste at NNMT-uttrykk i ascites- og tumormiljøer var begrenset til de antatte fibroblast- og tumorcellepopulasjonene (figur 3, C og D). Det er verdt å merke seg at det ikke finnes noe åpenbart NNMT-uttrykk i noen populasjon som uttrykker PTPRC (CD45+) (figur 3D og figur S5A), noe som indikerer at MNA som er oppdaget i metabolittspekteret har blitt introdusert i T-celler. Ekspresjonen av aldehydoksidase 1 (AOX1) omdanner MNA til 1-metyl-2-pyridon-5-karboksamid (2-PYR) eller 1-metyl-4-pyridon-5-karboksamid (4-PYR); figur 3B) er også begrenset til populasjonen av fibroblaster som uttrykker COL1A1 (figur S5A), som sammen indikerer at T-celler mangler evnen til konvensjonell MNA-metabolisme. Ekspresjonsmønsteret til disse MNA-relaterte genene ble verifisert ved hjelp av et andre uavhengig celledatasett fra ascites fra HGSC-pasienter (figur S5B; n = 6) (16). I tillegg viste kvantitativ polymerasekjedereaksjonsanalyse (qPCR) av friske donor-T-celler behandlet med MNA at sammenlignet med kontroll SK-OV-3 ovarietumorceller, ble NNMT eller AOX1 nesten ikke uttrykt (figur 3E). Disse uventede resultatene indikerer at MNA kan bli utskilt fra fibroblaster eller svulster inn i tilstøtende T-celler i TME.
Selv om kandidatene inkluderer familien av organiske kationtransportører 1 til 3 (OCT1, OCT2 og OCT3) kodet av den løselige bærer 22 (SLC22)-familien (SLC22A1, SLC22A2 og SLC22A3), er de potensielle transportørene av MNA fortsatt udefinerte (28). QPCR av mRNA fra friske donor-T-celler viste lave ekspresjonsnivåer av SLC22A1, men ikke-detekterbare nivåer av SLC22A2, noe som bekreftet at det tidligere hadde blitt rapportert i litteraturen (figur 3F) (29). I motsetning til dette uttrykte SK-OV-3 ovarietumorcellelinjen høye nivåer av begge transportørene (figur 3F).
For å teste muligheten for at T-celler har evnen til å absorbere fremmed MNA, ble friske donor-T-celler dyrket i 72 timer i nærvær av forskjellige konsentrasjoner av MNA. I fravær av eksogent MNA kan ikke det cellulære innholdet av MNA detekteres (figur 3G). Aktiverte T-celler behandlet med eksogent MNA viste imidlertid en doseavhengig økning i MNA-innhold i cellene, opptil 6 mM MNA (figur 3G). Dette resultatet indikerer at til tross for det lave nivået av transportørekspresjon og mangel på hovedenzymet som er ansvarlig for intracellulær MNA-metabolisme, kan TIL fortsatt ta opp MNA.
Spekteret av metabolitter i pasientenes T-celler og in vitro MNA-absorpsjonsforsøk øker muligheten for at kreftassosierte fibroblaster (CAF) utskiller MNA, og at tumorceller kan regulere fenotypen og funksjonen til TIL. For å bestemme effekten av MNA på T-celler ble friske donor-T-celler aktivert in vitro i nærvær eller fravær av MNA, og deres proliferasjon og cytokinproduksjon ble evaluert. Etter 7 dager med tilsetning av MNA ved høyeste dose, var populasjonsdoblingstallet moderat redusert, mens vigor ble opprettholdt ved alle doser (figur 4A). I ​​tillegg resulterte behandling av eksogen MNA i en økning i andelen CD4+ og CD8+ T-celler som uttrykker tumornekrosefaktor-α (TNFα; figur 4B). I motsetning til dette var den intracellulære produksjonen av IFN-γ signifikant redusert i CD4+ T-celler, men ikke i CD8+ T-celler, og det var ingen signifikant endring i interleukin 2 (IL-2; figur 4, C og D). Derfor viste enzymbundet immunosorbentanalyse (ELISA) av supernatanter fra disse MNA-behandlede T-cellekulturene en signifikant økning i TNFα, en reduksjon i IFN-γ og ingen endring i IL-2 (figur 4, E til G). Reduksjonen av IFN-γ indikerer at MNA kan spille en rolle i å hemme antitumoraktiviteten til T-celler. For å simulere effekten av MNA på T-cellemediert cytotoksisitet, produseres kimære antigenreseptor T (FRα-CAR-T)-celler som er rettet mot folatreseptor α og CAR-T (GFP) regulert av grønt fluorescerende protein (GFP)-CAR-T)-celler av friske perifere blodmononukleære celler (PBMC) fra donorer. CAR-T-celler ble dyrket i 24 timer i nærvær av MNA, og deretter kodyrket med humane SK-OV-3 ovarietumorceller som uttrykker folatreseptor α i et effektor-til-mål-forhold på 10:1. MNA-behandling resulterte i en betydelig reduksjon i drepeaktiviteten til FRα-CAR-T-celler, som var lik den til FRα-CAR-T-celler behandlet med adenosin (figur 4H).
(A) Totalt antall levedyktige celler og populasjonsdobling (PD) direkte fra kultur på dag 7. Stolpediagrammet representerer gjennomsnittet + SEM for seks friske donorer. Representerer data fra minst n = 3 uavhengige eksperimenter. (B til D) CD3/CD28 og IL-2 ble brukt til å aktivere T-celler ved deres respektive MNA-konsentrasjoner i 7 dager. Før analyse ble cellene stimulert med PMA/ionomycin med GolgiStop i 4 timer. TNFα (B)-ekspresjon i T-celler. Eksempelbilde (venstre) og tabelldata (høyre) av TNFα-ekspresjon i levende celler. IFN-γ (C) og IL-2 (D)-ekspresjon i T-celler. Ekspresjonen av cytokiner ble målt ved hjelp av flowcytometri. Stolpediagrammet representerer gjennomsnittet (n = 6 friske donorer) + SEM. Bruk enveis variansanalyse og gjentatte målinger (*P<0,05 og **P<0,01) for å bestemme P-verdien. Representerer data fra minst n = 3 uavhengige eksperimenter. (E til G) CD3/CD28 og IL-2 ble brukt til å aktivere T-celler ved deres respektive MNA-konsentrasjoner i 7 dager. Mediet ble samlet før og etter 4 timer med PMA/ionomycin-stimulering. Konsentrasjonene av TNFα (E), IFN-γ (F) og IL-2 (G) ble målt ved ELISA. Stolpediagrammet representerer gjennomsnittet (n = 5 friske donorer) + SEM. P-verdi bestemt ved hjelp av enveis variansanalyse og gjentatte målinger (*P < 0,05). Den stiplede linjen indikerer deteksjonsgrensen for deteksjonen. (H) Cellelyseanalyse. FRα-CAR-T- eller GFP-CAR-T-celler ble justert med adenosin (250 μM) eller MNA (10 mM) i 24 timer, eller latt være ubehandlet (Ctrl). Prosentandelen dreping av SK-OV-3-celler ble målt. P-verdi bestemt ved Welch t-test (*P < 0,5 og **P < 0,01).
For å få en mekanistisk forståelse av MNA-avhengig TNFα-ekspresjonsregulering ble endringene i TNFα mRNA hos MNA-behandlede T-celler evaluert (figur 5A). Friske donor-T-celler behandlet med MNA viste en dobbel økning i TNFα-transkripsjonsnivåer, noe som indikerer at MNA er avhengig av TNFα-transkripsjonsregulering. For å undersøke denne mulige reguleringsmekanismen ble to kjente transkripsjonsfaktorer som regulerer TNFα, nemlig aktivert T-cellekjernefaktor (NFAT) og spesifikt protein 1 (Sp1), evaluert som respons på MNA-binding til den proksimale TNFα-promotoren (30). TNFα-promotoren inneholder 6 identifiserte NFAT-bindingssteder og 2 Sp1-bindingssteder, som overlapper på ett sted [-55 basepar (bp) fra 5'-kappen] (30). Kromatinimmunopresipitasjon (ChIP) viste at når den ble behandlet med MNA, økte bindingen av Sp1 til TNFα-promotoren tre ganger. Inkorporeringen av NFAT økte også og nærmet seg betydning (figur 5B). Disse dataene indikerer at MNA regulerer uttrykket av TNFα gjennom Sp1-transkripsjon, og i mindre grad uttrykket av NFAT.
(A) Sammenlignet med T-celler dyrket uten MNA, endringen i antall ganger TNFα-ekspresjon i T-celler behandlet med MNA. Ekspresjonsmønsteret med SEM er vist (n = 5 friske donorer). Representerer data fra minst n = 3 uavhengige eksperimenter. (B) TNFα-promotoren til T-celler behandlet med eller uten 8 mM MNA etter at NFAT og Sp1 ble kombinert med (Ctrl) og PMA/ionomycin-stimulering i 4 timer. Immunoglobulin G (IgG) og H3 ble brukt som henholdsvis negative og positive kontroller for immunutfelling. Kvantifiseringen av ChIP viste at bindingen av Sp1 og NFAT til TNFα-promotoren i MNA-behandlede celler økte flere ganger sammenlignet med kontrollen. Representerer data fra minst n = 3 uavhengige eksperimenter. P-verdi bestemt av flere t-tester (*** P <0,01). (C) Sammenlignet med ascites fra HGSC, viste T-celler (ikke-cytotoksiske) økt ekspresjon av TNF i svulsten. Fargene representerer forskjellige pasienter. De viste cellene har blitt tilfeldig samplet til 300 og jitteret for å begrense overdrawing (** Padj = 0,0076). (D) Foreslått modell av MNA for eggstokkreft. MNA produseres i tumorceller og fibroblaster i TME og tas opp av T-celler. MNA øker bindingen av Sp1 til TNFα-promotoren, noe som fører til økt TNFα-transkripsjon og TNFα-cytokinproduksjon. MNA forårsaker også en reduksjon i IFN-γ. Hemming av T-cellefunksjon fører til redusert drepeevne og akselerert tumorvekst.
Ifølge rapporter har TNFα front- og bakavhengige antitumor- og antitumoreffekter, men det har en velkjent rolle i å fremme vekst og metastase av eggstokkreft (31-33). Ifølge rapporter er konsentrasjonen av TNFα i ascites og tumorvev hos pasienter med eggstokkreft høyere enn i godartet vev (34-36). Når det gjelder mekanisme, kan TNFα regulere aktiveringen, funksjonen og proliferasjonen av hvite blodlegemer, og endre fenotypen til kreftceller (37, 38). I samsvar med disse funnene viste differensiell genekspresjonsanalyse at TNF var signifikant oppregulert i T-celler i tumorvev sammenlignet med ascites (figur 5C). Økningen i TNF-ekspresjon var bare tydelig i T-cellepopulasjoner med en ikke-cytotoksisk fenotype (figur S5A). Oppsummert støtter disse dataene synspunktet om at MNA har to immunsuppressive og tumorfremmende effekter ved HGSC.
Fluorescensmerking basert på flowcytometri har blitt hovedmetoden for å studere TIL-metabolisme. Disse studiene har vist at murin og human TIL har en høyere tendens til å ta opp glukose (4, 39) og gradvis tap av mitokondriefunksjon (19, 40) sammenlignet med perifere blodlymfocytter eller T-celler fra sekundære lymfoide organer. Selv om vi har observert lignende resultater i denne studien, er den viktigste utviklingen å sammenligne metabolismen til tumorceller og TIL fra det samme resekterte tumorvevet. I samsvar med noen av disse tidligere rapportene har tumorceller (CD45-EpCAM+) fra ascites og tumorer høyere glukoseopptak enn CD8+ og CD4+ T-celler, noe som støtter at det høye glukoseopptaket til tumorceller kan sammenlignes med T-celler. Konseptet med T-cellekonkurranse. TME. Imidlertid er den mitokondrielle aktiviteten til tumorceller høyere enn den til CD8+ T-celler, men den mitokondrielle aktiviteten er lik den til CD4+ T-celler. Disse resultatene forsterker det nye temaet om at oksidativ metabolisme er viktig for tumorceller (41, 42). De antyder også at CD8+ T-celler kan være mer utsatt for oksidativ dysfunksjon enn CD4+ T-celler, eller at CD4+ T-celler kan bruke andre karbonkilder enn glukose for å opprettholde mitokondriell aktivitet (43, 44). Det bør bemerkes at vi ikke observerte noen forskjell i glukoseopptak eller mitokondriell aktivitet mellom CD4+ T-effektorer, T-effektorhukommelse og T-sentralhukommelsesceller i ascites. Tilsvarende har differensieringstilstanden til CD8+ T-celler i svulster ingenting å gjøre med endringer i glukoseopptak, noe som fremhever den signifikante forskjellen mellom T-celler dyrket in vitro og human TIL in vivo (22). Disse observasjonene ble også bekreftet ved bruk av objektiv automatisk cellepopulasjonsallokering, som videre avslørte at CD45+ / CD3- / CD4+ / CD45RO+ celler med høyere glukoseopptak og mitokondriell aktivitet enn tumorceller er utbredt, men har en metabolsk aktiv cellepopulasjon. Denne populasjonen kan representere den antatte subpopulasjonen av myeloide suppressorceller eller plasmacytoide dendrittiske celler identifisert i scRNA-seq-analysen. Selv om begge disse har blitt rapportert i menneskelige eggstokksvulster [45], trenger de fortsatt ytterligere arbeid for å beskrive denne myeloide subpopulasjonen.
Selv om flowcytometribaserte metoder kan avklare de generelle forskjellene i glukose- og oksidativ metabolisme mellom celletyper, er de nøyaktige metabolittene produsert av glukose eller andre karbonkilder for mitokondriell metabolisme i TME ennå ikke bestemt. Å tilordne tilstedeværelse eller fravær av metabolitter til en gitt TIL-undergruppe krever rensing av cellepopulasjonen fra det utskårne vevet. Derfor kan vår celleberikelsesmetode kombinert med massespektrometri gi innsikt i metabolittene som er differensielt anriket i T-celler og tumorcellepopulasjoner i matchende pasientprøver. Selv om denne metoden har fordeler fremfor fluorescensaktivert cellesortering, kan visse metabolittbiblioteker bli påvirket på grunn av iboende stabilitet og/eller rask omsetningshastighet (22). Likevel var vår metode i stand til å identifisere to anerkjente immunsuppressive metabolitter, adenosin og kynurenin, fordi de varierer sterkt mellom prøvetyper.
Vår metabonomiske analyse av svulster og TIL-subtyper gir mer innsikt i rollen til metabolitter i ovariell TME. For det første, ved hjelp av flowcytometri, bestemte vi at det ikke var noen forskjell i mitokondriell aktivitet mellom svulster og CD4+ T-celler. LC-MS/MS-analyse avdekket imidlertid signifikante endringer i mengden av metabolitter blant disse populasjonene, noe som indikerer at konklusjoner om TIL-metabolisme og dens generelle metabolske aktivitet krever nøye tolkning. For det andre er MNA metabolitten med størst forskjell mellom CD45-celler og T-celler i ascites, ikke i svulster. Derfor kan kompartmentalisering og svulstlokalisering ha forskjellige effekter på TIL-metabolismen, noe som fremhever den mulige heterogeniteten i et gitt mikromiljø. For det tredje er uttrykket av det MNA-produserende enzymet NNMT hovedsakelig begrenset til CAF, som er tumorceller i mindre grad, men påviselige MNA-nivåer observeres i tumoravledede T-celler. Overuttrykket av NNMT i ovariell CAF har en kjent kreftfremmende effekt, delvis på grunn av fremme av CAF-metabolisme, tumorinvasjon og metastase (27). Selv om det generelle nivået av TIL er moderat, er uttrykket av NNMT i CAF nært beslektet med den mesenkymale subtypen Cancer Genome Atlas (TCGA), som er assosiert med dårlig prognose (27, 46, 47). Til slutt er uttrykket av enzymet AOX1 som er ansvarlig for MNA-nedbrytning også begrenset til CAF-populasjonen, noe som indikerer at T-celler mangler evnen til å metabolisere MNA. Disse resultatene støtter ideen om at selv om ytterligere arbeid er nødvendig for å bekrefte dette funnet, kan høye nivåer av MNA i T-celler indikere tilstedeværelsen av et immunsuppressivt CAF-mikromiljø.
Gitt det lave uttrykknivået av MNA-transportører og de ikke-detekterbare nivåene av viktige proteiner involvert i MNA-metabolisme, er tilstedeværelsen av MNA i T-celler uventet. Verken NNMT eller AOX1 kunne detekteres ved scRNA-seq-analyse og målrettet qPCR av to uavhengige kohorter. Disse resultatene indikerer at MNA ikke syntetiseres av T-celler, men absorberes fra omkringliggende TME. In vitro-eksperimenter viser at T-celler har en tendens til å akkumulere eksogent MNA.
Våre in vitro-studier har vist at eksogent MNA induserer uttrykket av TNFα i T-celler og forsterker bindingen av Sp1 til TNFα-promotoren. Selv om TNFα har både antitumor- og antitumorfunksjoner, kan TNFα fremme veksten av eggstokkreft ved eggstokkreft (31-33). Nøytralisering av TNFα i ovarietumorcellekultur eller eliminering av TNFα-signal i musemodeller kan forbedre TNFα-mediert inflammatorisk cytokinproduksjon og hemme tumorvekst (32, 35). Derfor kan TME-avledet MNA i dette tilfellet fungere som en proinflammatorisk metabolitt gjennom en TNFα-avhengig mekanisme gjennom den autokrine løkken, og dermed fremme forekomsten og spredningen av eggstokkreft (31). Basert på denne muligheten studeres TNFα-blokade som et potensielt terapeutisk middel for eggstokkreft (37, 48, 49). I tillegg svekker MNA cytotoksisiteten til CAR-T-celler til ovarietumorceller, noe som gir ytterligere bevis for MNA-mediert immunsuppresjon. Samlet sett antyder disse resultatene en modell der svulster og CAF-celler utskiller MNA i ekstracellulær TME. Gjennom (i) TNF-indusert stimulering av eggstokkreftvekst og (ii) MNA-indusert hemming av cytotoksisk aktivitet fra T-celler, kan dette ha en dobbel tumoreffekt (figur 5D).
Konklusjonen er at denne studien, ved å anvende en kombinasjon av rask celleanrikning, enkeltcellesekvensering og metabolsk profilering, avdekket de enorme immunmetabolomiske forskjellene mellom svulster og ascitesceller hos pasienter med høycelleterror (HGSC). Denne omfattende analysen viste at det er forskjeller i glukoseopptak og mitokondriell aktivitet mellom T-celler, og identifiserte MNA som en ikke-cellebasert autonom immunregulerende metabolitt. Disse dataene har innvirkning på hvordan TME påvirker T-cellemetabolismen i kreft hos mennesker. Selv om direkte konkurranse om næringsstoffer mellom T-celler og kreftceller har blitt rapportert, kan metabolitter også fungere som indirekte regulatorer for å fremme tumorprogresjon og muligens undertrykke endogene immunresponser. En videre beskrivelse av den funksjonelle rollen til disse regulatoriske metabolittene kan åpne for alternative strategier for å forbedre antitumorimmunresponsen.
Pasientprøver og kliniske data ble innhentet gjennom BCs kreftsvulstvevsarkiv, sertifisert av Canadian Tissue Repository Network. I henhold til protokollen godkjent av BC Cancer Research Ethics Committee og University of British Columbia (H07-00463), ble alle pasientprøver og kliniske data innhentet informert skriftlig samtykke eller formelt frafalt sitt samtykke. Prøvene lagres i den sertifiserte biobanken (BRC-00290). Detaljerte pasientkarakteristikker er vist i tabell S1 og S5. For kryokonservering brukes en skalpell til å mekanisk dekomponere pasientens tumorprøve og deretter presse den gjennom et 100-mikron filter for å oppnå en enkeltcellesuspensjon. Pasientens ascites ble sentrifugert ved 1500 o/min i 10 minutter ved 4 °C for å pelletere cellene og fjerne supernatanten. Celler hentet fra tumor og ascites ble kryokonservert i 50 % varmeinaktivert humant AB-serum (Sigma-Aldrich), 40 % RPMI-1640 (Thermo Fisher Scientific) og 10 % dimetylsulfoksid. Disse konserverte enkeltcellesuspensjonene ble tint og brukt til metabolomikk og metabolittbestemmelse beskrevet nedenfor.
Det komplette mediet består av 0,22 μm filtrert 50:50 tilsatt RPMI 1640: AimV. RPMI 1640 + 2,05 mM l-glutamin (Thermo Fisher Scientific) tilsatt 10 % varmeinaktivert humant AB-serum (Sigma-Aldrich), 12,5 mM Hepes (Thermo Fisher Scientific), 2 mM l-glutamin (Thermo Fisher Scientific), 1 x penicillinstreptomycin (PenStrep)-løsning (Thermo Fisher Scientific) og 50 μMB merkaptoetanol. AimV (Invitrogen) er tilsatt 20 mM Hepes (Thermo Fisher Scientific) og 2 mM l-glutamin (Thermo Fisher Scientific). Flowcytometerets fargebuffer besto av 0,22 μm filtrert fosfatbufret saltvann (PBS; Invitrogen) tilsatt 3 % varmeinaktivert AB-humant serum (Sigma). Celleberikelsesbufferen består av 0,22 μm filtrert PBS og tilsatt 0,5 % varmeinaktivert humant AB-serum (Sigma-Aldrich).
I 37 °C komplett medium ble cellene farget med 10 nM MT DR og 100 μM 2-NBDG i 30 minutter. Deretter ble cellene farget med levedyktighetsfargestoffet eF506 ved 4 °C i 15 minutter. Resuspender cellene i FC Block (eBioscience) og Brilliant Stain Buffer (BD Biosciences), fortynn i flowcytometri-fargebuffer (i henhold til produsentens instruksjoner) og inkuber i 10 minutter ved romtemperatur. Farg cellene med et sett antistoffer (tabell S2) i flowcytometri-fargebuffer ved 4 °C i 20 minutter. Resuspender cellene i flowcytometri-fargebuffer (Cytek Aurora; 3L-16V-14B-8R-konfigurasjon) før analyse. Bruk SpectroFlo og FlowJo V10 til å analysere celletallsdata, og bruk GraphPad Prism 8 til å opprette dataene. Median fluorescensintensitet (MFI) for 2-NBDG og MT DR ble log-normalisert, og deretter ble en paret t-test brukt til statistisk analyse for å ta hensyn til samsvarende pasienter. Fjern alle populasjoner med færre enn 40 hendelser fra analysen; angi en MFI-verdi på 1 for eventuelle negative verdier før du utfører statistisk analyse og datavisualisering.
For å supplere den manuelle gatingstrategien i prosesspanelet ovenfor, brukte vi den fullstendige annoteringen fra formrestriksjonstreet (FAUST) (21) for automatisk å tilordne celler til populasjonen etter å ha eliminert døde celler i FlowJo. Vi administrerer manuelt utdataene for å slå sammen populasjoner som ser ut til å være feilallokert (kombinere PD1+ med PD1-tumorceller) og beholdte populasjoner. Hver prøve inneholder et gjennomsnitt på mer enn 2 % celler, for totalt 11 populasjoner.
Ficoll-gradientdensitetssentrifugering ble brukt til å separere PBMC fra leukocyttseparasjonsprodukter (STEMCELL Technologies). CD8+ T-celler ble isolert fra PBMC ved bruk av CD8 MicroBeads (Miltenyi) og ekspandert i komplett medium ved bruk av TransAct (Miltenyi) i 2 uker i henhold til produsentens instruksjoner. Cellene fikk stå i 5 dager i komplett medium som inneholdt IL-7 (10 ng/ml; PeproTech), og deretter restimulert med TransAct. På dag 7, i henhold til produsentens instruksjoner, ble humane CD45 MicroBeads (Miltenyi) brukt til å berike celler i tre påfølgende runder. Cellene ble alikvotert for flowcytometrianalyse (som beskrevet ovenfor), og én million celler ble alikvotert tre ganger for LC-MS/MS-analyse. Prøvene ble behandlet med LC-MS/MS som beskrevet nedenfor. Vi estimerte den manglende metabolittverdien med et ionetall på 1000. Hver prøve normaliseres med totalt ionetall (TIC), konverteres logaritmisk og normaliseres automatisk i MetaboAnalystR før analyse.
Enkeltcellesuspensjonen fra hver pasient ble tint og filtrert gjennom et 40 μm filter til komplett medium (som beskrevet ovenfor). I henhold til produsentens protokoll ble tre påfølgende runder med positiv seleksjon ved magnetisk kuleseparasjon ved bruk av MicroBeads (Miltenyi) brukt til å berike prøvene for CD8+-, CD4+- og CD45--celler (på is). Kort sagt blir cellene resuspendert i celleanrikningsbuffer (som beskrevet ovenfor) og telt. Cellene ble inkubert med humane CD8-kuler, humane CD4-kuler eller humane CD45-kuler (Miltenyi) ved 4 °C i 15 minutter, og deretter vasket med celleanrikningsbuffer. Prøven føres gjennom LS-kolonnen (Miltenyi), og de positive og negative fraksjonene samles opp. For å redusere varigheten og maksimere cellegjenopprettingstrinnet brukes CD8-fraksjonen deretter til den andre runden med CD4+-anrikning, og CD4-fraksjonen brukes til den påfølgende CD45-anrikningen. Hold løsningen på is gjennom hele separasjonsprosessen.
For å forberede prøver for metabolittanalyse ble cellene vasket én gang med iskald saltløsning, og 1 ml 80 % metanol ble tilsatt hver prøve, deretter virvles og hurtigfrosset i flytende nitrogen. Prøvene ble utsatt for tre fryse-tine-sykluser og sentrifugert ved 14 000 o/min i 15 minutter ved 4 °C. Supernatanten som inneholder metabolittene, fordampes til den er tørr. Metabolittene ble løst opp igjen i 50 μl 0,03 % maursyre, virvles for å blande, og deretter sentrifugert for å fjerne rusk.
Ekstraher metabolitter som beskrevet ovenfor. Overfør supernatanten til en høytrykksvæskekromatografiflaske for metabolomikkforskning. Bruk en tilfeldig behandlingsprotokoll for å behandle hver prøve med et lignende antall celler for å forhindre batcheffekter. Vi utførte en kvalitativ vurdering av globale metabolitter som tidligere er publisert på AB SCIEX QTRAP 5500 Triple Quadrupole Mass Spectrometer (50). Kromatografisk analyse og topparealintegrasjon ble utført ved hjelp av MultiQuant versjon 2.1-programvare (Applied Biosystems SCIEX).
Et ionantall på 1000 ble brukt til å estimere den manglende metabolittverdien, og TIC for hver prøve ble brukt til å beregne det normaliserte topparealet for hver detekterte metabolitt for å korrigere for endringer introdusert av den instrumentelle analysen fra prøveprosesseringen. Etter at TIC er normalisert, brukes MetaboAnalystR(51) (standardparameter) for logaritmisk konvertering og automatisk normlinjeskalering. Vi brukte PCA med vegan R-pakken for å utføre utforskende analyse av metabolomforskjeller mellom prøvetyper, og brukte delvis redundansanalyse for å analysere pasienter. Vi brukte Ward-metoden til å konstruere et varmekart-dendrogram for å gruppere den euklidske avstanden mellom prøvene. Vi brukte limma (52) på standardisert metabolittforekomst for å identifisere ulikt forekomst av metabolitter på tvers av hele celletypen og mikromiljøet. For å forenkle forklaringen bruker vi gruppegjennomsnittsparameteren for å spesifisere modellen, og betrakter celletypene i mikromiljøet som hver gruppe (n = 6 grupper); For signifikanstesten utførte vi tre gjentatte målinger for hver metabolitt. For å unngå falsk replikasjon ble pasienten inkludert som et hinder i limmadesignet. For å sjekke forskjellene i metabolitter mellom ulike pasienter, justerte vi limmamodellen slik at den inkluderte pasienter på en fast måte. Vi rapporterer signifikansen av den forhåndsspesifiserte kontrasten mellom celletypen og mikromiljøet til Padj <0,05 (Benjamini-Hochberg-korreksjon).
Etter vigorberikelse ved bruk av Miltenyi Dead Cell Removal Kit (>80 % levedyktighet), ble enkeltcelletranskriptomsekvensering utført på de totale levende, frosne ascites- og tumorprøvene ved bruk av en 10x 5'-genekspresjonsprotokoll. Fem tilfeller med matchende tumorer og ascites ble analysert, selv om den lave levedyktigheten fra én tumorprøve forhindret inkludering. For å oppnå flere pasientutvelgelser, kombinerte vi prøvene fra hver pasient i banene til 10x kromkontrolleren, og analyserte ascites- og tumorstedene separat. Etter sekvensering [Illumina HiSeq 4000 28×98 bp paret ende (PE), Quebec-genom; et gjennomsnitt på 73 488 og 41 378 avlesninger per celle for henholdsvis tumor og ascites]], brukte vi CellSNP og Vireo (53) (basert på CellSNP som Den vanlige humane SNP (VCF) levert av GRCh38 er tilordnet en donoridentitet. Vi bruker SNPRelate for å utlede den nærmeste identiteten (IBS) til pasientens genotypestatus (IBS), ekskludert ikke-tilordnede celler og celler identifisert som duplekser og matchende donorer mellom ascites- og tumorprøver (54). På grunnlag av denne oppgaven beholdt vi tre tilfeller med rikelig cellerepresentasjon i tumor og ascites for nedstrømsanalyse. Etter å ha utført et massefiltreringstrinn i scater (55) og scran (56) BioConductor-pakkingen, ga dette 6975 celler (2792 og 4183 celler fra henholdsvis tumor og ascites) for analyse. Vi bruker igraphs (57) Louvain-klynging av delt nærmeste nabo-nettverk (SNN) basert på Jaccard-avstand til klyngeceller etter uttrykk. Klynger ble manuelt annotert til antatte celletyper basert på markørgenuttrykk og visualisert med t-SNE. Cytotoksiske T-celler er definert av uttrykket av CD8A og GZMA, unntatt subklynger med lav ribosomal proteinuttrykk. Vi tilgang til publiserte data fra Izar et al. (16), inkludert deres t-SNE-innlemming, som kan kontrollere uttrykksoverlappingen mellom immuncellemarkører og NNMT-uttrykk.
PBMC ble separert fra leukocyttseparasjonsprodukter (STEMCELL Technologies) ved Ficoll gradientdensitetssentrifugering. CD3+-celler ble isolert fra PBMC ved bruk av CD3-kuler (Miltenyi). Med eller uten MNA ble CD3+-celler aktivert med platebundet CD3 (5 μg/ml), løselig CD28 (3 μg/ml) og IL-2 (300 U/ml; Proleukin). På den siste dagen av ekspansjonen ble levedyktigheten (Fixable Viability Dye eFluor450, eBioscience) og proliferasjonen (123count eBeads, Thermo Fisher Scientific) evaluert ved hjelp av flowcytometri. Evaluer effektorfunksjonen ved å stimulere celler med PMA (20 ng/ml) og ionomycin (1μg/ml) med GolgiStop i 4 timer, og overvåk CD8-PerCP (RPA-T8, BioLegend), CD4-AF700 (RPA-T4), BioLegend) og TNFα-fluoresceinisotiocyanat (FITC) (MAb11, BD). Stimuler qPCR- og ChIP-celler med PMA (20 ng/ml) og ionomycin (1μg/ml) i 4 timer. ELISA-supernatanten ble samlet før og etter stimulering med PMA (20 ng/ml) og ionomycin (1 μg/ml) i 4 timer.
Følg produsentens protokoll for å isolere RNA ved hjelp av RNeasy Plus Mini Kit (QIAGEN). Bruk QIAshredder (QIAGEN) til å homogenisere prøven. Bruk et høykapasitets RNA til cDNA-sett (Thermo Fisher Scientific) til å syntetisere komplementært DNA (cDNA). Bruk TaqMan Rapid Advanced Master Mix (Thermo Fisher Scientific) til å kvantifisere genuttrykk (i henhold til produsentens protokoll) med følgende prober: Hs00196287_m1 (NNMT), Hs00154079_m1 (AOX1), Hs00427552_m1 (SLC22A1), Hs02786624_g1 [glyceraldehyd-3-fosfat av hydrogen (GAPDH)] og Hs01010726_m1 (SLC22A2). Prøvene ble kjørt på StepOnePlus sanntids-PCR-system (Applied Biosystems) (Applied Biosystems) i MicroAmp fast optical 96-brønns reaksjonsplate (Applied Biosystems) med MicroAmp optisk film. Enhver Ct-verdi som overstiger 35 anses å være over deteksjonsterskelen og er merket som ikke-detekterbar.
Utfør ChIP som tidligere beskrevet (58). Kort fortalt ble cellene behandlet med formaldehyd (sluttkonsentrasjon 1,42 %) og inkubert ved romtemperatur i 10 minutter. Bruk tilsatt svellbuffer (25 mM Hepes, 1,5 mM MgCl2, 10 mM KCl og 0,1 % NP-40) på is i 10 minutter, og resuspender deretter i immunutfellingsbuffer som beskrevet (58). Prøven ble deretter sonikert med følgende sykluser: 10 sykluser (20 1-sekunds pulser) og en statisk tid på 40 sekunder. Inkuber ChIP-kvalitet immunoglobulin G (Cell Signaling Technology; 1 μl), histon H3 (Cell Signaling Technology; 3 μl), NFAT (Invitrogen; 3 μl) og SP1 (Cell Signaling Technology; 3 μl) antistoffer med prøven ved 4 °CC og rist over natten. Inkuber protein A-kuler (Thermo Fisher Scientific) med prøven ved 4 °C under forsiktig risting i 1 time, bruk deretter chelex-kuler (Bio-Rad) for å berike DNA-et, og bruk proteinase K (Thermo Fisher) for proteinfordøyelse. TNFα-promotoren ble detektert ved PCR: forward, GGG TAT CCT TGA TGC TTG TGT; derimot, GTG CCA ACA ACT GCC TTT ATA TG (207-bp produkt). Bildene ble produsert av Image Lab (Bio-Rad) og kvantifisert ved hjelp av ImageJ-programvare.
Cellekultursupernatanten ble samlet opp som beskrevet ovenfor. Bestemmelsen ble utført i henhold til produsentens prosedyrer for humant TNFα ELISA-sett (Invitrogen), humant IL-2 ELISA-sett (Invitrogen) og humant IFN-γ ELISA-sett (Abcam). I henhold til produsentens protokoll ble supernatanten fortynnet 1:100 for å detektere TNFα og IL-2, og 1:3 for å detektere IFN-γ. Bruk EnVision 2104 Multilabel Reader (PerkinElmer) for å måle absorbansen ved 450 nm.
PBMC ble separert fra leukocyttseparasjonsprodukter (STEMCELL Technologies) ved hjelp av Ficoll gradientdensitetssentrifugering. CD3+-celler ble isolert fra PBMC ved bruk av CD3-kuler (Miltenyi). Med eller uten MNA ble CD3+-celler aktivert med platebundet CD3 (5 μg/ml), løselig CD28 (3 μg/ml) og IL-2 (300 U/ml; Proleukin) i 3 dager. Etter 3 dager ble cellene samlet og vasket med 0,9 % saltvann, og pelleten ble hurtigfrosset. Celletelling ble utført ved hjelp av flowcytometri (Cytek Aurora; 3L-16V-14B-8R-konfigurasjon) ved bruk av 123count eBeads.
Ekstraher metabolitter som beskrevet ovenfor. Det tørkede ekstraktet ble rekonstituert ved en konsentrasjon på 4000 celleekvivalenter/μl. Analyser prøven ved reversfasekromatografi (1290 Infinity II, Agilent Technologies, Santa Clara, CA) og CORTECS T3-kolonne (2,1 × 150 mm, partikkelstørrelse 1,6 μm, porestørrelse 120 Å; #186008500, Waters). Polar massespektrometer (6470, Agilent), der elektrosprayionisering opererer i positiv modus. Mobil fase A er 0,1 % maursyre (i H2O), mobil fase B er 90 % acetonitril, 0,1 % maursyre. LC-gradienten er 0 til 2 minutter for 100 % A, 2 til 7,1 minutter for 99 % B og 7,1 til 8 minutter for 99 % B. Re-ekvilibrer deretter kolonnen med mobil fase A ved en strømningshastighet på 0,6 ml/min i 3 minutter. Strømningshastigheten er 0,4 ml/min, og kolonnekammeret varmes opp til 50 °C. Bruk MNAs rene kjemiske standard (M320995, Toronto Research Chemical Company, North York, Ontario, Canada) for å etablere retensjonstid (RT) og transformasjon (RT = 0,882 minutter, transformasjon 1 = 137→94,1, transformasjon 2 = 137→92, Konvertering 3 = 137→78). Når alle tre overgangene skjer ved riktig retensjonstid, brukes overgang 1 til kvantifisering for å sikre spesifisitet. Standardkurven til MNA (Toronto Research Chemical Company) ble generert ved seks seriefortynninger av stamløsningen (1 mg/ml) for å oppnå standarder på henholdsvis 0,1, 1,0, 10 og 100 ng/ml og 1,0 og 10 μg/ml væske. Deteksjonsgrensen er 1 ng/ml, og den lineære responsen er mellom 10 ng/ml og 10 μg/ml. Hver injeksjon av to mikroliter prøve og standard brukes til LC/MS-analyse, og en blandet kvalitetskontrollprøve kjøres hver åttende injeksjon for å sikre stabiliteten til analyseplattformen. MNA-responsene til alle MNA-behandlede celleprøver var innenfor analysens lineære område. Dataanalysen ble utført ved hjelp av MassHunter kvantitativ analyseprogramvare (v9.0, Agilent).
Andre generasjons αFR-CAR-konstruksjon ble hentet fra Song et al. (59). Kort sagt inneholder konstruksjonen følgende innhold: CD8a-ledersekvens, humant αFR-spesifikt enkeltkjedet variabelt fragment, CD8a-hengsel- og transmembranregion, CD27 intracellulært domene og CD3z intracellulært domene. Den komplette CAR-sekvensen ble syntetisert av GenScript og deretter klonet inn i andre generasjons lentivirale ekspresjonsvektor oppstrøms for GFP-ekspresjonskassetten som ble brukt til å evaluere transduksjonseffektiviteten.
Lentivirus produseres ved transfeksjon av HEK293T-celler [American Type Culture Collection (ATCC]; dyrket i Dulbeccos modifiserte Eagle-medium som inneholder 10 % føtalt bovint serum (FBS) og 1 % PenStrep, og brukt CAR-GFP-vektor, og pakkeplasmidene (psPAX2 og pMD2.G, Addgene) bruker lipofeksjonsamin (Sigma-Aldrich). Den virusholdige supernatanten ble samlet 48 og 72 timer etter transfeksjon, filtrert og konsentrert ved ultrasentrifugering. Oppbevar den konsentrerte virussupernatanten ved -80 °C inntil transduksjon.
PBMC separeres fra friske donor-leukocyttseparasjonsprodukter (STEMCELL Technologies) ved Ficoll-gradientdensitetssentrifugering. Bruk positiv seleksjon av CD8-mikrokuler (Miltenyi) for å isolere CD8+-celler fra PBMC. Stimuler T-celler med TransAct (Miltenyi) og i TexMACS-medium [Miltenyi; tilsatt 3 % varmeinaktivert humant serum, 1 % PenStrep og IL-2 (300 U/ml)]. Tjuefire timer etter stimulering ble T-celler transdusert med lentivirus (10 μl konsentrert virussupernatant per 106 celler). 1 til 3 dager etter transduksjon på Cytek Aurora (på FSC (Forward Scatter)/SSC (Side Scatter), Singlet, GFP+), evaluer GFP-ekspresjonen til cellene for å demonstrere en transduksjonseffektivitet på minst 30 %.
CAR-T-celler ble dyrket i 24 timer i Immunocult (STEMCELL Technologies; tilsatt 1 % PenStrep) under følgende betingelser: ubehandlet, behandlet med 250 μM adenosin eller 10 mM MNA. Etter forbehandling ble CAR-T-celler vasket med PBS og kombinert med 20 000 SK-OV-3-celler [ATCC; i McCoy 5A-medium (Sigma-Aldrich) tilsatt 10 % FBS og 1 % PenStrep ved 10: Effektor-til-mål-forholdet på 1 ble amplifisert i triplikat i tilsatt Immunocult-medium. SK-OV-3-celler og SK-OV-3-celler lysert med digitalis-saponin (0,5 mg/ml; Sigma-Aldrich) ble brukt som henholdsvis negative og positive kontroller. Etter 24 timer med samdyrking ble supernatanten samlet opp og laktatdehydrogenase (LDH) ble målt i henhold til produsentens instruksjoner (LDH Glo Cytotoxicity Assay Kit, Promega). LDH-supernatanten ble fortynnet 1:50 i LDH-buffer. Avlivningsprosenten ble målt ved hjelp av følgende formel: avlivningsprosent = korreksjonsprosent / maksimal avlivningsrate x 100 %, hvor korreksjonsprosent = samkultur av kun T-celler, og maksimal avlivningsrate = positiv kontroll - negativ kontroll.
Som beskrevet i teksten eller materialene og metodene, bruk GraphPad Prism 8, Microsoft Excel eller R v3.6.0 for statistisk analyse. Hvis flere prøver samles inn fra samme pasient (som ascites og tumor), bruker vi en paret t-test eller inkluderer pasienten som en tilfeldig effekt i en lineær eller generalisert modell etter behov. For metabolomikkanalyse utføres viktighetstesten i tre eksemplarer.
For tilleggsmateriale til denne artikkelen, se http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/7/4/eabe1174/DC1
Dette er en artikkel med åpen tilgang distribuert under vilkårene i Creative Commons Attribution-Non-Commercial License, som tillater bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, så lenge den endelige bruken ikke er for kommersiell vinning og forutsetningen er at det originale verket er korrekt. Referanse.
Merk: Vi ber deg bare om å oppgi e-postadressen din, slik at personen du anbefaler til siden vet at du vil at de skal se e-posten, og at den ikke er spam. Vi vil ikke registrere noen e-postadresser.
Dette spørsmålet brukes til å teste om du er en besøkende og forhindre automatisk spaminnsending.
Marisa K. Kilgour (Marisa K. Kilgour), Sarah MacPherson (Sarah MacPherson), Lauren G. Zacharias (Lauren G. Zacharias), Abigail Eli Aris G. Watson (H. Watson), John Stagg (John Stagg), Brad H. Nelson (Brad H. Nelson), Ralph J. De Bellardini (Ralph. G. Jones), Russell G. Jones (Ralph J. Jones), Russell G. Jones. Phineas T. Hamilton (Phineas T.
MNA bidrar til immunsuppresjon av T-celler og representerer et potensielt immunterapimål for behandling av kreft hos mennesker.
Marisa K. Kilgour (Marisa K. Kilgour), Sarah MacPherson (Sarah MacPherson), Lauren G. Zacharias (Lauren G. Zacharias), Abigail Eli Aris G. Watson (H. Watson), John Stagg (John Stagg), Brad H. Nelson (Brad H. Nelson), Ralph J. De Bellardini (Ralph. G. Jones), Russell G. Jones (Ralph J. Jones), Russell G. Jones. Phineas T. Hamilton (Phineas T.
MNA bidrar til immunsuppresjon av T-celler og representerer et potensielt immunterapimål for behandling av kreft hos mennesker.
©2021 American Association for the Advancement of Science. alle rettigheter forbeholdt. AAAS er partner av HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef og COUNTER. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.